Artigo de método

Resolver purificada por afinidade complexos de proteínas por Azul Native PAGE e Proteína Correlação Profiling

DOI:

10.3791/55498

⸱

1 de abril de 2017

 ,  ,  , 
1Proteomic Mass Spectrometry, Wellcome Trust Sanger Institute

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui apresenta-se os protocolos para a purificação por afinidade de complexos de proteínas e a sua separação por PAGE nativa azul, seguido pelo perfil correlação protea utilizando espectrometria de massa quantitativo livre etiqueta. Este método é útil para resolver interactoma em complexos de proteínas distintas.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A maioria das proteínas atua em associação com outras; portanto, é crucial caracterizar essas unidades funcionais para entender completamente os processos biológicos. A purificação de afinidade acoplada à espectrometria de massas (AP-MS) tornou-se o método de escolha para identificar interações proteína-proteína. No entanto, os estudos convencionais de AP-MS fornecem informações sobre as interações proteicas, mas as informações organizacionais são perdidas. Para resolver esse problema, desenvolvemos uma estratégia para desvendar os distintos conjuntos funcionais em que uma proteína pode estar envolvida, resolvendo complexos de proteínas purificados por afinidade antes de sua caracterização por espectrometria de massa. Complexos proteicos isolados por meio da purificação por afinidade de uma proteína isca usando uma etiqueta de epítopo e eluição competitiva são separados por eletroforese nativa azul. A comparação de perfis de migração de proteínas por meio de perfis de correlação usando espectrometria de massa quantitativa permite a atribuição de proteínas de interação a entidades moleculares distintas. Este método é capaz de resolver complexos proteicos de pesos moleculares próximos que podem não ser resolvidos por técnicas cromatográficas tradicionais, como filtração em gel. Com pouco mais trabalho do que o AP-geLC-MS/MS convencional, demonstramos que essa estratégia pode, em muitos casos, ser adequada para obter informações topológicas do complexo proteico concomitantemente à identificação de interações proteicas.

Introdução

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Em células, a maioria das proteínas de desempenhar as suas funções através de interacções proteína-proteína transitórios ou através da formação de conjuntos de proteínas estáveis. Caracterizando interações proteína é crucial para os processos celulares totalmente entendimento. A purificação por afinidade em combinação com espectrometria de massa (AP-MS) é uma das estratégias mais vulgarmente aplicados para identificar interacções proteína nativa. melhorias significativas na capacidade do instrumento alcançados na última década fizeram esta abordagem extremamente poderoso. É importante notar que as interacções identificados por experiências de AP-MS incluem uma mistura de associações directas e indirectas entre isca e presas. Além disso, muitas vezes proteínas tomar parte em vários complexos diferentes dentro do mesmo contexto celular, que pode ter diferentes papéis biológicos, e, por conseguinte, os interactores que são identificados por AP-MS pode representar uma mistura de conjuntos de proteínas distintas ou entidades funcionais. Não é possível derivartal informação topológica, a priori, a partir das listas de mono-dimensional de proteínas gerados por simples experiências de AP-MS. No entanto, a técnica pode ser explorada para definir a arquitectura de complexos de proteínas por combinação com um ou mais métodos para resolver estes conjuntos.

A fim de resolver a topologia de interacções proteína identificada através de AP-EM, várias estratégias têm sido aplicadas. Uma abordagem consiste em realizar iterativos experiências AP-MS utilizando as presas identificados numa fase anterior de experiências como iscos 1. Embora muito informativo, esta é uma tarefa intensiva muito trabalho, tanto experimentalmente e analiticamente. Proteína de reticulação em combinação com a espectrometria de massa é cada vez mais utilizada para derivar informação topológica de complexos de proteína 2, 3, 4, 5. No entanto, ComputatioA análise final dos péptidos de ligação cruzada continua a ser uma tarefa difícil e, portanto, é o afunilamento no fluxo de trabalho. O advento de reagentes de ligação cruzada MS cliváveis deve facilitar o mapeamento dos resíduos de aminoácidos que estão em estreita proximidade em proteínas que interagem 6, 7. Outra alternativa é a de combinar a purificação por afinidade com técnicas de separação ortogonais anteriores 8, 9. Fraccionamento cromatográfico por filtração em gel ou de permuta iónica, ou fraccionamento em gradiente de sacarose foram também recentemente utilizado em combinação com espectrometria de massa quantitativo para descrever os complexos multiproteicos a um nível de todo o sistema, contornando o passo complexo de isolamento 10, 11, 12, 13. electroforese em gel de poliacrilamida nativa azul (BN-PAGE) tem sido amplamente aplicada parainvestigar interacções entre proteínas nativas, tipicamente as que envolvem complexos de proteína de membrana mitocondrial 14. Esta técnica de separação também foi recentemente utilizada em combinação com a quantificação de proteína livre de marcador e perfis de correlação, não só em complexos mitocondriais 15, 16, 17, mas também para desvendar outros complexos de proteínas a partir de células inteiras 18, 19. Colocámos a hipótese de que a combinação de purificação por afinidade com abordagens de fraccionamento nativas subsequentes e MS quantitativa deve fornecer uma estratégia útil para a resolução de múltiplos conjuntos de proteínas que contêm uma proteína particular.

