Summary
이 프로토콜 수 있습니다 격리 하 고 특성화 연구원 조직 상주 다양 한 세포 특징 염증된 조직 변화 무질서의 다이어트 유발 모델에서 추출.
Abstract
비만 크게 조직 상주 세포 monocyte 파생 된 대 식 세포에 의해 중재 만성 염증 상태를 촉진 합니다. 다이어트 유발 된 비만 (DIO)는 대 식 세포가;의 역할을 공부 하 고 귀중 한 모델 그러나, 적절 한 대 식 세포 격리는 염증된 조직에서 취득 하기 어렵다. 이 프로토콜에서 우리는 격리 단계와 높은 지방 (HFD) 또는 높은 콜레스테롤 높은 지방 (18 주 다음 쥐에서 조직 상주 대 식 세포의 적당 한 인구를 얻기 위한 우리의 연구에서 파생 된 필요한 문제 해결 지침 개요 HFHCD) 규정식 내정간섭입니다. 이 프로토콜은 비만 동맥 경화는 간, 대동맥, 흰색 adipose 조직 (WAT) 등에서 공부 하는 3 각 인 조직에 초점을 맞추고. 우리가 어떻게 dualistic 사용 강조 흐름의 cytometry 격리의 새로운 차원과 조직 상주 대 식 세포의 특성을 얻을 수 있습니다. 이 프로토콜의 기본 섹션에서는 기본 조직 관련 효소 소화 및 대 식 세포 격리, 이후 세포 표면 항 체 얼룩이 흐름 cytometric 분석에 대 한 복잡 한 합니다. 이 프로토콜 기존의 복잡 한 형광 활성화 된 세포 (FACS) 정렬 기본 해결 하 고 적절 하 게 정렬 된 세포 인구에서 광범위 한 특성을 얻을 수 있도록 이러한 복잡성을 설명 제공. 대체 농축 방법 FACS 작업할 때 유연성 및 시간 관리에 대 한 수 있도록 밀도 간 같은 셀 정렬에 대 한 포함 되어 있습니다. 간단히,이 프로토콜 macrophage 다양 한 주어진된 연구에서 염증된 조직에서에서이 평가 하는 연구를 보조 하 고 유리한 세포 분리 및 특성에 대 한 성공적인 통찰력 있는 문제 해결 팁을 제공 합니다. DIO 중재 염증에서 면역 세포.
Introduction
마우스 모델 인간의 질병의 역학 연구를 광범위 하 게 사용 되었습니다. 병에 걸린 상태에서 쥐에서 조직 거주 세포의 적절 한 절연1질병 병 인에 분자와 세포질 기여를 이해 하기 위한 플랫폼을 제공할 수 있습니다. 중요 한 중요 한 장애는 비만 이다. 비만의 발생률 인슐린 저항을 가진 동시에 전세계 상승 입력 2 당뇨병, 심혈 관 질환, 지방 간 질환2,3계속 됩니다. 과도 한 영양소 소비는 더4대동맥과 간 등 다른 주변 조직 세포 주위를 변경할 수 있습니다 지방 조직에서 나오는 변경된 신호 트리거링 줄된 신체 활동에 의해 비뚤어진 다. 같은 변화 항상성 장애 만성 낮은 학년 조직의 염증5발생합니다.
흰색 adipose 조직 (WAT)을 그들의 신규 모집 뿐만 아니라 대동맥 및 간 거주 대 식 세포의 클래식 활성화 뿐만 아니라 신진 대사 신호 dysregulation를 시작 하지만 염증6,7유지 표시 되었습니다. 대 식 세포의 phenotypic와 기능적인이 질은 비만의 병에 강하게 연관 공동 morbidities7관련. 대 식 세포 분극에 동적 소성 전시 진행 협조 하는 활성화 된 고기의 범위와 염증8의 해상도를이 셀에 대 한 수 있습니다. 고전적인 활성화 (M1) 세포는 염증의 전파에 연루는, 하는 동안 또는 활성화 (M2) 세포 해상도 조직 수리9,10와 연결 되었습니다.
으로 신체 대사 스트레스를 겪 습, 백색 지방 조직 비정상적으로 축적. 확장 된 지방 조직 매력과 뿌리깊은 인슐린 저항, 혈당 및 궁극적으로 2 형 당뇨병, 인슐린 저항 또는 혈당11, 홍보 일반 체형 기능을 변경 하는 염증 성 세포 유지 12. 동시에 발표 하는 염증 성 신호에 응답 개장 한다 백색 지방 조직 침투 고전적인 활성화 (M1) 지방 조직 대 식 세포 (Atm)13,14. 이 멀티 셀룰러 기관 간4대동맥 등 다른 신체 기관의 정상적인 기능 derails 신호 폭포를 발휘 한다.
간 근처 dysregulated 와트15에서 발생 하는 자극에 적응 하는 신진 대사 강국 이다. 간 세포 또는 Kupffer 세포 신진 대사 변화에 대응 parenchymal 모두 변환 하는 선 동적인 cytokines 및 비 parenchymal 세포 표현 형을 분 비 하 고 조직 리 모델링 추진. 간 장의 지질 축적, 염증, 과도 한 세포 외 기질 예금, 괴 사 및 간 손상의 넓은 스펙트럼에 기여 하는 염증 성 모욕 비 알코올 지방산 간 질환 와 관련 된 최종 기능 손실 다음과 16,,1718.
손상 된 와트와 간 기능에 병렬로 큰 동맥 시체는 만성 대사 스트레스19를 겪 습으로 동맥 벽 내 지질 축적. 내 피 세포를 활성화 하 여 발산의 분 비 및 monocytes20의 후속 모집 동맥 지질 축적을 트리거합니다. 일단 채용, monocytes 증식, 분화, 단백질을 섭취 하 고 거품 세포가. Atherogenesis를 시작 하 고 프로-염증 성 활동의 지속적인 채용 및 조직 거주 지질 라덴 대 식 세포. 이 atherogenic microenvironment에 릴레이 extracellular와 세포 스트레스 신호에 굴복, 이러한 세포는 다음는 apoptotic 신호 폭포에에서 종사. 이 거품 세포는 죽지로 그들은 그들의 지질 가득 괴 사 성 병 변, 다음 플 라크 파열, 심근 경색과 뇌졸중에 이르게 핵심 내용을 기여.
대 식 세포 고기의이 부분에 와트, 간 등 대동맥8,21dysregulated 조직에 염증 성 변화에 의해 유도 된 비만 총괄. 채용 그리고 조직 상주 대 식 세포 대 식 세포 표현 형1를 조작 하는 잠재적인 분자 표적에 대 한 통찰력을 제공할 수 있다. 효과적으로 비만 유발 염증된 조직에서 세포 특성, 단일 세포 현 탁 액은 효소 소화를 통해 얻어질 수 있다. 이러한 분리 프로토콜 충분히 결합 조직 면역 세포 죽음을 최소화 하 고 최적의 셀 수익률을 제공 하는 동안 저하에 효과적 이어야 합니다. 효소 혼합 조직 및 그것의 구조상 메이크업의 종류에 따라 달라 집니다. 대동맥 등 탄력적인 조직 간와 와트, 조직 분리를 달성 하기 위해 강력한 효소 활동을 요구 한다. 단일 세포 현 탁 액에서 조직 주민 대 식 세포 수 명확 하 게 특징 또는 transcriptional 프로 파일링 같은 추가 다운스트림 분석에 대 한 격리.
여기는 조직 관련 프로토콜 설명 하는 콜라-종속 조직 소화와 색채 cytometry 효과적으로 분리 하 고 유도 하는 전통적인 다이어트 비만에서 얻은 조직 상주 세포 특성화를 사용 하 동맥 경화 증, 간단한 steatosis 및 steatohepatitis 마우스 모델입니다. 백혈구-(CD45 또는 CD11b)와 대 식 세포-에 대 한 항 체와 세포 표면 마커 얼룩 동시 (f 4/80) 특정 항 원 자주 사용 한다 대 식 세포 인구22식별 하. 형광 활성화 셀 정렬 (FACS) 고 순도에서 이러한 확인 된 인구를 정렬 하는 데 사용 하는 강력한 전략 이다. 정렬 된 인구 다음 형 특정 유전자 프로 파일 (예: 정량 실시간 중 합 효소 연쇄 반응) 다운스트림 분자 분석23을 사용 하 여 평가할 수 있습니다. 표준 cytometry와 교류 cytometry 기반 세포 분류는 크게 다른 유형의 세포 현 탁 액 내에서 세포를 구별에 강력한 도구, 비록 전 프로토콜 성공적인 출력 되도록 낙관 되어야 한다. 이 연구에서는 프로토콜을 효과적으로 분리 하 고 가능한 조직의 특정 세포 특성화 설명; 더 중요 한 것은,이 연구는 사전 및 문제 해결 전략을 방지 또는 해결 뿐만 아니라 자주 발생 하는 기술적인 문제에 대 한 중요 한 통찰력을 제공 합니다.
