Artigo de método

resolvida no tempo com ionização por electrospray Hidrogénio-deutério troca Espectrometria de Massa para estudar a estrutura e dinâmica das proteínas

DOI:

10.3791/55464

⸱

17 de abril de 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, York University, 2The Centre for Research in Mass Spectrometry, York University, 3The Centre for Research on Biomolecular Interactions, York University

Neste artigo

Resumo

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flexibilidade conformacional desempenha um papel crucial na função da proteína. Aqui, nós descrevemos o uso de espectrometria de massa por ionização por electropulverização resolvida no tempo acoplado a troca de hidrogénio-deutério para sondar as rápidas mudanças estruturais que conduzem a função de proteínas ordenadas e desordenadas.

Resumo

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proteínas intrinsecamente desordenados (PDI) têm sido um desafio para os biólogos estruturais devido à sua falta de elementos da estrutura secundária estável. Hidrogénio-deutério Exchange (HDX) medido em escalas de tempo rápidos é exclusivamente adequado para detectar estruturas e redes de ligação de hidrogénio que são rapidamente povoadas, permitindo a caracterização de confórmeros transientes em conjuntos nativas. Acoplamento de HDX para espectrometria de massa oferece diversas vantagens, incluindo alta sensibilidade, baixo consumo de amostra e sem restrição no tamanho da proteína. Esta técnica tem avançado muito nas últimas décadas, incluindo a capacidade de monitorar tempos de rotulagem HDX na escala de tempo de milissegundos. Além disso, por incorporação do fluxo de trabalho HDX para uma plataforma de microfluidos que aloja um microrreactor de protease ácida, que são capazes de localizar as propriedades dinâmicas ao nível péptido. Neste estudo,-tempo resolvido com ionização por electrospray Espectrometria de Massa (Tresi-MS) acoplado a HDX was usadas para fornecer uma imagem detalhada da estrutura residual na proteína tau, bem como as mudanças conformacionais induzidas mediante a hiperfosforilação.

Introdução

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Ao longo das últimas décadas, avanços significativos foram feitos no desenvolvimento de técnicas analíticas concebidas para medir a estrutura da proteína e da dinâmica 1, 2, 3, 4. Enquanto a cristalografia de raios-X permanece o princípio ferramenta para a determinação da estrutura de proteínas, altas concentrações de proteína são necessárias e optimização extensa é necessária para a produção de cristais de qualidade de difracção. As proteínas que são difíceis de cristalizar, tal como as proteínas associadas a membranas e intrinsecamente desordenados foram classicamente estudado por permuta hidrogénio-deutério (HDX) RMN 5. No entanto, nas últimas décadas, o acoplamento de espectrometria de massa por ionização por electropulverização (ESI-MS) para HDX foi rapidamente ganhou popularidade 6, 7.

espectrometria de massa oferece uma soluçãoa muitas das restrições impostas por cristalografia de raios X e RMN. Em particular, é altamente sensível MS (nM para as concentrações necessárias uM), e não há praticamente nenhum limite no tamanho da proteína. Além disso, o ciclo de alta de análise MS permite a possibilidade de estudar proteínas que se submetem a rotatividade enzimática, o enrolamento incorrecto, complexação e outros processos biologicamente relevantes. Estes processos muitas vezes ocorrem na milisegundo para a segunda escala de tempo e necessitam de uma rápida mistura dos reagentes antes da análise.

O desenvolvimento de resolvida no tempo com ionização por electrospray (Tresi) por Wilson e Konermann em 2003 reacções permitidos para ser monitorado em tempo real pelo pseudo-ESI-MS. A sua configuração incorporado um misturador capilar com um volume de câmara de reacção continuamente ajustável 8. O dispositivo consiste em dois capilares concêntricos, com o capilar interior selado e um entalhe cortado em seu lado para permitir a mistura no interior do estreito inter-capilary espaço do entalhe para a extremidade do capilar interna (tipicamente de 2 mm). Quando aplicada a experiências HDX, o capilar interior transporta a proteína de interesse, o capilar exterior leva a rotulagem D 2 O solução, que é então submetido a misturar com a proteína antes de entrar na câmara de reacção ajustável permitindo a etiquetagem HDX antes da transferência directa para o ESI fonte.