Aqui, descrevemos um método que combina a purificação por afinidade à base de epitopo genérico com electroforese em gel de poliacrilamida nativa azul dos complexos isolados, seguido por SP massa quantitativoectrometry e perfilamento correlação proteína, para resolver os vários conjuntos de uma proteína pode ser envolvidos em. Empregamos rato embrionário de células estaminais em que uma protea de interesse fundida com uma etiqueta de epítopo é expresso a partir do locus endógeno para atingir perto de abundância fisiológico e assegurar nativa eficiente isolamento complexo. Esta abordagem desvenda as múltiplas interacções uma proteína envolve, resolvê-los em conjuntos distintos com base nos seus perfis de correlação, enquanto que não exige mais trabalho do que o convencional GELC-MS 20.

Protocolo

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1. Isolamento de complexos de proteína nativa por afinidade FLAG Purificação

  1. preparativos
    1. Defina-se um banho de água a 37 ° C para descongelar o sedimento celular.
    2. Arrefecer uma microcentrífuga a 4 ° C.
    3. Coloque vários tubos de microcentrífuga de diferentes tamanhos (1,5 ml, 15 ml) e um homogeneizador em gelo.
    4. Preparar 10 ml de tampão de lise (50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM de NaCl, 0,1% de Nonidet P-40, 1 mM de EDTA) e manter em gelo. Imediatamente antes de utilizar o tampão, adiciona-se 10? L de DTT 1 M e um comprimido de triturado de inibidores de protease isento de EDTA.
  2. Preparação de contas ligadas a anticorpos
    NOTA: As esferas revestidas com anticorpo podem ser preparados até uma semana antecipadamente e guardado no frigorífico até ser necessário. Proteína G tem maior afinidade do que a proteína A, para a maioria das espécies de subtipos de imunoglobulina, excepto para IgG de coelho, para que a proteína tem uma maior afinidade.
    1. Lavar 50 uL de pérolas magnéticas revestidas com Proteína G-: Transferência 50 &# 956; L de talão suspensão para um tubo de microcentrífuga, colocar o tubo no íman para recolher as esferas, no lado do tubo e remover o líquido. Ressuspender as contas em 0,5 ml de PBS-0,01% de Tween-20.
    2. Colocar o tubo no íman para recolher as esferas, no lado do tubo e remover o líquido. Ressuspender as esferas em 40 mL de PBS-0,01% de Tween-20. Adicionam-se 10 ug (10 ul de 1 mg / mL de solução de reserva) de anticorpo anti-FLAG M2. Incubar com rotação durante 20 min à temperatura ambiente.
    3. Colocar o tubo no íman para recolher as esferas, no lado do tubo e remover o líquido. Lavam-se os grânulos com 0,5 ml de PBS-0,01% de Tween-20.
    4. Para ligação cruzada do anticorpo com as esferas, lavar as contas duas vezes com 1 ml de trietanolamina 0,2 M, pH 8,2. Em seguida, voltar a suspender as pérolas em 1 ml de DMP 20 mM (pimelimidato de dimetilo) em trietanolamina M pH 8,2 0,2 ​​(DMP solução deve ser preparado fresco imediatamente antes da utilização). Incubar com rotação à temperatura ambiente durante 30 min.
      5. Coloque o tubo no íman. Remover o sobrenadante e ressuspender as contas em 0,5 ml de Tris-HCl 50 mM pH 7,5. Incubar com rotação à temperatura ambiente durante 15 min.
  3. Lavam-se as esferas 3 vezes com 0,5 mL de PBS-0,1% Tween-20. Deixar contas na última lavagem até ser necessário.
  • purificação de afinidade à base de FLAG
    NOTA: Tome cuidado em não deixar as contas sem tampão por um longo período de tempo. Todos os tampões e tubos devem ser mantidos em gelo em todos os momentos. O seguinte protocolo foi optimizado para a purificação de complexos de proteínas a partir de 2-5 x 10 8 culas (10-20 mg de protea de lisado) expressando níveis endógenos de uma proteína marcada com Flag 20.
    1. Descongelar o sedimento de células em banho-maria a 37 ° C até que começa a derreter. Tomar o tubo para fora do banho, agite suavemente até que o sedimento é completamente descongelado, e colocar imediatamente o tubo contendo a suspensão de células em gelo.
    2. Adiciona-se 5 mL de tampão de lise arrefecido com gelo(Contendo DTT e inibidores de proteases) à suspensão de células e redemoinho para misturar. Incubar em gelo durante 10 min.
    3. Transferir o lisado para um homogeneizador de Dounce frio. Lyse com 20-30 cursos usando o pilão apertado (até que não haja viscosidade perceptível). Transferir o homogenado a tubos de microcentrífuga frio.
    4. Centrifuga-se a 18000 xg durante 15 min a 4 ° C.
    5. Transferir o lisado clarificado para um tubo limpo frio. Deixar 50 mL de lisado para trás. Tomar uma aliquota de 35 mL de lisado para medir a concentração de proteína e controlar a purificação.
    6. Remover o PBS-0,1% Tween-20 a partir das esferas. Ressuspender as esferas com 1 ml de lisado e misturar com o resto do lisado. Incubar a mistura em uma roda rotativa, a 4 ° C durante 1-2 h.
    7. Recolha as esferas do lado do tubo com o ímã. Recolhe-se uma alíquota de 30 ul de sobrenadante e descartar o resto do sobrenadante. Ressuspender as contas em 0,5 ml de IPP150 tampão (Tris-HCl 10 mM pH 8, 15NaCl 0 mM, 1 mM EDTA, 0,1% de NP-40) por pipetagem de 4-6 vezes. Transferir para um tubo de 1,5 mL frio.
    8. Repita as lavagens com 0,5 mL de tampão IPP150 mais duas vezes.
    9. Lavagem grânulos três vezes com 0,5 ml de tampão de eluição FLAG nativo (20 mM de Bis-Tris a pH 7, 20 mM de NaCl, 0,02% de Nonidet P-40, 1 mM de EDTA, 200 mM de ácido ε-aminocapróico). Com a última lavagem, transferir as contas para um novo tubo frio. Remover cuidadosamente tampão.
    10. Ressuspender as pérolas em 100 ul de 200 ug / mL de péptido FLAG 3x em tampão de eluição nativa. Incubar a 4 ° C durante 10 minutos com rotação suave.
    11. Recolher as contas com o íman e transferir o sobrenadante para um novo tubo frio.
    12. Repita os passos 1.3.10-1.3.11 duas vezes. Pool Todos os eluatos.
    13. Concentra-se o eluato até 25 L de uma unidade de filtro de centrífuga (10 kDa limite nominal de peso molecular de corte, o PES) por centrifugação a 10.000 xg, a 4 ° C. Transferir o eluato concentrado para um novo tubo frio e adicionar 50% glyceRol para uma concentração final de 5%. O eluído concentrado pode ser mantida a 4 ° C durante a noite se necessário.