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Protocol
모든 실험 프로토콜 (섹션 1, 1.2, 1.3) 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 펜실베니아 주립 대학에 의해 승인 되었다.
| 조직 | 분리 버퍼 준비 | 마지막 볼륨 | 스토리지 |
| 흰색 Adipose 조직 (WAT) | 분리 버퍼: 2.5 %HEPES, 10 mg/mL 소 혈 청 알 부 민 (BSA), 3 mg/mL (0.3%) 콜라 유형 II에 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) L-글루타민, 나트륨 pyruvate 없이 포도 당 4.5 g/L와 | 500 mL | 80-° C (10 mL aliquots) |
| 간 | 관류 버퍼 집중 (PBC) x 25: 3.55 M NaCl, 168 m KCl, m 240 mM HEPES, 150 m m NaOH에 증 류 이온된 H2O | 500 mL | 20-° C (40 mL aliquots) |
| 관류 버퍼 x 1에서 보존 버퍼 (PRB): 1% BSA | 1 L | 4 ° C | |
| 관류 버퍼 x 분리 버퍼: 1 4.76 m m CaCl2 와 72 U/mL 콜라 종류 IV 보충 | (마우스) 당 50 mL | 준비 사용 직전 | |
| 대동맥 | 분리 버퍼: 125 U/mL 콜라 유형 사이, 60 U/mL Hyaluronidase 유형 I 60 U/mL DNase I, 450 U/mL 콜라 유형 I, 20 mM HEPES 인산 Buffered 식 염 수 (PBS) x 1 | 500 mL | 80-° C (10 mL aliquots) |
표 1: 조직의 특정 관류 버퍼 조리법입니다.
1. 조직 분리 및 분리
- 와트 격리 및 분리
- 표 1, 당 조직-특정 버퍼를 준비 하 고 설명 하는 대로 그들을 저장.
- 다음과 같은 시 약을 준비 합니다.
- 여 사용까지 와트 분리 버퍼 및 상점 4 ° C에서의 적절 한 볼륨을 녹고 소화 버퍼를 준비 합니다. 즉시 사용 하기 전에, 따뜻한 버퍼 37 ° c 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 2% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)에 포함 된 x 1을 준비 하 여 FACS 버퍼를 준비 합니다.
- 와트 절연
- 채워진 이산화탄소 (CO2) 마우스 챔버 안락사 해 부 단계에 계속 하기 전에 효과를 확인 합니다.
- 70% 에탄올까지 철저 하 게 젖 었 고 에탄올으로 코팅을 포함 하는 비 커에 짧게 안락사 마우스를 찍어. 마우스 복 부 표면 위로 해 부 단계에 놓고 앞 마우스와 21 G 바늘을 사용 하 여 해 부 보드에 뒷 발을 고정 합니다.
- 중간 포인트 팁 집게를 사용 하 여 요도 개통 앞쪽 복 부 피부를 파악 다음 잡지 복 부 피부에는 닉을 해 날카로운가 위를 사용 합니다.
- 피부와 복 막 사이 작은 절 개를가 위의 낮은 블레이드를 삽입 하 고 흉 곽을 복 부에서 측면 절 개 하 게.
- 부드럽게 피부를 그대로 복 막 구멍을 노출 하 고 측면 절 개를 통해 복 막 및 중 접어 다시 투명 한 막 또는 조직을 노출 복 와트를 소비 세를 뒤로 잡아 당기십시오.
- 만 그 외 에 설명 된 대로 perigonadal 지방 패드를 수집 24
- 남자 쥐에서 perigonadal 지방 패드 느슨하게 epididymis와 고환에 바인딩됩니다. 먼저 testes를 찾습니다 및 다음 중간 지점 집게, epididymis 머리의 잡고 부드럽게 당겨.
- 날카로운 해가 위를 사용 하 여 각 epididymal 지방 패드 epididymis (머리, 몸, 꼬리) 및 testes의 표면 따라 절단 하 여 소비 세.
- 겸 자와 함께 부드럽게 당겨 지방 패드에 결합 조직 통해 직접 epididymis 구조에 반면.
- 집게를 사용 하 여 단단히 지방 패드는 epididymis 근의 끝을 부드럽게 껍질은 생식 기에서 뚱뚱한 패드
- 여성 쥐에 perigonadal 지방 패드는 채권 자 궁 몸과 자 궁 경적을 느슨하게.
- 중간 포인트 집게를 사용 하 여 perigonadal 살 찐 티슈를 살짝 당겨 자 궁 체와 자 궁 경적 조직.
- 자 궁 체와 자 궁 경적 해 날카로운가 위를 사용 하 여 절단 하 여 각 지방 패드를 삭제할.
- PBS로 가득 촉촉한 조직 유지 하는 얼음에 계속 지방 패드 페 트리 접시에 놓습니다.
- 단일 셀 정지에 와트의 분리
- 페 트리 접시에서 초과 PBS를 제거 하 고 단일에 지 면도날을 사용 하 여 작은 조각으로 복 부 와트를 말하다.
- 면도날의 날카로운 가장자리, 부드럽게 2 mL 와트 분리 버퍼를 포함 하는 레이블이 15 mL 폴 리 프로필 렌 컬렉션 튜브로 다진된 복 와트를 다쳤어요.
- 45 분 동안 37 ° C에서 느린 연속 회전에서이 조직을 소화 버퍼 혼합물을 품 어.
- 원형 운동에 고무 피스톤 주사기 플런저의 이동 하는 동안 50 mL 수집 관으로 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 소화 조직 필터 및 필터를 통해 세포 현 탁 액을 체에 계속.
- Dulbecco의 2 개 mL를 피펫으로 수정이 글 중간 (DMEM) 15 mL 컬렉션 튜브, 부드럽게 피펫으로를 아래로 그리고 단일 셀 서 스 펜 션 필터를 세척.
- 차가운 DMEM과 두 개의 추가 시간 필터를 세척 하 고 얼음에 단일 세포 현 탁 액 배치.
- 8 분 4 ° C에서 300 x g에 세포 현 탁 액 원심
- 진공 흡 인기를 사용 하 여 (첫 번째) 부동 adipocytes를 조심 스럽게 제거 하 고 표면에 뜨는 나머지. 수송과 stromal 혈관 분수 (SVF)를 방해 하지 않도록 확인 합니다.
- 사용 1000 µ L 피 펫, 부드럽게 다시 일시 중단 펠 릿 lyse 제조업체의 지침에 따라 적혈구를 염화 암모늄-칼륨 (ACK) 버퍼.
- DMEM와 위의 세포 현 탁 액을 희석 하 고 8 분 4 ° C에서 300 g에 세포 현 탁 액을 원심.
- 다시 차가운 PBS 2% 포함 된 셀을 일시 중단 FBS (FACS 버퍼)와 Burker 챔버/hemocytometer에 셀.
- 분류 5 mL 라운드-하단 폴리스 티 렌 튜브 (기본적인 cytometry)에 대 한 1 x 106 셀 또는 전체 세포 현 탁 액 (FACS)에 대 한 전송. Cytometry 얼룩 프로토콜에 대 한 섹션 2로 계속.
- 간 조직 분리 및 분리
참고:이 프로토콜 Smedsrød25에서 적응 시켰다.- 표 1 에 의하여 조직 전용 버퍼를 준비 하 고 설명 하는 대로 그들을 저장.
- 다음과 같은 시 약을 준비 합니다.
- 관류 버퍼 (PB), diluting 40 mL PBC의 960 mL 초순 H2o. 사전 따뜻한 주사기에 의해 가득 37 ° C에서의 PB 50 mL 관류 시작 하기 전에 단지 1 x 준비. 현재 모든 기포를 제거 합니다.
