Apresentamos aqui um método de cultura de células para a indução de transições mesenquimais-epiteliais (MET) em células de sarcoma com base na expressão ectópica combinado de microARN-200 e os membros da família grainyhead-like 2 (GRHL2). Este método é adequado para a melhor compreensão do impacto biológico de plasticidade fenotípica sobre a agressividade e tratamentos do cancro.
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Artigo de método
A indução de transições mesenquimais-epiteliais em células de sarcoma
Neste artigo
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Resumo
Resumo
plasticidade fenotípica refere-se a um fenómeno no qual as células transitoriamente ganhar traços de outra linhagem. Durante a progressão do carcinoma, plasticidade fenotípica impulsiona invasão, disseminação e metástase. Com efeito, enquanto que a maioria dos estudos de plasticidade fenotípica têm sido no contexto de carcinomas epiteliais derivadas de, verifica-se os sarcomas, os quais são mesenquimal de origem, também exibem plasticidade fenotípica, com um subconjunto de sarcomas submetidos a um fenómeno que se assemelha a um mesenchymal- transição epitelial (MET). Aqui, nós desenvolvemos um método compreendendo a família de miR-200 e grainyhead-like 2 (GRHL2) para imitar este fenómeno MET-como observado no sarcoma paciente samples.We sequencialmente expressar GRHL2 e a família de miR-200 utilizando a transdução de células e transfecção, respectivamente , para compreender melhor as bases moleculares destas transições fenotípica em células de sarcoma. células de sarcoma que expressam miR-200s e GRHL2 demonstrado characterist epitelial aumentadaics na morfologia celular e alteração de biomarcadores epiteliais e mesenquimais. Estudos futuros utilizando estes métodos podem ser utilizados para compreender melhor as consequências fenotipicas de processos MET-como sobre células de sarcoma, tais como migração, invasão, propensão metastática, e resistência à terapia.
Introdução
plasticidade fenotípica refere-se a uma transição reversível entre os fenótipos celulares, e é geralmente divididos em dois tipos, epitelial-a-mesenquimal (EMT) transições e transições mesenquimais-a-epitelial (MET). Esta plasticidade fenotípica desempenha um papel importante em processos normais de organismos multicelulares, tais como desenvolvimento e cicatrização de feridas 1; no entanto, estas mesmas vias e programas de expressão génica também pode levar a doenças, tais como fibrose (revisto em 2, 3, 4) e a metástase de carcinoma (revisto em refer....
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Protocolo
1. Preparação dos Reagentes
- Prepare DMEM para cultura de células por adição de 50 ml de soro fetal de bovino (FBS) e 5 mL de penicilina-estreptomicina (5000 U / mL) a 500 mL de meio DMEM. Este meio pode ser armazenado a 4 ° C durante até seis meses.
- Ressuspender iniciadores liofilizados em água isenta de nuclease, a uma concentração final de 10 uM. iniciadores loja re-suspenso a -20 ° C.
- Prepare ensaio de radioimunoprecipitação tampão (RIPA) (NaCl 150 mM, 0,5% de desoxicolato de sódio, 0,1% de SDS, Tris a 50 mM, pH 8,0). Suplemento com o cocktail inibidor de protease antes da utilização e manter tampão em gelo quando em utilização. Arma....
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Resultados
Esquema para a indução de MET em células de sarcoma
Uma linha do tempo geral para a indução de alterações MET-como em células de sarcoma é mostrado na Figura 1. O protocolo começa por transdução GRHL2 (Figura 1A), seguido por transfecção da família miR-200 (Figura 1B). membros da família GRHL2 ou miR-200 não foram capazes de afectar a aparência de células RD quando expressa sozin.......
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Discussão
Sarcomas são cancros raros, mas altamente agressivas de uma linhagem mesenquimal. Apesar da sua linhagem mesenquimal, um subconjunto dos sarcomas parece sofrer uma transição fenotípica para um estado mais epitelial semelhante. Este interruptor MET-like tem relevância prognóstico, como pacientes com mais tumores epiteliais, como são menos agressivos 24. Apesar da sua relevância clínica, existem poucos estudos sobre os mecanismos moleculares de condução dessas transições fenotípicas em sarcomas.