    • 2. Azul Native PAGE

    1. preparativos
      1. Prepare 1 L de 1x PAGE nativa ânodo Tampão, 1x PAGE nativa escuro Tampão Cathode azul e 1x PAGE nativa Luz Tampão Cathode azul.
      2. Remover o pente do gel de um pré-moldado de 3-12% PAGE nativa e lavar os poços duas vezes com 1x tampão de PAGE nativa escuro Azul cátodo. Encha as cavidades com 1x PAGE nativa escuro Tampão azul cátodo. Configure o gel no tanque de execução, mas não adicionar escuro Tampão azul cátodo para o (interior) câmara de cátodo.
    2. corrida eletroforética
      1. Preparar a amostra: Para os 25 uL concentrados eluato adicionar o volume apropriado de tampão de carga 4x amostra nativa e de 0,5% L-250 aditivo amostra para concentraes finais de 1X e 0,005%, respectivamente.
      2. Carregar a amostra e os marcadores de peso molecular nativo deixando um vazio bem entrn para eles. Carga 10-20 ul de 1x tampão de carregamento de amostra nativa em todos os poços vazios.
      3. Encher o (dentro) da câmara de cátodo com 200 mL de 1x tampão de PAGE nativa escuro Azul cátodo cuidadosamente de modo a não perturbar as amostras. Encher a câmara de ânodo (no exterior) com 550 mL de 1x tampão de PAGE nativa ânodo.
      4. Submeter o gel a 150 V durante 30 min. Pare o prazo, remover o tampão de cátodo azul escuro com uma pipeta sorológica e substituir por 1x Luz Tampão azul cátodo. Continuar a correr durante 60 min. O gel pode ser realizada à temperatura ambiente ou a 4 ° C; a temperatura pode ter um efeito sobre a estrutura complexa de proteínas.
    3. coloração de gel
      1. Abrir a cassete de gel e descartar uma das placas de cassetes. O gel mantém-se ligada à outra placa de cassete. Transferir o gel para um tabuleiro ou receptáculo contendo uma solução suficiente fixador (40% de metanol, 2% de ácido acético) para cobrir o gel e incubar durante 30 min com agitação suave.
      2. Remova o solut fixadorião positivo e adicionar água suficiente para cobrir o gel. O gel pode ser digitalizada para referência futura.

    Análise 3. Espectrometria de Massa

    Nota: Todos os passos subsequentes devem ser realizados numa câmara de fluxo laminar, se possível, para assegurar a limpeza das amostras. Todas as soluções devem ser preparadas com água de grau HPLC. Discutir este protocolo com o laboratório de espectrometria de massa que irá realizar a análise.