- 기포를 제거 하려면의 잠금 팁을 위쪽으로 가리키는 주사기 반전. 누르거나까지 기포 최고 pf에 주사기 주사기를 터치 합니다. 공기를 추방 하는 플런저에 부드럽게 밀어
- 476 밀리미터 CaCl2 솔루션의 0.5 mL를 diluting 하 여 소화 버퍼를 준비관류 버퍼 x 49.5 ml 1. 4.76 m m CaCl2 -PB 솔루션 콜라 유형 IV의 3600U를 추가 합니다. 미리 관류 시작 하기 바로 전에 37 ° C에서 소화 버퍼의 50 mL 가득 주사기 따뜻한. 1.2.2.1.1 단계에서 설명한 대로 모든 현재 공기 거품을 제거 합니다.
- 250 mL 1 x 관류 버퍼에 2.5 g 소 혈 청 알 부 민 (BSA)를 용 해 하 여 보존 버퍼 (PRB)를 준비 합니다. 4 ° C에서 저장 또는 사용까지 얼음에 계속.
- 1 x PBS와 2 %FBS FACS 버퍼를 준비 합니다.
- 관류 버퍼 (PB), diluting 40 mL PBC의 960 mL 초순 H2o. 사전 따뜻한 주사기에 의해 가득 37 ° C에서의 PB 50 mL 관류 시작 하기 전에 단지 1 x 준비. 현재 모든 기포를 제거 합니다.
- 간 조직 분리
- CO2 질 식 하 여 마우스를 안락사, 모피와 intraabdominal 장기의 오염을 방지 하기 위해 70% 에탄올과 마우스를 포화.
- 위치는 폴리스 티 렌에 위로 마우스 복 부 측 거품 보드를 해 부하 고 마우스 앞과 뒷 안전 21 G 바늘을 사용 하 여 해 부 보드 발.
- 흉 벽과 복 막 구멍을 노출, 중간 포인트 팁 집게를 사용 하 여 요도 개통 근처 복 부 피부를 파악. 다음 잡지 복 부 피부에 작은 절 개를 만드는 날카로운 해가 위를 사용 합니다.
- 피부와 복 막 사이 작은 절 개에는 위 낮은 블레이드를 삽입 하 고 턱을 사 타 구니에서 측면 절 개를 하 게.
- 부드럽게 피부를 그대로 복 막 구멍 흉 벽을 노출, 복을 통해 측면 절 개를 하 고 막 소비 세를 뒤로 잡아 당기십시오.
- 흉 골 하 고 신중 하 게 막 incise, 열 등 한 베 나 정 맥 (IVC)를 방해 하지 않도록 주의 하십시오. 위장 기관 쪽으로 이동 하 고 subhepatic IVC를 찾습니다. Hemostatic 집게를 사용 하 여 지역화 된 관류를 유지 하기 위해 IVC suprahepatic 클램프.
참고: 내장 백색 지방이 많은 직물의 과도 한 축적은 IVC 마스크 자주 수 있습니다. 이 배를 더 나은 시각화 하려면 지방 조직은 IVC 옆의 작은 지역 excised 수 있습니다. 고 지방 조직 내의 베인된 창 노출 cannulation 들어왔습니다 IVC 통해 다음 위치 수 있습니다. - 연결 주사기 23 G 혈액 수집 및 주입 세트를 미리 데워 PB로 가득 합니다. 플런저 밀어 부드럽게 튜브와 바늘 PB 가득 때까지.
- 23 G 바늘, 병렬 subhepatic IVC의 수준에 삽입 합니다. 4 cm hemostatic 클램프를 사용 하 여 장소에 바늘을 보호 합니다.
참고: Cannulation IVC는 IVC 좋을 수 있는 규정식 먹인 쥐에서 선호 되는 subhepatic의 시각 및 지방-채워진 캐비티 내 cannulated. - 부드럽게 관류를 시작 하는 플런저에 밀어, 색상 간에서 빠르게 플러시합니다 (오른쪽 엽 먼저) 바늘 선박에 적절 하 게 배치 하는 경우. 돌출부의 확대도 바늘 subhepatic IVC에 올바르게 삽입 하는 경우 표시 됩니다.
- 신속 하 게 잘라 PB 통해 자유롭게 흐름 수 있도록 문맥.
- Perfuse 간 혈액은 더 이상 표시 될 때까지. 때때로 부드럽게 앞 손가락 및 관류를 촉진 하기 위하여 손가락 사이 간 엽 마사지.
참고: 그것은 조직 손상을 방지 하기 위해 간 처리 하기 위해 톱니 비 무딘 상승된 도구를 사용 하는 것이 중요입니다. - PB의 5 mL 주사기 내 때, 미리 데워 진된 분리 버퍼 가득 주사기를 변경 합니다. 이 시간 동안 보안된 바늘의 위치를 방해 하지 마십시오.
참고: 확대 간을 크게 초과 1.5 g 성공적인 간 분리를 보장 하기 위해 미리 따뜻하게 소화 버퍼의 더 큰 볼륨으로 끼얹는다 한다. - 완전히 소화 될 때까지 간 perfuse 부드럽게 마사지 관류를 촉진 하기 위하여 간 엽.
참고: 실질 Glisson의 캡슐의 분리는 성공적으로 소화 간에서 관찰. 이 평가, 왼쪽된 측면 엽에 부드럽게 눌러, 집게의 쌍의 무딘 가장자리를 사용 합니다. 노출 표면에 표시 하 고 들여쓰기는 집게가 제거 되 면 천천히 작성 해야 합니다. - Subhepatic IVC에서 바늘을 제거 합니다. 클램핑 IVC suprahepatic hemostatic 집게를 제거 하지 마십시오.
- 전체 간 인 대 해 부가 위 짧은 스트레이트 블레이드를 사용 하 여 연결을 통해 신중 하 게 절단 하 여 소비 세 고 쓸 개를 제거 합니다.
- 전체 간 10 cm 배양 접시에 놓고 10 mL을 포함 된 차가운 보존 버퍼 및 상점 4 оC까지 준비가 셀 해방.
- 간 세포 분리
- 10 mL를 포함 하는 10 cm 접시 간 전송 차가운 DMEM.
- IVC 이빨된 집게를 사용 하 여 삭제 간 연결 절단된 suprahepatic을 잡습니다. 중간 포인트 집게를 사용 하 여 각 엽에 급속 한 쓰 다듬어 모션을 적용 하 여 Glisson의 캡슐에서 세포를 분리.
- 50 mL 수집 튜브에 부착 된 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 포화 DMEM을 전달 합니다.
- 피펫으로 10 mL 차가운 DMEM 10 cm 배양 접시 및 반복 단계 1.2.4.1에 1.2.4.3 미디어 채도 더 이상 관찰 때까지. 장소 세포 현 탁 액 또는 얼음에 4 ° c.에
- 부드럽게 컬렉션 튜브를 거꾸로 하 여 세포 현 탁 액을 혼합 하 고 4 ° c.에 2 분 54 x g에서 원심
- 깨끗 한 50 mL 수집 튜브에 상쾌한을 수집 합니다. 다음 4 ° c.에 2 분 54 x g에 세포 현 탁 액을 원심
- 단계 1.2.4.6 1.2.4.8 단계로 진행 하기 전에 두 개의 추가 번 반복 합니다.
- 깨끗 한 50 mL 수집 튜브는 상쾌한 전송 및 4 ° c.에서 10 분 동안 300 x g에 세포 현 탁 액을 원심
- FACS 버퍼에 다시 비 parenchymal 세포 pellet를 일시 중단 하 고 Burker 챔버/hemocytometer에서 그들을 계산.
- 전송 (기본 cytometry)에 대 한 1 x 106 세포 또는 15 x 106 -20 x 106 셀 (FACS)에 대 한 5 mL 라운드-하단 폴리스 티 렌 튜브를 표시. Cytometry 얼룩 프로토콜에 대 한 섹션 2로 계속.
- 대동맥 격리 및 분리
참고:이 프로토콜은 정육점에서 적응et al.26- 표 1 에서 제공 하는 조리법에 따라 조직 전용 버퍼를 준비 하 고 설명 하는 대로 그들을 저장.
- 다음과 같은 시 약을 준비 합니다.
- 여 사용까지 와트 분리 버퍼 및 상점 4 ° C에서의 적절 한 볼륨을 녹고 소화 버퍼를 준비 합니다. 즉시 사용 하기 전에, 따뜻한 버퍼 37 ° c
- 나트륨 소금 1 x 200 U/mL의 농도에서 PBS에 헤 파 린을 용 해 하 여 10 배 덤플링을 솔루션을 준비 합니다. 헤 파 린 준비 덤플링 솔루션 x 1 1 x PBS 재고 솔루션 x 10을 희석. 10 x 및 4 ° C에서 헤 파 린 솔루션 x 1 사용까지 저장 합니다.
