Um modelo de mouse transiente Transientized IL-8 para o<em&gt; In Vivo</em&gt; Monitoramento de Longo Prazo de Respostas Inflamatórias

Resumo

O método aqui descrito permite a visualização da ativação da inflamação dependente do promotor de IL-8 nos pulmões de camundongos através de imagem de bioluminescência não-invasiva (BLI). O mesmo animal pode ser submetido a BLI várias vezes por até dois meses a partir do momento da entrega da construção repórter de luciferase.

Resumo

A inflamação das vias aéreas é freqüentemente associada a infecções bacterianas e representa um importante determinante da doença pulmonar. A determinação in vivo das capacidades pró-inflamatórias de vários fatores é desafiadora e requer procedimentos terminais, como lavagem broncoalveolar e remoção de pulmões para análise in situ , impedindo a visualização longitudinal no mesmo mouse. Aqui, a inflamação do pulmão é induzida através da instilação intratraqueal do sobrenadante de cultura de Pseudomonas aeruginosa (SN) em camundongos transitórios transgenizados que expressam o gene repórter de luciferase sob o controle de um promotor bovino de IL-8 heteróloga. A expressão da luciferase no pulmão é monitorada por análise de imagem bioluminescente in vivo (BLI) em um período de 2,5 a 48 h após a instilação. O procedimento pode ser repetido várias vezes em 2 a 3 meses, permitindo a avaliação da resposta inflamatória nos mesmos ratos comA necessidade de terminar os animais. Esta abordagem permite o monitoramento de fatores pró e anti-inflamatórios atuando no pulmão em tempo real e parece adequado para estudos funcionais e farmacológicos.

Introdução

Doenças pulmonares crônicas, como asma, doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), fibrose cística (FC) e bronquiectasias, são caracterizadas por inflamação das vias aéreas. A inflamação das vias aéreas é caracterizada por edema, infiltração celular, ativação de linfócitos T e mastócitos, aumento das secreções das vias aéreas e deposição excessiva de colágeno. A FC é uma desordem multissistêmica e sua principal causa de mortalidade e morbidade é a infecção bacteriana do pulmão com aumento da exacerbação pulmonar. O declínio da função pulmonar prevê um resultado significativamente mais desfavorável ^{1 , 2 ....}

Protocolo

Todos os experimentos com animais descritos foram aprovados pelo comité intramural de bem-estar animal para experimentação animal pelo Centro Interdepartamental de Serviço de Pesquisa Experimental na Universidade de Verona e cumprem a Diretiva Européia 2010/63 UE, D.Lgs 26/2014 italiano e a revista "Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório", Washington, DC: National Academy Press, 1996. Este protocolo e experimentação foram aprovados pelos Institutos Nacionais de Saúde (n 273/15). Os animais tinham acesso gratuito a comida de roedor padrão e água de torneira suavizada e foram acalmadas durante pelo menos 5 dias nas condições locais do viveiro (temperatura ....

Resultados

O modelo de rato transgênico transiente BIL-8-Luc foi usado para o monitoramento in vivo da inflamação pulmonar em camundongos desafiados com sobrenadante bacteriano concentrado (30x) contendo fatores de virulência segregados. A resposta inflamatória induzida foi detectada por imagem in vivo como um aumento no sinal BLI. A atividade pró-inflamatória foi claramente detectável 2,5 h pós-instilação, embora o sinal BLI atingisse o pico mais alto entre 5 e 24 h e ainda era d.......

Discussão

Em um trabalho anterior ¹¹ , mostrou-se um contraste entre os marcadores BLI e BAL dependentes de BIL-8-Luc. Baseou-se no grau diferencial de sensibilidade dentro das cepas de mouse ¹² . Por esta razão, a primeira aplicação do modelo bIL-8-Luc a uma estirpe de rato diferente requer um estudo inicial da resposta inflamatória, tanto em termos de BLI quanto em marcadores inflamatórios mais padronizados.

A transfecção de ratos causa inflamação pulm.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Sistema de Tomografia de Fluorescência FMT 2500	Perkin Elmer Inc.	Construtor
IVIS Lumina série II Pré-clínico In Vivo; Sistema de imagem	Perkin Elmer Inc.	Construtor
MMPsense 750 FAST	Perkin Elmer Inc.	NEV10001EX	Proteger da luz, armazenar a sonda a 4 &graus; C
Fêmea endogâmica BalbC	Harlan Laboratories Itália		Antes do uso, os animais foram aclimatados por pelo menos 5 dias às condições locais do biotério
plasmídeo bIL-8-Luc	Departamento de Ciências Médicas Veterinárias, Universidade de Parma, Itália		Armazene o plasmídeo a -20 ° C
pGL3vetor básico	Promega	E1751	Armazene o vetor em -20 ° Reagente de
transfecção de DNA C JetPEI Transfecção	Polyplus	201B-001G	A mistura de DNA e JetPEI foi formulada com uma relação N/P final de 7
sal de potássio D-luciferina 1 g	Perkin Elmer Inc.	122796	Proteger da luz, armazenar a -20 &graus; C
Living Image software	Caliper Life Sciences,Experimental	Builder
Isoflurane	ESTEVE spa	571329.8	Não inale
o Kit de Ensaio de Citocinas Bio-Plex	Bio-Rad Laboratories	M60-009RDPD	Guarde o kit fechado em 4 ° C
Contador de células automatizado	Dasit XT 1800J	Construtor
Experimental Modelo Penn-century DP-4M Insuflador de energia seca	Penn-century	DPM-EXT
Sistema de anestesia a gás XGI-8	Perkin Elmer Inc.	Experimental Builder
PE190 micro tubo médico	2instrumentos biológicos snc	BB31695-PE/8
Seringa sem agulha 5 mL	Terumo	SS*05SE1	Corte as tábuas do pistão com uma tesoura
Hamilton 0,10 mL (modelo 1710)	Gastight	81022
Discofix 3-way Stopcock	Braun	4095111
Seringa com agulha 1 mL	Solução Pic	3,071,260,300,320	Use sem agulha
Tubos de alimentação de plástico 18ga x 50 mm	2instrumentos biológicos snc	FTP-18-50	Corte obliquamente a ponta

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