    1. preparativos
      1. Coloque um fundo da placa de 96 poços cónico no topo de uma outra placa de 96 poços para recolher os resíduos. Furar o fundo dos poços da placa de fundo cónico de 96 poços com uma agulha 21 G.
      2. Lavam-se os poços da placa de 96 poços perfurada.
        1. Adicionar 200 uL de 50% de ácido fórmico acetonitrilo-0,25% para os poços da placa perfurada. Incubar a pilha de placas num agitador durante 10 min.
        2. Centrifugar a 500 xg durante 1 min de modo que o líquido flui através dos orifícios na placa de recolha de resíduos. Descartar a waste líquido.
        3. Repita os passos 3.1.2.1-3.1.2.2 mais duas vezes.
        4. Encha as cavidades da placa de 96 poços perfurados com 150 mL de bicarbonato de amónio 50 mM (feito recentemente).
      3. Lavam-se os poços de uma filtração centrífuga placa de 96 poços.
        1. Colocar uma placa normal de 96 poços sob a placa de filtração centrífuga para recolher o lixo. Adicionar 200 uL de 50% de ácido fórmico acetonitrilo-0,25% a cada poço da placa de filtração centrífuga.
        2. Centrifugar a pilha de placas a 200 xg durante 1 min. Descarte os resíduos.
        3. Repita os passos 3.1.3.1-3.1.3.2 mais duas vezes.
    2. excisão de gel e em gel digestão
      Nota: Embora a excisão do gel, identificar e fazer uma observação da fatia de gel alinhados para cada um dos padrões de proteína. Os padrões de proteína pode ser utilizada para estimar os pesos moleculares aproximados para todas as fatias de gel.
      1. Colocar o gel com a placa de vidro sobre uma superfície limpa. Corte a pista contêmção da amostra em 48 fatias idênticas (1,5 mm x 5 mm). Corte cada fatia em 2-3 pedaços mais pequenos (com excepção dos últimos cinco fatias no topo do gel) e colocar cada fatia sequencialmente em um poço da perfurada e lavou-se placas de 96 poços.
      2. Adicionar 50 ul de acetonitrilo a cada poço. Incubar a placa com agitação durante 30-60 min. Remover o líquido por centrifugação, tal como no passo 3.1.2.2.
      3. Adicionar 200 uL de TCEP 2 mM em bicarbonato de amónio 50 mM a cada poço. Incubar a placa, sob agitação durante 30 min à temperatura ambiente. Remover o líquido por centrifugação, tal como no passo 3.1.2.2.
      4. Adicionar 200 mL de 4 mM de iodoacetamida em bicarbonato de amónio 50 mM a cada poço. Incubar a placa, sob agitação durante 30 min a 37 ° C no escuro. Remover o líquido por centrifugação, tal como no passo 3.1.2.2.
      5. Adicionar 150 mL de bicarbonato de amónio 50 mM mais 50 mL de acetonitrilo e incubar a placa com agitação durante 30 min à temperatura ambiente. Repetir esta etapa de lavagem ums muitas vezes forem necessárias, até toda a cor azul é removido a partir dos pedaços de gel.
      6. Desidratar os pedaços de gel por adição de 200 mL de acetonitrilo puro e incubar com agitação à temperatura ambiente durante 20 minutos até os pedaços de gel são de cor branca e opaca. Remova o acetonitrilo.
      7. Adicionar 150? L de 0,001 mg / mL de tripsina (de grau de sequenciação) em bicarbonato de amónio 50 mM frio a cada poço. Incubar a placa, sob agitação, a 37 ° C durante 2 h. Após 1 h, verificar que os pedaços de gel são cobertas com líquido; Se este não for o caso, adicionar um outro 50-100 ul de bicarbonato de amónio 50 mM. Após 2 h a 37 ° C, continuar a digestão a 25 ° C durante a noite.
      8. Colocar uma placa de fundo cónico limpo sob a placa contendo gel, assegurando orientação correcta das placas. Recolhe-se o líquido que contém os péptidos por centrifugação a 200 xg durante 1 min.
      9. Colocar a placa de péptidos contendo num evaporador centrífugo e evapora-se o líquido ao mesmo tempo que executa tele próximo passo.
      10. Adicionar 150 uL de 50% de ácido fórmico acetonitrilo-0,25% para os pedaços de gel. Incubar, sob agitação, a 37 ° C durante 30 min.
      11. Recolhe-se o líquido para dentro da placa parcialmente seco a partir do passo 3.2.9 por centrifugação a 200 xg durante 1 min. Continuar evaporando a placa de péptidos contendo ao mesmo tempo que executa o passo seguinte.
      12. Repita os passos 3.2.10-3.2.11.
      13. Adicionar 200 mL de acetonitrilo puro a cada poço da placa contendo os pedaços de gel. Incubar sob agitação à temperatura ambiente durante 15 min.
      14. Recolhe-se o líquido na placa de péptidos contendo por centrifugação a 200 xg durante 1 min.
      15. Certifique-se a concentração final de acetonitrilo em todas as cavidades é superior a 55%. Se necessário, adicione o acetonitrilo puríss.
      16. Transferir as soluções de peptídeos para a placa de filtração lavada centrífuga. Colocar uma placa de fundo cónico limpo debaixo dela, para recolher os péptidos. Centrifugar a pilha de placas a 200 xg durante 1 min.
      17. Evaporcomeram o líquido na placa de fundo cónico até os poços estarem completamente secos. A placa pode ser coberto com uma tampa de silicone e armazenado a -20 ° C nesta fase.
      18. Re-dissolver-se os péptidos em 32 mL de ácido fórmico a 0,5% com agitação vigorosa durante 15 min. Adicionar 8 mL de bicarbonato de amónio 400 mM e incuba-se com agitação vigorosa durante 15 min. Centrifugar a placa a 200 xg durante 1 min. Cubra com uma tampa de silicone e armazenar a placa à temperatura de -20 ° C até a análise por espectrometria de massa.
    3. Espectrometria de massa
      NOTA: Analisar peptídeos em um espectrômetro de massa de alta resolução utilizando métodos compatíveis com proteômica de espingarda. aquisição dependente dos dados é a LC-tandem mais utilizada MS definir-se para este tipo de análise e devem ser optimizados para a identificação de péptidos eficiente, minimizando sequenciação redundante e selecção candidato sobre o ruído de fundo. Os espectros de massa na análise varredura primeira missa fase (MS1) deve ser gravado em modo de perfil. É recomendáveled para seleccionar preferencialmente iões duplamente e triplamente carregadas para análise de massa segunda fase (MS2). Uma gama de massa m / z 400-1,600 é adequado para identificar a maioria dos péptidos entre 8-30 gama aminoácidos. Aqui, um protocolo para a análise usando um espectrômetro de massa Orbitrap é fornecido.
      1. Injecte 20 ul de amostra por análise utilizando o auto-amostrador de um sistema nanoLC-MS / MS. Dessalinizar e concentrar péptidos sobre uma coluna de fase reversa C18 (100 mm ID, 2 cm).
      2. péptidos separados sobre uma coluna C18 analítica (75 um ID, 15 cm) usando um gradiente linear de 30 minutos de 4-28% de ácido fórmico acetonitrilo / 0,1% de 300 nL / min.
      3. Analisar os péptidos em um espectrómetro de massa com um método de aquisição de dados 10 dependente topo com os seguintes parâmetros: m / z gama 380-1,600, 30000 resolução a m / z 400, largura de isolamento 2 Th, exclusão dinâmica em ± 10 ppm para 45 s , alvo de controlo automático de ganho a 1 x 10 6 para MS e 5000 para o MS / MS, o tempo máximo de injecção de 150 ms para o MS e100 ms para o MS / MS.