- 2%를 포함 하는 1 x PBS와 FACS 버퍼 준비 FBS.
- 대동맥 해 부
- 이산화탄소 채워진 챔버에 70% 에탄올과 린스 마우스 안락사
- 마우스 복 부 측을 해 부 무대에서 마우스 앞 뒷 발을 확산 놓고 21 G 바늘을 사용 하 여 해 부 보드에 고정 합니다.
- 마우스, euthanizing 직후 심장 펑크를 수행 합니다. 필요한 경우 단계 1.3.3.4 1.3.3.9를 참조 하십시오.
- 흉 골의 아래쪽 끝에 칼 프로세스를 찾아
- 이렇게 동물의 목 너비를 따라 손가락 중간점을 배치 합니다. 흉 골의 꼬리 끝에 목에서 복 부 정중 선 따라 추적 연골 확장 느낌까지.
- 중간 포인트 집게를 사용 하 여 연골 확장명을 파악 하 고 필요한 경우의 머리 또는 피부 영역에 패치를 제거 하 여 칼 프로세스의 위치를 표시 합니다.
- 부분적으로 20-30 ° 각도로 칼 프로세스에서 26 G 바늘을 삽입 합니다.
- 부드럽게 천천히 철수는 플런저에 의해 주사기에 부정적인 압력을 적용 다음 혈액 흐름까지 더 바늘을 구멍에 삽입 합니다.
- 혈 중지, 천천히 회전 바늘 또는 약간에 이동 하 고 밖으로.
- 사용 요도 앞쪽 복 부 피부의 잡고 잡아 집게의 쌍, 그리고 해 날카로운가 위를 사용 하 여 턱을 사 타 구니에서 복 통과 복 부 정중 선 따라 잘라.
- 복 부 장기와 손가락으로 흉 곽을 피부를 뒤로 당겨 하거나 무딘 집게 부드럽게 측 복 부 장기를 이동 합니다.
- 집게를 잡아 칼 프로세스의 보유 사용 흉 골, 들어올린 막 incise.
- 양쪽에 옆 갈비뼈를 통해 컷 해가 위를 사용 하 여. 흉 골 댔 지, 흉 곽을 위쪽으로 뒤집기 하 고 연결 자료 통해 잘라. 기본 흉부 장기 노출 빗을 제거 합니다.
- 26-게이지 바늘 10 mL 주사기는 심장의 좌 심 실 (LV) 솔루션의 1-2 mL 주입 하 여 헤 파 린 솔루션 x 1으로 가득에 연결 된 대동맥을 perfuse.
참고: 대동맥 동맥 경 화성 병 변은 그대로 되도록 작은 압력으로 느린 속도로 perfuse 해야 합니다. - 삭제할 thymus, 폐 및 결합 조직. 필요한 경우 1.3.3.16, 1.3.3.17, 단계를 참조 하십시오.
- 심장 앞쪽 찾을 bi lobed 화이트 (또는 나비 모양) 오르간과 단단히 잡아 잡아는 집게와 thymus의. 구멍에서 모두 돌출부를 위쪽으로 당겨 하 고 기지에는 위로 잘라.
- 폐를 제거 하는 집게와 폐 엽을 공략 하 고 흉 강에서 조직을 당겨 기지에서 잘라. 각 나머지 엽에 대 한 반복 합니다.
- 해 부 현미경, 마이크로 해 부 도구, 및 수집 (포함 innominate 동맥, 좌 일반 경 동맥 및 왼쪽된 하 동맥)는 대동맥 아치 오름차순, 내림차순, 흉부 및 복 부 대동맥을 사용 합니다.
- 오름차순 대동맥을 심장의 좌 심 실에서 찾습니다.
- 곡선된 0.07 0.04 m m 팁 x의 쌍 집게는 부드럽게 좌 심 실에서 나오는 오름차순 대동맥의 부분 파악.
참고: 주변 노란색 띤 지방 조직에 비해, 대동맥 밝은 흰색 배 때 충분히 덤플링 솔루션 플러시 LV에서 발생 됩니다.- 대동맥은 제대로 플러시되지 심장 관류에 의해, 경우 플러시 대동맥 다시 대동맥 구멍에 연결 된 동안. 이렇게 하려면 심장 대동맥 접점 가까이 잘라 하 고 마음을 제거 하 고 복 부 대동맥의 낮은-엔드 통해 가로로 잘라. 오름차순 대동맥의 개통에서 26 G 바늘을 삽입 하 고 부드럽게 덤플링 솔루션 x 1 대동맥을 플러시.
- 부드럽게 더 나은 지방 조직 및 임베디드 대동맥 사이 차별을 오름차순 대동맥에 잡아당김.
- 오름차순 대동맥에 여전히 부드럽게 당기는, 닫힌된 봄 해 부가 위 끝 오름차순 대동맥 및 대동맥 아치를 캡슐화 하는 지방을 사용 하 여. 이렇게 하려면 연결 지방 떨어져 눈물 닫힌된 시저 블레이드 팁과 지방 조직 뇌졸중.
참고: 어떤 지방 조직까지 오름차순 대동맥 및 아치 명확 하 게 구상 될 수 있다 절단 하 여 절 개에서 후 렴. 이것은 대동맥을 절단 방지 하입니다. - 오름차순 대동맥 및 아치는 서라운드 뚱뚱한 조직에서 명확 하 게 delineated 될 수 있습니다, 만약 봄 해 부가 위를 사용 하 여 초과 지방 소비 세.
- 부드럽게 잡아 대동맥 아치는 집게로 잡으십시오. 지방의 슬리브의 오른쪽에 그렇게 할 봄이 위 팁, 복 부 대동맥의 꼬리 끝에 하강, 흉부 및 복 부 대동맥의 길이 따라 지방에 스트로크를 사용 하 여 다시.
- 찢 어 떨어져 지방 질 때 대동맥을 따라 파악을 계속 합니다. 대동맥의 손상을 방지 하기 위해 너무 부드럽게 할 해야 합니다.
- 지방 질은 이제 대동맥에 뒤에 배치 되도록 부드럽게 현미경으로 위쪽 대동맥을 당겨.
- 퉁 명 스럽게 연소 모션을 사용 하 여 심각한 하강 대동맥의 앞쪽 끝부분 지방 대동맥 인터페이스 사이 닫힌된 시저 블레이드 대동맥의 표면에 살 찐 티슈의 첨부 파일을 삽입 합니다.
참고: 철저 하 게 지방을 제거 하 고 조직을 연결 하는 대동맥 구멍 내는 것이 좋습니다. - 마음을 소비 세 그리고 transversely 복 부 대동맥의 꼬리 끝 잘라. 전체 대동맥을 제거 합니다.
- 35 mm 접시에는 대동맥을 놓고 두 21-게이지 바늘을 사용 하 여 대동맥에 모든 여분의 지방을 멀리 애타게. 얼음에 1.7 mL microcentrifuge 튜브에 삭제 대동맥을 놓습니다.
- 단일 셀 정지에 대동맥의 분리
- 피펫으로 0.2 mL 대동맥 대동맥을 포함 하는 튜브를 분리 버퍼입니다. 튜브의 테이퍼 끝으로 봄 시저 블레이드를 삽입 하 고 빠르게 효소 소화를 촉진 하기 위해 대동맥을 말하다.
- 15 mL 컬렉션 튜브와 피 펫 1.8 mL 대동맥 분리 버퍼 2 mL의 전체 볼륨에 대 한 조직 솔루션 혼합물을 전송 합니다.
참고: 조직 서 스 펜 션의 쉽게 전송 표준 1000 µ L 피 펫 팁의 테이퍼 끝 1cm 잘라. 단축된 팁을 사용 하 여 전송는 micropipette와 서 스 펜 션. - 다진된 대동맥 대동맥 분리 버퍼 220 rpm (0.514 x g) 떨고 37 ° C에 55 분을 품 어.
- 현 탁 액을 15 mL 폴 리 프로필 렌 컬렉션 튜브로 50 µ m 셀 여과기에 통과. 주사기의 플런저의 고무 피스톤을 사용 하 여 필터링을 촉진.
- 15 mL 컬렉션 튜브 1 mL FACS 버퍼와 린스, 정지를 수집 하 고 셀 여과기를 통과.
- 워시 50 µ m 셀 스 트레이너 1 mL FACS 버퍼와 함께 두 개의 추가 시간.
- 4 ° c.에서 5 분에 대 한 300 x g에서 원심 분리 하 여 세포를 작은 다시 차가운 FACS 버퍼에 셀을 일시 중단 합니다. Burker 챔버/hemocytometer 셀을 계산 합니다.