Resumidamente, HDX depende de hidrogénios de amida do esqueleto submetidos troca com átomos de deutério em solução de 9, 10. A troca é catalisada por base, a pH fisiológico, com ácido-catálise tornar-se predominante a um pH abaixo de aproximadamente 2,6. A taxa de conversão é baseada em quatro factores principais: pH, temperatura, solvente de acessibilidade e de ligação de hidrogénio intramolecular. À medida que os primeiros dois factores são mantidas constantes ao longo da experiência, a taxa de câmbio, particularmente nas posições amida esqueleto peptídico, é principalmente dependent na estrutura da proteína 11. Regiões com extensas, redes de ligação de hidrogénio estável em hices e folhas? Firmemente dobrado ocupará deutério a taxas substancialmente mais lentas em comparação com regiões de loops e desordenados (e, por vezes, não em todos) 12. Isto permite uma análise global de proteínas, em que as perturbações na estrutura (por exemplo., Mediante a ligação do substrato ou a agregação) conduzem a diferentes captação de deutério (Figura 1).

O misturador capilar cinética pode ser incorporada uma plataforma de microfluidos que contém uma câmara proteolítica para localização da absorção de deutério. Esta câmara proteolítica é realizada a um pH baixo, a fim de extinguir eficazmente a reacção de permuta, e requer uma protease ácida imobilizada, a fim de digerir a proteína em péptidos localizados (figura 2). Monitorando o Exchange backbone em milissegundo para escalas segunda vez é especialmente importante para ocaracterização de alterações conformacionais no difícil caracterizar regis de ansa, glóbulos fundidos, e proteínas intrinsecamente desordenados (PDI) 13, 14. Alternativamente, Tresi-HDX também podem ser utilizados para caracterizar as proteínas que neste momento não têm uma estrutura atómica resolvido através dos métodos de cristalografia de raios-X e RMN, usando troca de deutério acoplado ao algoritmo Corex (DX-Corex) abordagem 15, 16. Este protocolo detalhado vai aplicar-Tresi HDX para estudar tau, um IDP, em ambos sua forma nativa, assim como o respectivo estado hiperfosforilado patogénico. Enquanto tau nativa é um dos DIs mais bem estudados, pouco se sabe sobre o seu homólogo amiloidog�ico 13.

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Protocolo

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NOTA: Por favor, consulte todas as folhas de dados de segurança pertinentes (MSDS) antes do uso. Os fumos produzidos pela ablação a laser de poli (metacrilato de metilo) (PMMA) pode ser tóxico. Certifique-se de que o gravador do laser está ligado a um sistema de ventilação funcionando. Use todas as práticas de segurança adequadas ao construir o dispositivo microfluídico incluindo o uso de controles de engenharia (exaustor, recipiente para objectos cortantes) e equipamentos de proteção individual (óculos de segurança, máscara, luvas, jaleco, calça de corpo inteiro, sapatos fechados). É de extrema importância de usar reagentes de grau Cromatografia Líquida de Alto Desempenho (HPLC), sempre que possível, com toda a ser de grau ACS ou superior para reduzir contaminantes interferentes durante a análise.