    Análise 4. Dados

    1. Identificação de proteínas e quantificação usando MaxQuant
      1. Usar o software MaxQuant livremente disponível para identificar e quantificar proteínas em cada fracção de gel a partir dos dados brutos de espectrometria de massa.
        NOTA: MaxQuant funciona em dados gerados por aquisição de espingarda proteômica abordagens dependentes de dados. Os dados de MS das fracções de gel nativo azul devem ser analisados ​​em lote como experiências separadas e não como fracções de um experimento combinando todas as fatias de gel. Marque a caixa valor do iBAQ para realizar cálculos estequiometria. Os protocolos detalhados para a pesquisa do banco de dados e quantificação de proteínas utilizando MaxQuant estão descritos em 21, 22.
    2. Análise do perfil de proteína utilizando Perseu
      1. Use o software disponível gratuitamente Perseus para exibir os perfis de migração das proteínas identificadas e compará-los usandoanálise estatística.
        NOTA: documentação geral sobre como usar Perseus está disponível em http://www.coxdocs.org/doku.php?id=perseus:user:tutorials. Um conjunto de dados de amostra está disponível como dados suplementares.
      2. Carregar o ficheiro proteingroups.txt retornado pela análise MaxQuant contendo as identificações de proteínas e os valores de quantificação para todas as fracções do gel. Preencher os valores de intensidade na caixa principal (Figura 1). Uma matriz aparece contendo todas as identificações de proteína em filas, com as fracções de gel como colunas.
      3. Remover entradas correspondentes a inverter hits, proteínas identificadas apenas por local e potenciais contaminantes, seleccionando linhas de filtro com base em coluna categórica no menu suspenso Filtrar linhas (Figura 2).
      4. Normalizar as intensidades de fracções de cada proteína ao longo do perfil contra a intensidade de proteína total por seleccionando Divide no menu suspenso Normalizar, então Soma (Figura 3). Uma nova mAtrix aparece.
      5. Exibir os gráficos de perfis de migração de todas as proteínas, selecionando Plot Perfil no menu Visualização suspensa (Figura 4).
      6. linhas Select filtro com base em valores válidos no menu suspenso Filtrar linhas. Digite 1 no número de valores válidos necessários.
      7. Executar agrupamento hierárquico de proteínas identificadas em todas as fracções do gel nativo azul seleccionando agrupamento hierárquico no menu suspenso Clustering / APC. Desmarque a caixa de Colunas de árvore (Figura 5). Os aglomerados são visualizados num-mapa de calor no guia de cluster ao lado da matriz (Figura 6).
      8. Localizar o conjunto que contem a proteína de isco no dendrograma. Outros componentes do conjunto representam proteínas co-migram com o isco e são, portanto, potenciais proteínas que interagem / subunidades do mesmo complexo.