- (기본적인 cytometry)에 대 한 1 x 106 세포 또는 전체 세포 현 탁 액 (FACS)에 대 한 레이블된 5 mL 라운드-하단 폴리스 티 렌 튜브에 전송. Cytometry 얼룩 프로토콜에 대 한 섹션 2로 계속.
2. flow Cytometry 및 FACS 얼룩
| Fluorophore | R-Phycoerythrin (PE) | PE/Cyanine (Cy) 7 | PE/Cyanine (Cy) 5 | 태평양 파랑 (PB) |
| 레이저 (nm) | 블루 (488 nm) / 노란 (561-570 nm)-그린 (532 nm) | 블루 (488 nm) / 노란 (561-570 nm)-그린 (532 nm) | 블루 (488 nm) / 노란 (561-570 nm)-그린 (532 nm) | 바이올렛 (405 nm) |
| 여기맥스 (nm) | 496 | 496 | 496 | 401 |
| 방출최대 (nm) | 578 | 785 | 667 | 455 |
| Phenotypic 마커 | F4/80 | CD11c | CD11b | CD45 |
| EMR1, Ly71 | ΑX integrin integrin αX 체인, CR4, p150, ITGAX | ΑM integrin, 맥-1, Mo1, CR3, Ly-40, C3biR, ITGAM | T200, Ly-5, LCA | |
| 대상된 셀 유형 | 조직 주민 대 식 세포 | 고전적인 활성화 (M1) 대 식 세포 | Monocytes / 대 식 세포 | 백혈구 (대 식 세포 / monocytes, lymphocytes, 및 granulocytes) |
| 수지상 세포의 부분 집합 | 수지상 세포, NK 세포, 활성화 된 T 세포 및 장 intraepithelial 세포 (IEL)의 하위 집합 | Granulocytes, 수지상 세포, NK 세포와 T와 B 세포의 하위 집합 | ||
| 희석 비율 | 1:50 | 1: 100 | 1: 100 | 1: 100 |
| Isotype 컨트롤 | PE 쥐 IgG2a | PE/Cy7 아르메니아 햄스터 IgG | PE/Cy5 쥐 IgG2b | 퍼시픽 블루 쥐 IgG2c |
표 2: fluorophore의 목록 차별 조직 주민 대 식 세포에 대 한 항 체 관련 태그.
- 수집 하 고 다음 항목을 준비: FACS 버퍼 5 mL 라운드-하단 폴리스 티 렌 튜브, 반대로 마우스 CD16/32 Fc 수용 체 항 체를 차단, fluorophore 활용 또는 기본 항 체, fluorophore 활용 된 이차 항 체 (if 결합형 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 필요), 1.
참고: 많은 양의 세포를 얼룩이 지기에 대 한 항 체 농도 가장 중요 한 휴대폰 번호 보다. 예를 들어 경우 얼룩 10 x 106 세포 얼룩 버퍼 볼륨 및 항 체 농도 같아야 마치 얼룩 1.0 x 106 100 µ L 버퍼 볼륨에 세포. 1.0 x 10 얼룩8 셀, 5-fold 항 체 금액을 증가 것이 좋습니다. - 필요한 경우 각 FACS 튜브를 추가 차가운 FACS 버퍼를 추가, 5 분 (4 ° C) 751 x g에서 원심 분리 하 여 셀을 펠 렛. 표면에 뜨는 다음 원심 분리 발음
- 반대로 마우스 CD16/CD32 Fc 수용 체 차단 항 체 제조업체의 지침에 따라 모든 샘플에 추가 합니다. 4 ° C에서 또는 얼음에 15 분 동안 품 어.
- Fluorophore 활용 된 1 차적인 항 체 직접 Fc 수용 체 차단 항 체-포함 된 현 탁 액 셀을 품 어 칵테일 30 분 4 ° C에서 샘플링 fluorophore 활용 된 항 체의 표백을 최소화 하기 위해 빛에서 보호 샘플 추가 합니다.
- 2.4 단계 완료 후 다음이 단계를 수행, 이벤트 결합형된 기본 항 체 사용 되었다.
- 워시 1 차적인 항 체 5 분 (4 ° C) 751 x g에서 원심 분리에 의해 샘플이 스테인드.
- Decanting 여 상쾌한을 제거 하 고 다시 100 µ L FACS 버퍼에 펠 릿을 일시 중단 합니다.
- 모든 필요한 샘플을 활용된 2 차 항 체를 추가 하 고 4 ° c.에 30 분 동안 품 어 2.5 단계로 진행 합니다.
- 다음 항 체 외피, 얼음 차가운 FACS 버퍼의 2 개 mL를 추가 후 751 x g에서 셀 5 분 (4 ° C)에 대 한 작은. 상쾌한 가만히 따르다 고 펠 렛을 방해 하지 않도록 주의 하십시오.
- 세포를 부드럽게 섞어 다음 FACS 버퍼의 200-400 µ L로 다시 일시 중단 다음이 계속 어둠 속에서 4 ° C에서 표준 흐름 cytometry 분석 또는 세포 분류까지.
- 얼룩진된 셀의 단기 고정, 2.10에 단계 2.8 진행. 고정 표준 cytometry만 사용 합니다.
- 0.5 mL 2-4 %paraformaldehyde (PFA) 4 ° c.에서 15-30 분에 셀 중단 다시 바로 다음 단계 2.5
참고: 주의: PFA는 발암 및 독성 효과로 알려진된 자극. PFA를 사용할 때 주의 처리 합니다. 적절 한 개인 보호 장비를 사용 하 고 환기 배기를 해야 합니다. - 다음 고정 모든 샘플을 2 mL FACS 버퍼를 추가 하 여 셀을 세척 하 고 751 x g 5 분 제거 표면에 뜨는 다음 원심 분리에 대 한 4 ° c에서 원심.
- 얼음 차가운 FACS 버퍼 및 4 ° c.에 게 200 µ L에 고정된 셀 resuspend 저장소 수정 세포 4 ° C에서 최대 1 주, 이상적으로 autofluorescence를 최소화 하기 위해 48 시간 흐름 cytometry 수집 합니다.
- 교류 cytometer 제조업체의 지침에 따라 교류 cytometry 데이터를 취득 하거나 형광 활성화 된 세포 분류 Basu 외에 설명 된 대로 수행 합니다. 23
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Representative Results
18 주, 1 x 104 -2 × 104 CD45 (HCHFD 또는 HCD) 높은 지방 높은 콜레스테롤 다이어트 유지 apolipoprotein E 결핍 (ApoE 코) C57BL/6 (BL6) 마우스를 사용할 때++ F4/80 두 표본이 때 대동맥 세포 격리 될 수 있습니다 풀링된. ApoE 코 HFHCD 먹인 쥐에서 해 부 간은 5 x 105 정렬 Kupffer 세포 (사용 가능한 정렬 시간에 따라 달라 집니다) 보다 더 큰 생산. 먹 일 때 높은 지방 다이어트 (HFD)를 사용 하 여 야생 타입 (WT) C57BL/6 마우스, stromal 혈관 분수 (SVF)에서 5 x 105 1 x 106 거주 지방 조직 대 식 세포 (Atm)를 정렬할 수 있습니다. 대 식 세포는 특정된 조직에서 정렬할 수 있습니다 언급 한 총 수 정량 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (정량)를 사용 하 여 유전자 표정 분석을 수행 하기 위한 적절 한 했다. 대동맥, 같은 대 식 세포 인구의 적은 숫자 복구는 조직에 대 한 이러한 분석에 필요한 RNA를 분리 하는 때 공동 침 (예: glycogen)와 하룻밤 강 수를 사용 하는 것이 좋습니다.