1. Preparação do Dispositivo de microfluidos

  1. Construção do Microfluidic Platform PMMA
    1. Se obter um bloco de PMMA corrente (8,9 x 3,8 x 0,6 cm) e laser de ablação de um canal de entrada para a introdução dos reagentes, uma proteolise câmara, e um canal de saa usando um gravador a laser 17, 18.
      NOTA: Etch a câmara de proteólise em uma forma oval alongada (30 x 5 x 0,05 milímetros). O canal de entrada e de saída deve estender-se para o fim do bloco de PMMA e não ser maior do que 75? M em largura e profundidade, de modo a acomodar um capilar de 30 ga.
    2. Corte um capilar de aço inoxidável de metal 30 ga em dois pedaços de cerca de 10 cm cada, usando uma ferramenta rotativa com um disco de corte de espessura 1/64" . Use uma lixa para alisar as extremidades dos capilares (isto pode ser facilitado através da visualização sob microscópio óptico).
    3. Derreter os capilares para o poli gravado (metacrilato de metilo) bloco usando um ferro de soldar. O canal de entrada será ligada a bombas de seringa automatizada, e o canal de saída será usado para o acoplamento para a MS.
  2. Construção do Kinetic misturador contínuo-Flow Time-Resolvido
    1. Obter um fundidocapilar de vidro de sílica (ID: 75? m, OD: 150 um) de cerca de 40 cm, e inseri-lo em um capilar de aço inoxidável de metal 28 ga de aproximadamente 15 cm. Dependendo do tempo de reacção necessário, utilizar um capilar de metal ou uma mais exterior com uma maior ID.
      NOTA: A determinação do diâmetro 'verdadeiro' interior do tubo capilar metálico é crítico para a obtenção de tempos de reacção precisas. Isto pode ser feito ligando o capilar de metal para um HPLC, fluindo solvente embora o capilar, e a gravação a pressão de retorno. Uma contrapressão para cálculo diâmetro interior pode ser feita, e o diâmetro interior real do capilar de metal determinada. Isto pode ser calculado usando o software Molecular Weight Calculator (para Windows versão 6.49).
    2. Produzir um entalhe 2 mm utilizando configurações do gravador laser de baixa potência em uma extremidade do capilar de vidro interior e selar esta extremidade do capilar de vidro interior (Figura 2). Como alternativa, faça o entalhe usando um capilar de vidro cerâmicaFerramenta de corte de y ou um moinho rotativo com uma lâmina de corte fino.
    3. Linha-se o capilar de vidro interior com a extremidade do capilar de metal (isto pode ser facilitado por observação sob um microscópio de luz).
    4. Anexar este misturador cinética a uma extremidade do T de mistura (Figura 2).
    5. Anexar um capilar de vidro de sílica fundida (ID: 75? M, OD: 150 um) de cerca de 40 cm para a extremidade oposta do misturador cinética no T de mistura. Esta é usada para fornecer ácido (ácido acético a 5%, pH 2,4) para extinguir a reacção.
      NOTA: Os reagentes são fornecidos para o dispositivo com seringas de gás estanque a tubagem politetrafluoroetileno (PTFE), utilizando bombas de infusão automatizadas.
  3. Ativação pepsina
    1. Pesam-se 20 mg de pepsina a partir de mucosa gástrica porcina e suspendê-lo em 1 ml de tampão de acoplamento (fosfato de sódio 0,1 M, NaCl 0,15 M, pH 6,0).
    2. Pesam-se 50 mg de N-hidroxissuccinimida (NHS) de pérolas de agarose activadas, adicionar à re-sprotease uspended e girar suavemente durante a noite a 4 ° C.
    3. Girar a 1000 xg durante 2 min à temperatura ambiente para recolher a resina.
    4. Aspirar a protease não ligado.
    5. Incubar a agarose em 1 mL de tampão (1 M Tris-HCl, pH 6,0) de bloqueio e girar suavemente à temperatura ambiente durante 1 h.
    6. Girar a 1000 xg durante 2 min à temperatura ambiente para recolher a resina.
    7. Aspirar o tampão de bloqueio.
    8. Incubar a pepsina-agarose com ácido acético a 1 mL de 5%, pH 2,4 durante 5 min.
    9. Girar a 1000 xg durante 2 minutos para colectar a resina.
    10. Aspirar o sobrenadante.
    11. Repita os passos 1.3.8 - 1.3.10 para um total de três lavagens.
    12. Armazenar as pérolas em 1 ml de ácido acético a 4 ° C para uso a longo prazo.
  4. Assembléia dispositivo
    1. Encher a câmara de proteólise com a suspensão de pérolas de pepsina-agarose activadas em ácido acético a 5% usando uma espátula estéril.
    2. Coloque o Platfor microfluídico PMMAm entre dois blocos de PMMA em branco como uma tampa para selar o dispositivo, alinhado com borracha de silicone para criar uma vedação estanque aos líquidos.
    3. Utilizar placas de fixação metálico a pressão de selagem do dispositivo.
      NOTA: O grampo foi feito à medida, a fim de se ajustar à plataforma de microfluidos e é composto de duas placas medindo 10,1 cm x 7,4 cm x 1,2 cm.
    4. Fluxo de 5% de ácido acético, pH 2,4, a uma taxa de 10 mL / min. Fluxo 50 mM de tampão de acetato de amónio (pH 6,9), embora a linha de proteína a uma taxa de 1 mL / min.
      NOTA: É extremamente importante que o ácido acético é continuamente que flui através do dispositivo ao longo de todo o experimento. Certifique-se de que não existem fugas e que o fluido que está a sair apenas a partir do canal de saída, que vai servir como fonte de ESI.
    5. Acoplar o dispositivo à extremidade dianteira de um (Q-TOF) espectrómetro de massa de quadrupolo modificado de tempo-de-voo usando uma fase de isolamento ajustável para alcançar as condições óptimas de electropulverização.
      NOTA: A chave de bypassé introduzido, de modo a simular a presença de uma fonte de ESI comercial. 17