    figure-protocol-1 r /> Figura 1. Captura de tela da janela de upload de dados Perseus. A figura mostra os passos para o carregamento de identificação de proteínas e de dados quantificação em Perseu. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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    Figura 2. Imagem da janela Perseu para filtragem de entradas correspondentes aos contaminantes, batidas e proteínas identificadas por local reversa. A seleção Filtrar linhas por coluna categórica abre uma nova janela para seleccionar os tipos de entradas de proteína para ser eliminado do conjunto de dados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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    Figura 3. Captura de tela da janela normalização Perseus. Selecionando Divide no menu Normalização abre uma nova janela, com diferentes opções. Seleccionar Soma divide o valor da intensidade de uma proteína em cada fracção pela intensidade total de proteína que em todas as fracções. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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    Figura 4. Captura de tela de Perseus mostrando gráficos de perfis de migração. As proteínas podem ser seleccionados na matriz abaixo dos perfis para destacar o seu perfil correspondente. A barra de ferramentas pode ser usado para editar e exportar os perfis. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.


    Figura 5. Imagem de janela agrupamento hierárquico Perseu. A figura mostra as configurações de agrupamento hierárquico de proteínas utilizando Manhattan (L1) distância métrica. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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    Figura 6. Captura de tela de Perseus mostrando dendrograma e intensidades de proteína heatmap. O fluxo de trabalho no lado direito do painel principal mostra cada passo realizado e a matriz resultante, e pode ser usado para desfazer qualquer passo. O fluxo de trabalho também pode ramificar a partir de qualquer matriz intermediária. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    1. Cálculo da estequiometria relativa
      1. Selecione as subunidades de um complexo de proteínas com base em sua co-agrupamento com a proteína isca e delimitar o pico (s) perfil em que eles aparecem.
      2. Utilizar os valores obtidos na análise iBAQ MaxQuant para cada subunidade em cada fracção separadamente e normalizar pelo valor correspondente iBAQ isca em que fracção.
      3. Traçar os iBAQs normalizados para isca e proteínas subunidades de complexos entre as fracções do pico seleccionado e aplicar regressão linear. Calcular a quantidade relativa de subunidade complexo de isca através da comparação das tendências dos seus valores iBAQ normalizados.
    2. Estimativa de tamanho complexo proteico
      1. Utilizar os padrões de proteínas para calcular pesos moleculares previstos para os alinhar fatias de gel nativo azul da pista de amostra. Destes, gerar um modelo de regressão linear, representando fatias de gel no eixo x e pesos moleculares no eixo y.
        2. Utilizar o modelo para estimar o peso molecular observado do complexo de proteína (s) com base na fatia nativa azul (s) a partir do qual eles foram identificados.

    Resultados

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    O fluxo de trabalho da purificação por afinidade azul perfis Correlação proteína nativa por Espectrometria de Massa de estratégia (ABC-MS) é representado na Figura 7. complexos de proteínas nativas em torno de uma proteína de interesse é isolado por purificação de afinidade utilizando anticorpos contra um marcador epitico (neste caso FLAG) e eluição competitiva. Os complexos são resolvidos por BN-PAGE, e toda a pista de gel é excisado em 48 secções, e preparado para a espingarda LC-MS / MS. MS informação quantitativa é utilizado para gerar um perfil de migração para cada proteína identificada através da separação nativa azul. As proteínas que interagem para formar um complexo de exibição distintos perfis de migração similares com picos sobreponíveis. Quando uma proteína de interesse participa em mais do que um conjunto, picos múltiplos são observados no seu perfil de migração, dadas as sub-complexos estão dentro da potência de resolução do gel nativo azul. Uma comparação sistemática do migperfis de ração pode ser realizada através de correlação de perfil proteína usando agrupamento hierárquico. O dendrograma e as intensidades dos picos para todas as fracções são visualizados num mapa-calor, facilitando a identificação de proteínas que interagem que pertencem a complexos de proteínas distintas (Figura 8).

    Nós usamos esta estratégia para analisar os parceiros interagindo de MTA2, uma subunidade núcleo da cromatina NURD remodelação complexo 20. Como mostrado na Figura 9, o perfil de migração de MTA2 exibidos dois picos de diferentes intensidades entre 700 kDa e 1,2 MDa, com o pico de massa mais baixa exibindo maior abundância. Outras subunidades de núcleo NURD, incluindo mta1 / 3, HDAC1 / 2 e Mbd3, apresentaram um padrão de separação idênticas, embora os picos de alguns dos sub-unidades, nomeadamente CC4, Gatad2a / b e Rbbp4 / 7, teve a distribuição abundância inversa (Figura 9A, B). Em contraste, o perfil de Cdk2ap1, um factor regulador que recruta o complexo NURD a promotores de genes Wnt 23, é indicado apenas o maior pico de massa (Figura 9C), e por isso, Sall4, um repressor transcricional que também tem sido demonstrado que se ligam NURD 20, 24, 25. Assim, o fraccionamento de proteínas associadas a MTA2 purificados por afinidade por PAGE nativa azul era capaz de resolver duas formas diferentes do complexo NURD.