여기, 다이어트 유발 대사 장애의 효과 기본 사용 하 여 대 식 세포 표현 형에 흐름 cytometry, 형광 활성화 된 세포 분류 (FACS), 다운스트림 게시물 정렬 분석 표시 됩니다. 이 발견 이전에 게시 관측 쥐 대동맥 (그림 1B) 등 영향을 받는 조직에 고전적인 활성화 (M1) 세포의 HFD 또는 HFHCD 전시 증가 침투를 먹이 확증. Cytometry, FACS, 및 유전자 식 프로 파일링의 활용 (정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량), 론 수용 체 티로신 키 니 아 제 표현 CD45 위한 predominating 표현 형을 통해+ + F4/80 대 식 세포에서 파생 된 규정식 먹인 쥐에서 분리 된 조직 관찰 되었다. 론 수용 체 표현 대동맥 대 식 세포는 항 염증 성 표현 형을 설명 하는 HFHCD 먹인 쥐 (그림 1 c 와 D) 감소 했다. 정렬 된 론 표현 하는 수용 체 세포 (그림 1E) 확고 M2 대 식 세포 마커 인 1 (Arg1) 유전자 발현 소화 aortas 시연된 증가 arginase에서 파생. 프로-염증 성 세포로 CD45 특징은+ + CD11c F4/80+ aortas HFHCD 먹인 쥐 (그림 1B와 D)에서 절연에 증가 했다. 론 수용 체를 표현 부분 모집단 (그림 2A)의 통용 형 해명 더 간 상주 세포 특성화. CD11c + 프로-염증 성 대 식 세포 인구 감소 식 Arg1 및 론 (그림 2B)와 같은 항 염증 제 (M2) 형와 강하게 연관 되는 유전자의 시연. 유사한 동향은 소화 흰색 adipose 조직 (그림 3)에서 고립 된 대 식 세포 인구에서 관찰 되었다. 프로-염증 성 서명으로 대 식 세포 인구 론 수용 체 (그림 3)의 감소 표면 표현을 했다. 결정적인 데이터를 더 론 수용 체 세포32대체 (M2) 활성화의 레 귤 레이 터로 확인 결과 결합 하 여 접근, 기본 cytometry 및 FACS. 이러한 바이어스는 항 염증 제 (M2) 형으로 개발 및 비만, 동맥 경화 및 steatohepatitis31의 진행에서 보호 역할을 보여줘 왔다.
그림 1: 천연된 대동맥에서 고립 된 세포의 ApoE 코 마우스는 HCD 18 주 동안 유지에서 제거. (A) 셀 CD45에 문이 먼저 했다+ 백혈구, 세포질 파편을 제외 하 고. (B) CD45 세포를 것으로 추정 두 배 긍정적인 인구를 나타내는 데 f 4/80와 함께에서 얼룩. CD11c의 비율을 보여 주기 위해 사용 되었다 추가 게이팅+CD45+F4/80+ (M1)와 (C) 론+CD45++ (잠재적인 M2) f 4/80에 쥐에서 파생 된 aortas에서 대 식 세포 먹이 일반 차 또는 18 주에 대 한 높은 콜레스테롤 다이어트. (D) CD11c의 비율을 증가+CD45+F4/80+ (M1)+F4/80+ (잠재적인 M2) 론+CD45의 감소 비율 뿐 아니라 대 식 세포, 대 식 세포는 aortas에서 관찰 되었다 쥐 쥐 먹이 정상적인 차 다이어트에 비해 HCD 먹이에서 파생 된. (E) 유전자 표정 분석 정렬된 론+CD45의+F4/80+ 세포 증가 표현의 arginase 시연 나 (잘 알려진 murine M2 표식). 값 < 0.05를 통계적으로 중요 한 고려 되었다 학생의 t-검정 분석 통계 분석 소프트웨어를 사용 하 여 수행 하 고 의미 ± SEM. P로 표시를 사용 하 여 가져온 (* P < 0.05, * * * P < 0.001). 그림 유 외 에서 수정 되었습니다. (2016) 31. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: ApoE 코 마우스는 HCD 18 주 동안 유지에서 해 부 유전자 사본 Kupffer 세포 인구에서 소화 간 정렬의 프로 파일링. (A) 특성화 및 Kupffer 세포 인구를 정렬에 대 한 일반적인 제어 체계. (B) 정렬 론 (Ron+) 표현 및 비-표현 (Ron-) CD45 유전자 표정 분석++ F4/80 양적 RT PCR에 의해 세포. 스튜던트 t-검정 분석 통계 소프트웨어를 사용 하 여 수행 하 고 값 ± SEM. P < 0.05를 통계적으로 중요 한 고려 되었다 의미를 표현 했다 (* P < 0.05, * * * P < 0.001). 그림 유 외 에서 수정 되었습니다. (2016) 31 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 특성의 Atm에서 WT BL6 마우스 해 부 백색 지방이 많은 직물에서 고립 된 18 주 동안 한 HFD 먹이. 특성화 및 지방 조직 정렬 (A) 일반적인 제어 방식 파생 된 대 식 세포 인구 CD45 내의 셀 (B) 비율의 론 +++CD11c F4/80- 및 CD45++CD11c F4/80+ 와트에서 정렬 하는 대 식 세포 인구. 그림 유 외 에서 수정 되었습니다. (2016) 31 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
아 테 롬, 간단한 steatosis steatohepatitis 공동 morbidities을 모방 하 고 제 2 형 당뇨병 다이어트 유발 대사 장애 모델 광범위 하 게 질병의 진행의 기본 분자 메커니즘을 더 잘 이해 하는 데 사용 됩니다. 콜라 종속 소화 자주 분열 조직의 세포 외 기질 (ECM)16,27에서 해방 하는 데 사용 됩니다. 콜라 같은 효소 콜라겐 세포를 이웃에 대 한 구조 지원을 제공 하는 중단. 조직 구조 구성 지시 조직 매트릭스 강성 (변형 저항) 그리고 원유 콜라 제품 성공적인 ECM 중단28보장에 가장 효율적입니다. 와트, "부드러운 매트릭스"의 구성 되는 자주 콜라 유형 ii 동시에 세포 표면의 인슐린 수용 체29의 무결성을 유지 하면서 해방 adipocytes와 주민 면역 세포를 소화 된다. 대동맥의 fibril 구성 요소 마이크로 추가 효소와 함께에서 (이 높은 콜라 활동) 콜라 종류 사이 효과적인 대동맥 소화 사용 "뻣 뻣 한 매트릭스"에 기여 한다. 대동맥, 달리 간 소화 행렬을 방해 하 고 가능한 parenchymal 및 비 parenchymal 세포30해방에 약한 효소 활동, 콜라 종류 IV는 콜라를 사용 합니다. 만성 염증된 조직에 적절 한 효소 소화를 방지할 수 있는 배경 종종 개장 받아야 C57BL6 마우스 다이어트 먹이 야생 타입 또는 apolipoprotein E 결핍 (ApoE 코)에서 파생. 이 섹션은 최소화 부적절 한 조직 분리 및 낮은 셀 복구의 가능성을 제거 하는 전략을 논의할 예정 이다.
비만, 동맥 경화, 또는 비 알코올 지방산 간 질환, 모방 다이어트 먹이 마우스 모델에서 파생 된 조직의 일반적인 기능은 비정상적인 조직 리 모델링 이다. 백색 지방 조직, 대동맥, 그리고 간, ECM 구성 변경, collagens 등 원 구성의 과도 한 증 착에서 자주 발생. 18 주 동안 높은 지방 다이어트에 유지 하는 야생 타입 C57BL6 마우스 확장된 백색 지방 조직 등 조직 관련 이상 경험 하 고 지방 (간단한 방증) 확대. 종종 이러한 대사 기능은 성가신 장애물을 조직 분리 과정에서 극복 되지 않습니다. 다른 한편으로, 거울 더 악화 고기 다른 다이어트 유발 모델에서 조직의 광범위 한 리 모델링 발생할 수 있습니다 문제가 조직 소화 하는 동안. ApoE 코 쥐를 먹이 하는 HFHCD에 사용 되는 모델 아 테 롬 및 steatohepatitis. 고급 steatohepatitis와 관련 된 일반적인 기능 간 (또는 섬유 증) ECM의 과도 한 증 착 이다. 거리 간 효소 조직 분리 하는 동안 꽤 문제가 될 표시 되었습니다 하 고 종종 낮은 셀 수율31를 생성 합니다. 셀 수율 개선, 소화 프로토콜 편차 없이 따라야 중요 하다. 정상적인 간은 다진 수 있으며 분리를 달성 하기 위해 소화 버퍼에 빠져들, 소화 버퍼와 관류 극대화 접촉 간 세포 외 매트릭스와 콜라 솔루션; 그리고 따라서이 방법은 것이 좋습니다. 또한, 소화 버퍼의 20-30 mL는 종종 정상적인 간;의 성공적인 분리에 대 한 적절 한 볼륨 그러나, 개발 확대 및 거리 간 마우스 모델에 관해서는, 소화 버퍼의 50 mL와 관류 세포 죽음을 최소화 하면서 적절 한 소화를 위해 선호 된다. 간을 크게 1.5 g을 초과 하는 무게와, 소화 버퍼의 볼륨을 증가 것이 좋습니다 성공적인 소화 되도록.