2. Troca de ionização electrospray hidrogênio-deutério resolvida no tempo

  1. Aquisição de pepsina e Proteína Só Spectra
    NOTA: aquisição ESI-MS é realizada em modo de ião positivo com uma voltagem de 4500-5000, de 60 V potencial desagrupamento, e 250-V potencial de focagem. Os espectros foram adquiridos ao longo de um intervalo de 350-1,500 m / z com uma velocidade de varrimento de 1 s -1.
    1. Adquirir uma única espectro pepsina. Quaisquer picos que aparecem neste espectro são subtraídas uma vez que a proteína é adicionada.
    2. Introduzir 50-100 uM tau / protea fosfo-tau (purificar e preparar como anteriormente descrito 13, 19) a uma taxa de 1 mL / min, onde o tampão de acetato de amónio 50 mM foi previamente fluir.
    3. Adquirir uma proteína única espectro.
  2. aquisição oPontos f Tempo
    1. Enquanto a proteína tau 100 M / fosfo-tau está fluindo a 1 mL / min, introduzir D 2 O a uma taxa de 3 mL / min através de um conector T e deixar reagir no misturador cinética. Permitir para o sistema atinja o equilíbrio durante pelo menos 10 min antes da aquisição do espectro.
      NOTA: Após a troca, a reacção de marcação é extinta pelo fluxo de pH ácido acético 2,4 a 10 uL / ​​min e a digestão da proteína marcada ocorre na câmara proteolítica.
    2. A fim de aumentar o tempo de rotulagem, puxar para trás manualmente a posição do capilar de vidro interior para alcançar tempos de mistura de 42 ms a 8 s. Permitir para o sistema atinja o equilíbrio durante pelo menos 10 minutos entre cada impulsão traseira.

3. Dados e Análise Estatística

  1. Identificar Peptídeos e cálculo do percentual de deutério Exchange
    1. Realizar análises de MS espectros usando software mMass, versão 5.5.0 20 .
    2. Identificar péptidos que utilizam o servidor proteómica ExPASy FindPept e confirmar por dissociação induzida por colisão (CID) quando necessário 21.
      NOTA: Aqui, incorporação captação de deutério foi medida utilizando um software Fortran in-house desenvolvido para análise da distribuição isotópica 22, 23.
    3. Calcular as taxas intrínsecas teóricos baseados na sequência primária utilizando a ferramenta da web ESFERA 22, 24.
    4. Ajustar os dados utilizando regress exponencial única não-linear e normalizar utilizando uma representação gráfica e software estatístico (por exemplo, Sigma-Plot).
      NOTA: O rácio de k int / kobs produz o factor de protecção (FP), uma medida semi-quantitativa do grau de que uma determinada região é estruturado dentro do conjunto conformacional.