    ABC-MS também permite a identificação de novos interactores enquanto atribuindo-lhes a entidades proteína particular. Através da análise dos agregados de proteínas e intensidades fracção representados num mapa de calor-se detectou uma forte correlação entre as subunidades e NURD Wdr5, uma subunidade reguladora do complexo metiltransferase MLL 26, com Wdr5 exibindo dois picos de migração coincidentes com os dois p NURDeaks (Figura 8), sugerindo uma interacção entre romance Wdr5 e NURD. Nós confirmamos essa interação por co-imunoprecipitação e co-migração na cromatografia de exclusão de tamanho 20.

    A escolha de cálculo da métrica de distância no agrupamento hierárquico irão influenciar a forma dos aglomerados e, consequentemente, as correlações. Recomendamos experimentar com as diferentes métricas para conseguir o melhor ajuste com o conhecimento interação existente da proteína ou complexo de interesse. Geralmente conseguimos melhores resultados com a Manhattan (L1) métrica de distância 20. De correlação de Pearson ou métrica de distância Euclidiana também têm sido relatados para a identificação de complexos baseados em técnicas alternativas de fraccionamento 10, 11, 12.

    a quandados titativo MS obtidos a partir das fracções nativas azul também podem ser usadas para determinar a estequiometria de complexos de proteínas. O valor iBAQ (intensidade baseado absoluto quantificação) proporciona uma medida da abundância relativa de proteínas identificadas 27, 28. Os valores iBAQ para os membros de proteínas complexas em todas as fracções dentro de um perfil de migração de pico são normalizados para que a proteína de isco para obter quantidades relativas. Os iBAQs normalizados através de um pico de perfil para um membro do complexo dada proteína deve seguir uma tendência horizontal, e os valores de tendência reflectir a estequiometria das proteínas que interagem relativos à proteína de isco. Para uma representação mais detalhada de cálculos estequiometria, ver 20.

    figure-results-1
    Figura 7: fluxo de trabalho resumindo esquemática a ABC-MS sSTRATÉGIA. Este valor é modificado a partir do 20. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    figure-results-2
    Figura 8. agrupamento hierárquico dos perfis de migração BN-PAGE de interactores MTA2. proteínas associadas a MTA2 foram agrupados com base na similaridade das suas perfis de migração. Apenas um subconjunto de o-mapa de calor contendo o complexo NURD é mostrado (fechado na caixa azul). A caixa amarela destaca a forte correlação de Wdr5 com o complexo NURD. Os pesos moleculares foram estimados a partir anotadas as distâncias de migração dos padrões de proteínas são executados no mesmo gel. Esta pesquisa foi originalmente publicado em Molecular e Celular Proteomics 20 da Sociedade Americana de Bioquímica e Mo Biologia lecular. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    figure-results-3
    Figura 9. Perfil de migração BN-PAGE de subunidades NURD e proteínas associadas. A) MTA2 e NURD subunidades presentes em um padrão de intensidade semelhante. B) MTA2 e NURD subunidades com o padrão de intensidade inversa. C) MTA2 e Cdk2ap1, que está presente apenas na entidade NURD peso molecular mais elevado. Os pesos moleculares foram estimados a partir anotados o perfil de migração dos padrões de proteínas. Esta pesquisa foi originalmente publicado em Molecular e Celular Proteomics 20 da Sociedade Americana de Bioquímica e Biologia Molecular._blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    figure-results-4
    Dados Suplementar: conjunto de dados de amostra. arquivo proteingroups.txt contendo identificações de proteínas e os valores de quantificao a partir de um experimento ABC-MS MaxQuant-derivado. Esta pesquisa foi originalmente publicado em Molecular e Celular Proteomics 20 da Sociedade Americana de Bioquímica e Biologia Molecular. Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.

    Discussão

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Aqui, nós descrevemos o uso de purificação por afinidade, seguido por electroforese em gel nativo azul em combinação com espectrometria de massa quantitativo para resolver complexos de proteínas. Esta abordagem oferece um método para desvendar listas de interacção proteína unidimensionais em conjuntos de proteínas funcionais.

    Demonstramos o método baseado na utilização de proteínas marcadas no epitopo. No entanto, se uma linha celular que expressa uma proteína marcada não está disponível, uma alternativa poderia ser a utilização de anticorpos contra a proteína de interesse, desde que haja um peptídeo disponível para conseguir a eluição competitiva nativa. A quantidade de material de partida e a quantidade de grânulos pode ter de ser modificado, dependendo do nível de expressão da proteína alvo. Nós normalmente realizar este protocolo com 2-5 x 10 8 culas a partir de material, e esta é suficiente até mesmo para proteínas com baixo nível de expressão. A composição do tampão de lise deve ser escolhida empiricamente para atingirperto de completar a solubilização da isca. Este pode ser um desafio para alguns tipos de proteínas, em particular de ligao cromatina ou proteínas de membrana. Opções alternativas incluem o aumento da quantidade de sal, desde que o complexo de proteína sob estudo é estável em elevado teor de sal, ou utilizando ultra-sons e / ou tratamento com nuclease para proteínas de ligação da cromatina 20, 29. No caso de proteínas de membrana, interrupção, detergente para DDM ou digitonina 30 pode ser aconselhável. No caso de proteínas de ligação de ADN, é útil incluir uma nuclease como a Benzonase durante o passo de purificação 20. A remoção completa de ácidos nucleicos que assegura que as interacções entre proteínas detectadas ocorrer e não são mediados por ADN.