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
JAS reconhece o apoio do Instituto Duke Cancer, The Duke University Genitourinary Oncologia Laboratory, e do Departamento de Ortopedia da Universidade de Duke. HL foi apoiado pela National Science Foundation (NSF) Centro de Física Biológica Teórica (NSF PHY-1427654) e NSF DMS-1361411, e como CPRIT (Prevenção do Câncer e Instituto de Pesquisa do Texas) Scholar na Cancer Research do Estado do Texas na Universidade Rice. KEW foi apoiado pelo NIH F32 CA192630 MKJ e HL beneficiado a partir de discussões úteis com Mary C. Farach-Carson, JN Onuchic, Samir M. Hanash, Kenneth J. Pienta, e Donald S. Coffey.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Contador automatizado Countess | Life technologies | AMQAX1000 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher | A24811 | |
| Odyssey Fc | LI-COR Inc | ||
| ViiA7 Sistema de PCR em Tempo Real | Thermo Fisher | 4453536 | |
| PCR microplaca | Corning | 321-29-051 | |
| KAPA SYBR Kit de qPCR universal rápido | KAPA Biosystems | KK4602 | |
| Bloco de Partida (PBS) Buffer de bloqueio | Thermo Fisher | 37538 | BSA baseado em tampão de bloqueio |
| Agarose de Propósito Geral LE | Genesee Scientific | 20-102 | |
| 10x Tris/Glicina/SDS Buffer | Bio-Rad Laboratories Inc | 161-0732 | Tampão de corrida |
| 10x Tris/Glycine Buffer | Bio-Rad Laboratories Inc | 161-0734 | Tampão de transferência |
| RIPA Buffer | Sigma Life Sciences | SLBG8489 | |
| Amersham Protran 0.45 μ m nitrocelulose | GE Healthcare Lifesciences | 10600012 | |
| Quick-RNA MiniPrep Kit | Genesee Scientific | 11-358 | |
| Laemmli Sample Buffer (4X) | Bio-Rad Laboratories Inc | 1610747 | |
| Mini Trans-Blot Cell | Bio-Rad Laboratories Inc | 1703930 | |
| Mini-Protean Tetra Cell | Bio-Rad Laboratories Inc | 1658005EDU | |
| DPBS | Life technologies | 14190-144 | |
| 0,05% Tripsina-EDTA | Life technologies | 11995-065 | |
| DMEM | Life technologies | 11995-065 | |
| Lipofectamina RNAi Max | Thermo | Fisher 13778150 | |
| Lipofectamina 2000 Ragents | Thermo Fisher | 11668019 | |
| Penicilina Estreptomicina | Life technologies | 15140-122 | |
| miRVana miRNA miRNA miMImímica controle negativo #1 | Thermo Fisher | 4464058 | neg miRNA |
| tem-miR-200 mirVana miRNA miRNA miMímica | Thermo Fisher | 4464066 | miR200A |
| tem-miR-200 mirVana miRNA miRNA imita | Thermo Fisher | 4404066 | miR200B |
| tem-miR-200 mirVana miRNA imita | Thermo Fisher | 4404066 | miR200C |
| Opti-MEM | Life technologies | 11088-021 | meio sem soro |
| anticorpo anti-Ecadherin | BD Bioscience | 610182 | |
| anti-beta actina | Santa Cruz Biotechnology | sc-69879 | |
| anti-EpCam | Ab Serotec | MCA18706 | |
| anti-ZO1 | Invitrogen | 402200 | |
| IRDye 800W | LI-COR Inc | 925-32210 | |
| IRDye 680 | LI-COR Inc | 926-32223 | |
| anti-mouse AlexaFluor 647 | Thermo Fisher | A211241 | |
| anti-coelho AlexaFluor 647 | Thermo Fisher | ab150075 | |
| Halt Protease e Inibidor de Fosfatos | Thermo Fisher | 1861281 | |
| Precision Plus Protein Dual Color | Bio-Rad Laboratories Inc | 161-0374 | |
| Partec CellTrics | Sysmex | 04-004-2326 | 30 μ m filtro para fluxo |
| GAPDH-F | IDT | AGCCACATCGCTCAGACAC | |
| GAPDH-R | IDT | GCCCAATACGACCAAATCC | |
| Ecadherin-F | IDT | TGGAGGAATTCTTGCTTTGC | |
| Ecadherin-R | IDT | CGCTCTCCTCCGAAGAAAC | |
| ZEB1-F | IDT | GCATACAGAACCCAACTTGAACGTC | |
| ZEB1-R | IDT | CGATTACACCCAGACTGC | |
| NOTCH-F | IDT | GGCAATCCGAGGACTATGAG | |
| NOTCH-R | IDT | CTCAGAACGCACTCGTTGAT | |
| nitro azul tetrazólio | Brometo | N5514 | |
| Seringa de 3 mL | Sigma | ||
| Filtro de seringa estéril | VWR | 28145-505 | |
| Tubo de fundo redondo de polipropileno de 5 mL Tubos de | citometria de fluxo | 352063 | |
| transcrição reversa de cDNA de alta capacidade | Thermo Fisher | Kit de | transcrição reversa |
| 4368814 4% paraformaldiídeo | Santa Cruz Biotechnology | sc-281612 | |
| Triton-X100 | Sigma | 93443 | |
| albumina de soro bovino | Sigma | A7906 |
Referências
- Weber, C. E., Li, N. Y., Wai, P. Y., Kuo, P. C. Epithelial-mesenchymal transition, TGF-beta, and osteopontin in wound healing and tissue remodeling after injury. J Burn Care Res. 33 (3), 311-318 (2012).
- Galichon, P., Finianos, S., Hertig, A. ....
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Reimpressões e permissões
Errata
Formal Correction: Erratum: Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells
Posted by JoVE Editors on 7/03/2018. Citeable Link.
An erratum was issued for: Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells. An author name was updated.
One of the authors' names was corrected from:
Shenghan Xu
to:
Shengnan Xu