| 조직 | 문제 | 가능한 이유 | 솔루션 |
| 흰색 Adipose 조직 (WAT) | 불 쌍 한 세포 분리 | 불 쌍 한 소화 | 확인 소화 버퍼 37° C |
| 세포 죽음 | 과도 한 콜라 소화 | 소화 시간을 단축 | |
| 소화 버퍼의 볼륨을 감소 | |||
| 대동맥 | 불 쌍 한 세포 분리 | 불 쌍 한 소화 | 37 ° C에서 소화 버퍼 있는지 확인 |
| 대동맥 소화 버퍼에서 했다 너무 커서 | 대동맥 약 1 m m 조각으로 잘라 있는지 확인 | ||
| 대동맥 조각 인큐베이션 기간 동안 분리 버퍼에 떨고 하지 했다 | 대동맥 조각 소화 솔루션에 떨고는 반드시 | ||
| 세포 죽음 | 과도 한 콜라 소화 | 소화 시간을 단축 | |
| 소화 버퍼의 볼륨을 감소 | |||
| 간 | 불 쌍 한 세포 분리 | 불 쌍 한 소화 | 37 ° C에서 소화 버퍼 있는지 확인 |
| 소화 버퍼의 볼륨을 증가 | |||
| IVC (붓기 조직의 주변 IVC 발생)의 부적 절 한 cannulation | 바늘에는 IVC 올바르게 삽입 하십시오 | ||
| 파열된 IVC | 관류 이전 IVC에서 제대로 보안 바늘 | ||
| 관류 속도 감소 | |||
| 파열된 조직 | 관류 속도 감소 | ||
| 세포 죽음 | 잘못 된 릴리스 Glisson의 캡슐에서 셀의 | 반드시 캡슐을 사용 하 여 세포 분열을 쓰 다듬어 메서드는 이전에 논의 | |
| 과도 한 콜라 소화 | 소화 시간을 단축 | ||
| 소화 버퍼의 볼륨을 감소 |
표 3: 문제 해결 실패 조직 분리. Flow cytometry 기반 셀 정렬 또는 FACS 순도 필요 세포 인구를 고립 시키기를 위한 강력한 기술입니다. 셀 정렬 셀을 정화 때 달성 높은 셀 생산량 뿐만 아니라 고 순도 정렬 적절 한 정렬 전략을 사용 하 여 필요 합니다. 이 섹션에서는 멀티 fluorophore 개선을 위한 방법 cytometry 기반 셀 정렬 조직 거주 macrophage 규정식 먹인 쥐에서 파생 된 설명의 흐름. 별개 조직 상주 대 식 세포 분리, 표면 마커 선택은 중요 한 단계입니다. 종종 와트, 대동맥, 그리고 간은에서 파생 된 대 식 세포는 CD45를 사용 하 여 고유+, CD11b+, F4/80+ 게이팅 전략. 추가 흐름 cytometric 패널 조직 주민 대 식 세포를 식별 하기 위해 사용할 수 있습니다. 대 식 세포 특정 glycoproteins (CD64, CD68, 그리고 CD14) 중요 한 조직 적합성 복합물 (MHCII)의 표면 표현에 대 한 조사는 항 체를 포함 하는이 패널과 apoptotic 세포 티로신 키 니 아 제 수용 체 (MerTK)32, 33. 특정 대 식 세포 표현 형 M2의 선택적 표면 표현에 대 한 의해 delineated 다음 수 (CD163, CD209, 및 CD206) 또는 M1 마커 (CD38, CD40, CD80, 그리고 CD86)34,35. 지질-라덴 대 식 세포에 의해 생성 된 자동 형광 인구 게이팅 때 몇 가지 문제를 제시할 수 있습니다. 형광 노랑-녹색 레이저 (PE, PE/Cy5 PE/Cy7 등)에 의해 흥분 하는 태그로 항 체를 사용 하 여 또는 (와 같은 송출, APC Cy7) 빨간 레이저는 자동 형광 보다 훨씬 밝은 방출된 형광 고 따라서 향상 시킬 수 있습니다. 결과36. 같은 높은 착 색 인덱스 및 잠재적인 방출 스펙트럼 중복 변화 fluorophore를 선택 하는 경우 해당 컨트롤의 포함은 중요 합니다. 긍정/부정 인구의 묘사와 각각 1 차 항 체에 의해 발생 하는 일반적인 배경 신호 측정에 대 한 단일 얼룩 (SS) 컨트롤 및 isotype 컨트롤의 포함 허용 제어 경계를 식별 하는 경우 37. 세포가 부족 한 상황에 대 한 SS와 isotype 컨트롤에 대 한 보상 입자를 사용 하 여 것이 좋습니다. 보상 입자 일반적으로 생물 학적 컨트롤 보다 밝은 신호를 방출 하 고 또한 배경 형광에 있는 더 적은 편차. 또한, 마이너스 1 (FMO) 컨트롤 형광 제어 경계 묘사에 이상적입니다. FMO 컨트롤을 포함 하 여 얼룩 하위 집합에 대 한 예상 최대 형광은 형광 색소 태그 항 체는 특정 형광 채널에 대 한 특정 제외 된38때 주어진된 채널에 계시 된다. 단일 스테인드 보상 입자 컨트롤 뿐 아니라 우리의 경험에는 흠 없는 생물 학적 비교 컨트롤 더 정확한 긍정적인/부정적인 경계를 설정 하기 위한 포함 되어야 합니다.
세포질 파편 및 제어 전략에서 셀 집계 제외 자동 형광을 최소화 하는 데 사용 하는 추가 접근 이기도 합니다. 실행 가능한 세포 인구 세포 파편 구별, 앞으로 산포 (FSC) 및 측면 살포 (SSC)를 사용 하 여 가장 일반적인 제어 전략 이다. 게시물 정렬 분석에 사용 됩니다와 DNA/RNA 추출에 대 한 높은 가능성을 필요로 하는 셀에 대 한 격리, 그 생존 얼룩 사용 하지 고정 및/또는 permeabilization 절차 것이 좋습니다. 포름알데히드 셀의 고정 때문에 핵 산 단백질 가교 핵 산 무결성을 손상 하 고 따라서 격리 효율성, 검출 및 정확한 정량화를 제한할 수 있습니다. 셀 집계 하기 전에 언급 한 대로 내보낸된 자동 형광 신호를 기여할 수 있지만 또한 "우연의 일치 중단"에서. 정렬에서 고 순도 유지 하기 위해 이러한 작업이 발생 하지만 경우 너무 자주, 그것은 정렬된 셀 수확량 감소. 정렬 버퍼 (버퍼 FACS) 셀 얼룩 동안 DNAse 및 MgCl2 보충 셀 집계를 최소화할 수 있습니다. 그것은 그것은 효소의 활동을 억제로 함께 DNAse EDTA를 사용 하지 않는 것이 좋습니다. 정렬 전에 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 단일 세포 현 탁 액을 필터링 집계에서 셀 해방 또한 수 있습니다. 집계를 최소화 하기 위해 셀 정지 한다는 것 0.4 mL의 최소 볼륨에 mL 당 5 백만 셀의 농도에 주의 하는 것이 필수적입니다. 라덴 지질 조직에서 분리 된 셀 집계 하는 경향이 경향이 있고이 일치 될 수 있습니다 중단 되 고 낮은 정렬 항복. 집계 지속 되 면 샘플 희석 더는 것이 좋습니다. 정렬 된 대 식 세포 세포 복구를 최대화 하기 위해 태아 소 풍부한 매체를 포함 하는 폴 리 프로필 렌 라운드 하단 컬렉션 튜브에서 수집할 수 있습니다. 초기 높은 FBS 농도 농도 결국 각 정렬된 방울 희석 된다 이후 셀 복구를 보장 합니다. 수집 DNA 또는 RNA 분석에 사용할 수 있는 셀, 셀 (예: TriZol) RNAse 오염을 방지 하기 위해 적절 한 추출 시에 직접 정렬할 수 있습니다. 높은 볼륨을 정렬할 때 정렬 셀 처음 문화 미디어 FBS의 더 낮은 농도 가진 보충으로 것이 좋습니다. 바로 다음 정렬, 셀 다음 수송과 고 DNA/RNA 추출 lysed. 격리 된 유전 물질 변경된 유전자 발현에 대 한는 프로 파일링 될 수 있습니다. 프로-염증 성 유전자 등 TNFα, IL1-β, 일리노이-6, 일리노이-12, 1 L-23, IFNγ, Nos2, MCP1 (CCL2) upregulated 고전적인 활성화 (M1) 형39전시 세포에 많습니다. 다른 한편으로, 또는 활성화 (M2) 표현 형 세포에 종종 인코딩 Chi3l3 유전자의 유도 의해 표시 된다 (Ym1), Fizz1, Arginase 1, CD206, CD163, 10-CD209 1 L, 및 TGFβ34,40. 최근, CD38, Fpr2, 및 Gpr18 M1 관련 유전자 및 c-Myc Egr2 M2 특정 유전자34로 검증 되었습니다.