    Um elemento crítico para considerar quando se utiliza esta abordagem é a estabilidade do complexo sob investigação. O procedimento é longo e pode envolver preservandog a proteína durante a noite complexo. Nós conseguimos o bom sucesso com dois complexos de cromatina remodelação (D. Bode e M. Pardo, dados não mostrados), mas isso deve ser avaliada. A etapa de purificação por afinidade pode ser encurtado, se necessário.

    As técnicas alternativas que permitam fraccionamento nativa, tais como a cromatografia de exclusão de tamanho, têm sido amplamente utilizados durante mais de 50 anos para caracterizar os complexos de proteínas. Nós e outros autores mostraram que a resolução de PAGE nativa azul é superior à que seria possível utilizando cromatografia de exclusão por tamanhos 20, 31, 32, 33. Outra vantagem da página nativa azul é que ele não requer sistemas de cromatografia, que são caros, mas sim usa equipamento de proteína eletroforética que é generalizada em laboratórios. Em termos de hands-on tempo, este método não envolve mais trabalho do que o tradicional GELC-MS / MS aBORDAGEM ou fraccionamento cromatográfico offline. No entanto, como a maioria das técnicas de fraccionamento fazer, ele tem um limite para a sua resolução. Complexos que são muito homogénea ou perto da massa e forma podem ser para além da resolução oferecida por PAGE nativa azul, e, portanto, do protocolo, como descrito aqui pode não ser universalmente bem sucedido na resolução de complexos distintos com subunidades partilhados. Encorajadoramente, que têm tido sucesso na separação de dois complexos tetraméricos muito semelhantes que partilham três subunidades (M. Pardo, manuscrito em preparação).

    Uma vez que a espectrometria de massa tem se tornado cada vez mais sensível, mesmo quantidades diminutas de interactores e contaminantes não-específicos podem ser detectados em amostras de AP-MS. A abordagem aqui apresentado pode auxiliar na discriminação de interactores reais a partir de contaminação de fundo na purificação por afinidade, concentrando-se a atenção sobre as proteínas com picos de migração que coincidem com os picos de migração isca em peso molecular mais elevado do que o deas proteínas monoméricas.

    Diversos grupos têm usado técnicas de fraccionamento, seguido pelo perfil correlação proteína para delinear complexos de proteína à escala celular sem a necessidade de isolamento prévio 10, 11, 12, 34. No entanto, isso pode resultar em falha para detectar interacções sub-estequiométrico. A incorporação de um passo de enriquecimento através de purificação por afinidade pode ajudar a ultrapassar esta. A abordagem aqui descrita deve ser geralmente útil para explorar a topologia de complexos de proteínas e desvendar os vários complexos de uma dada proteína participa em dentro do mesmo contexto celular. A estratégia é simples e passíveis de laboratórios que não podem ter equipamentos fracionamento cromatográfico caro para resolver complexos de proteínas.

    Divulgações

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Os autores não têm nada a divulgar.

    Agradecimentos

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Este trabalho foi financiado pelo Wellcome Trust (WT098051).

    Materiais

    Lista de materiais utilizados neste artigo
    NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
    Proteína G DynabeadsLife Technologies10003D
    FLAG anticorpo M2Sigma-AldrichF1804
    Tween-20, grau proteico, solução a 10%Millipore655206
    Dimetil pimelimidatoSigma-Aldrich80490
    0,2 M Tampão de trietanolamina, pH 8,2Sigma-AldrichT0449
    3x Peptídeo FLAGSigma-AldrichF4799
    Vivaspin 5K NMWCO, PESSartoriusVS0112
    NativePAGE 3-12% Bis-Tris gelLife TechnologiesBN1001
    20x NativePAGE Running BufferLife TechnologiesBN2001
    20x NativePAGE CatódicoAditivo Life TechnologiesBN2002
    4x Buffer de carregamento de amostra NativePAGELife TechnologiesBN2003
    NativeMARKLife TechnologiesLC0725
    NativePAGE 5% G-250 aditivo de amostra PlacaBN2004
    , polipropilenoSistema
    Multiscreen HTS Sistema de filtragem de 96 poçosThermoMSDVN6550
    Nunc tampa de 96 poços naturalThermo276002
    TCEP (cloridrato de Tris(2-carboxietil)fosfina)Sigma-Aldrich646547
    IodoacetamidaSigma-AldrichI1149
    Acetonitrila, grau HPLCFisher ScientificA/0627/17
    Tripsina, grau de sequenciamentoRoche11418475001
    MaxQuant (software)N.A.N.A.http://www.biochem.mpg.de/5111795/maxquant
    Perseus (software)N.A.N.A.http://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus
    de 96 poços de fundo cônico Nunc da Life Technologies de filtragem de 96 poços Thermo 249944

    Referências

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    Blue Native PAGEProtein Complex ResolutionAffinity PurificationProtein Correlation ProfilingMass Spectrometry AnalysisNative Gel ElectrophoresisCompetitive ElutionProtein Migration ProfilingHierarchical ClusteringSubcomplex Identification

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