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Resultados

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perfis de digestão de tau-fosfo nativa e foram semelhantes, dando origem a uma cobertura sequência de 77,1 e 71,7% respectivamente. valores de absorção de deutério de cada péptido foi determinada por ajustamento dos distribuições isotópicas observadas com as distribuições teóricas geradas usando um software Fortran desenvolvido internamente. Os melhores distribuições de montagem são mostrados (Figura 3a), juntamente com os valores de absorção de deutério associados. perf...

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Discussão

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Enquanto os métodos de biologia estrutural, tais como cristalografia de raios-X e RMN são vantajosos porque proporcionam estruturas extremamente detalhadas de proteínas, estas imagens são frequentemente estático. A caracterização das espécies transientes e domínios fracamente estruturados continua a ser elusiva quando estudados por estes métodos convencionais. Portanto, a fim de obter insights dinâmicos sobre estes tipos de sistemas é importante para trabalhar em escalas de tempo rápido. Temos aplicado com sucesso Tresi...

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Divulgações

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Não temos nada a divulgar.

Agradecimentos

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Agradecemos ao Dr. Markus Zweckstetter por fornecer o arquivo de coordenadas pdb para o conjunto tau 'nativo' previsto a partir de seu trabalho de RMN, com ferramentas de análise fornecidas pelo Dr. Adnan Sljoka. O financiamento para este trabalho foi fornecido pelo programa ENGAGE Grant do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá (NSERC).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Poli(metacrilato de metila) ou PMMAProfessional PlasticsSACR.250CCP8.9 cm x 3.8 cm x 0.6 cm
Capilar de Vidro de Sílica FundidaPolymicro Technologies106815-0018ID: 75 µ m, OD: 150 µ m
Capilares MetálicosMcMaster-Carr28 ga – 89875K97
30 ga  - 89875K99
Tubo de Etileno Propileno Fluorado (FEP)IDEX1477
1548		ID: 0.007", OD: 1/16"
ID: 0,020", OD: 1/16"
Cortador de tubos de polímero padrãoIDEXA-327para 1/16" e 1/8" Tubo OD
Micro T de mistura estáticaIDEXM-540para 1/16 " Tubulação OD
ou
Tee de Aço Inoxidável, 0.25  mm FuroValco Instruments Co., Inc. (VICI)ZT1Cpara 1/16 " Tubo OD
PEEK Tee para 1/16 " Tubulação ODIDEXP-727
10-32 Fêmea para Fêmea LuerIDEXP-659
10-32 PEEK Porca de Asa DuplaIDEXF-300
Virola para 1/16" Tubulação ODIDEXF-142
Ferramenta Rotativa Série 100DremelF013010001
Jobmate1/64" de espessura
Fisher Scientific12-563-411
Ferro de SoldaMastercraft58-6301-2
VersaLaserUniversal
SeringasHamilton81220500  µ Capacidade L
Bombas de SeringaHarvard Apparatus70-4501
NomeEmpresaNúmero do Catálogo<strong>Comentários
Reagentes
NHS-Activated AgaroseFisher Scientific26196
Pepsina da mucosa gástrica suínaSigma-AldrichP6887-250MG
Óxido de deutérioSigma-Aldrich151882-10X0.6ML
Ácido acéticoSigma-Aldrich695092-100ML
HPLC Grau ÁguaFisher ScientificW5-4
Acetato de amônioSigma-AldrichA7330-500G
Fosfato de SódioFisher ScientificS369-500
Cloreto de SódioFisher ScientificS671-3
NomeEmpresaNúmero de CatálogoComentários
Software/Ferramentas Online
CorelDraw X3Corel
CalculadoraVersão 6.49Ferramenta MS de Código Aberto
mMassVersão 5.5.0Ferramenta MS de Código Aberto
ExPASy FindPeptInstituto Suíço de Bioinformática
SigmaPlotSoftware SystatVersão 11.0
PyMOLSchrö dinger Versão 1.5.0.4
NomeEmpresaNúmero de CatálogoComentários
Instrumentos
QStar Espectrômetro de Massa Híbrido Q-TOF EliteAB SCIEX
Discos de Corte Microscópio de Zoom Digital Stereomaster de de Peso Molecular

Referências

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