멀티 컬러 흐름 cytometry 기반 셀 정렬 순도에서 세포를 분리 하는 데 유용한 도구입니다,이 이렇게 비용이 많이 드는 될 수 있습니다. FACS 중재 정렬의 강력한 장점 셀 정렬 셀 정렬 유지 보수 시 약의 높은 비용 이외에 기동 수 작업 인원에 따라 달라 집니다. 다른 접근 방식의 대체 비용이 많이 드는 흐름 기반 cytometry 셀 정렬에 사용할 수 있습니다. 그들은 자석 활성화 된 셀 정렬 (맥) 또는 조밀도 기온 변화도 원심 분리를 포함 합니다. 정렬 방법 언급 한 첫 번째 대체 셀 포함 자석 또는 microbead 열 절연 키트 혈액 또는 단단한 조직41에서 관심의 세포를 분리. 접근을 정렬 하는 두 번째 셀 밀도 및 원심의 힘에 따라 다른 유형의 세포 현 탁 액을 분리 한다. 불행 하 게도, 밀도 중재 원심 대동맥 또는 와트 파생 된 단일 셀 정지에서 세포를 분리 하는 데 실용적이 지 않습니다. 때때로, 차동 원심에서 얻은 제품, 오염 그리고 낮은 항복. 따라서, 처음 효소 소화 다음 몇 셀의 결과 (예: 대동맥 또는 와트) 작은 조직 차등 원심 분리에 대 한 이상적인 후보가 되지 않습니다. 다른 한편으로, 해리 간은에서 파생 된 셀 정지 게시물 정렬 실험 및 문화 stimulations, 정량, 또는 서쪽 더 럽 히 분석 등 분석에 사용할 수 있는 정렬 된 대 식 세포의 적절 한 번호를 생성할 수 있습니다. 이러한 대체 방법은 FACS, 청소기 종류에 대 한 수 전에 인구를 풍부 하 게 사용할 수 있습니다. 메모의 조직 주민 대 식 세포는 와트, 간 및 대동맥 전체 셀 인구의 작은 비율을 확인합니다. FACS 정렬 하기 전에 셀의 농축 접근 덜 자주 셀의 인구를 분리 하는 때 사용 되었습니다. 작은 인구를 고립 시키기에 공통 되는 하나의 문제는 그 큰 셀 번호 후속 분석을 위해 충분 한 세포를 처리 해야 합니다. 농축 또는 미리 정렬 같은 문제를 해결 하려면 사용할 수 있습니다. 이 방법은 긍정적이 고 부정적인 선택을 통해 세포의 더 간결한 인구를 얻기에서 에이즈 하지만 또한 시간의 절약 FACS 정렬 간 같은 조밀한 조직 소스에 대 한 지속적인 프로세스 일 수 있다.
염증 생물학의 최근 발전 만성 염증 조절에 이러한 면역 세포의 복잡 한 역할의 이해를 심화 하기 위해 대 식 세포 이종의 phenotypic와 기능 특성의 중요성을 강조 표시 합니다. 간단히,이 포괄적인 프로토콜 조직 설립된 다이어트 유발 된 비만 및 염증 모델에서 공부 하는 3 개의 각 인 조직에서 거주 세포 특성화에 대 한 다차원 접근을 제공 합니다. 더 중요 한 것은이 프로토콜은 계정에 어려움 하 고 깨끗 한 분리 하는 데 필요한 조치 단일 셀 정지 dysregulated에서 와트, 대동맥 플 라크와 지방 간 조직 염증이. 프로토콜 연구원을 cytometry 및 FACS 조직 주민 대 식 세포, 비만에서 염증의 주요 규제 하는 혁신 차원에서 정렬 도구를 적용할 수 있습니다. 대 식 세포 인구 역학의 심층적인 특성화 monocyte 염증된 조직에서 인신 매매에 대 한 통찰력을 제공 하 고 정렬 된 대 식 세포에 실험적인 접근의 무리를 통해 지속적인된 기계적 평가 대 한 허용 수 있습니다. 대 식 세포 인구의 더 특성화 macrophage이 건강과 질병을 조절 하는 생물학적 토대에 대 한 중추적인 통찰력을 제공할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 관심의 충돌이 있다.
Acknowledgments
우리는 펜실베니아 주립 대학교 밀레니엄 과학 단지에서 Flow Cytometry 핵심 시설을 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 26 G x 5/8 in Needles | BD | 305115 | |
| 23 G x 0.75 in needle x 12 in. tubing Blood Collection Set | BD | 367297 | Used for cannulation of subhepatic IVC during liver perfusion |
| 21 G 1 1/2 in. Needles | BD | 305156 | |
| 1 mL syringe with rubber stops | BD | 309659 | |
| 10 mL Syringes | BD | 309604 | |
| 1 mL Syringe | BD | 309659 | |
| F4/80 PE | Biolegend | 123110 | |
| CD11c PE/Cy7 | Biolegend | 117318 | |
| CD11b PE/Cy5 | eBioscience | 15-0112-81 | |
| Anti-mouse CD16/32 Fc Block | Biolegend | 101320 | |
| CD45 Pacific Blue | Biolegend | 103126 | |
| PE Rat IgG2a | Biolegend | 400508 | |
| PE/Cy7 Armenian Hamster IgG | Biolegend | 400922 | |
| PE/Cy5 Rat IgG2b | Biolegend | 400610 | |
| Pacific Blue Rat IgG2c | Biolegend | 400717 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Cellgro | 15-017-CV | |
| 1x Phosphate Buffered Saline (PBS) | Cellgro | 21-031-CV | |
| 70 μm cell strainers | Corning, Inc. | 352350 | |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Denville | C2170 | |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution -16x | Electron Microscopy Sciences | CAS #30525-89-4 | |
| Micro Dissecting Scissors, 3.5 inch, Straight, 23 mm, Sharp | Stoelting | 52132-10P | Used for general dissecting purposes |
| Micro Forceps, 4 inches, full curve, 0.8 mm | Stoelting | 52102-37P | Used for general dissecting purposes |
| Spring dissection scissors – 3 mm Cutting edge | Fine Science Tool | 15000-10 | Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28 |
| Curved 0.07 mm x 0.04 mm Tip Forceps | Fine Science Tool | 11297-10 | Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28 |
| Hemostatic Forceps (Curved) | Fine Science Tool | 13021-12 | |
| Heparin Sodium Salt | Fischer Scientific | 9041-08-1 | |
| 35 mm Cell Culture/Petri Dishes | Fischer Scientific | 12-565-90 | |
| Polystyrene Petri Dishes (10 cm) w/lid | Fischer Scientific | 08-757-100D | |
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene) | Fischer Scientific | 14-959-53A | |
| 50 mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene) | Fischer Scientific | 14-432-22 | |
| 5 mL Round-Bottom Polystyrene Tubes | Fischer Scientific | 14-959-5 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| Ethanol (Stock Ethyl Alcohol Denatured, Anyhydrous) | Millipore | EX0285-1 | |
| Bovine Serum Albumin | Rockland | BSA-50 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Collagenase Type II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| Collagenasse Type XI | Sigma-Aldrich | C7657 | |
| Hyaluronidase Type I | Sigma-Aldrich | H3506 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Collagenase Type I | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| NaOH | Sigma Aldrich | 1310-73-2 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | 449709-10G | |
| 500 mL beaker | Sigma Aldrich | 02-540M | |
| 4 cm Hemostatic clamp | Stoelting | 52120-40 | |
| Toothed forceps | Stoelting | 52104-33P | |
| 50 μm Disposable filters | Systemex | 04-0042-2317 | |
| Collagenase Type IV | ThermoFischer Scientific | 17104019 | |
| Ammonium Chloride Potassium (ACK) | ThermoFischer Scientific | A1049201 | |
| Razors (0.22 mm (0.009")) | VWR International | 55411-050 | |
| Texas Red Live/Dead stain | Red viability stain (in Figure 1A) |
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