Summary
Selectivamente marcado fluorescente GnRH-I, -II e -III derivados são ferramentas confiáveis para acompanhar e quantificar a sua captação celular. Este manuscrito apresenta experiências para visualizar, quantificar e comparar a eficiência de absorção destes conjugados da GnRH em várias linhas celulares.
Abstract
análogos de GnRH são porções de direccionamento eficaz e capaz de entregar agentes anticancerígenos seletivamente em células tumorais malignas quais os receptores GnRH altamente expresso. No entanto, a análise quantitativa de captação celular análogos de GnRH 'e os tipos de células investigadas em sistemas de entrega de medicamentos à base de GnRH são actualmente limitada. Previamente introduzido, fluorescente marcado selectivamente GnRH I, -II e -III derivados fornecem grande detectabilidade, e eles têm propriedades químicas adequadas para experiências reprodutíveis e robustas. Descobrimos também que os métodos apropriados up-to-date com estes análogos de GnRH rotulados poderia oferecer novas informações sobre os sistemas de entrega de medicamentos à base de GnRH. Este manuscrito apresenta algumas experiências simples e rápido sobre a absorção celular de [D-Lys6 (FITC)] - a GnRH-I, [D-Lys6 (FITC)] - a GnRH-II e [Lys 8 (FITC)] - GnRH -III na EBC-1 (pulmão), o BxPC-3 (pâncreas) e na Detroit-562- (faringe) T malignaUmor células. Em paralelo com estes conjugados da GnRH-FITC, o nível da superfície celular de receptores de GnRH-I também foi examinada com estas linhas de células antes e após o tratamento com GnRH por microscopia confocal de varrimento laser. A absorção celular de conjugados da GnRH-FITC foi quantificada por separação de células activadas por fluorescência. Nestas experiências foi observada pequenas diferenças entre os análogos do GnRH e as principais diferenças entre os tipos de células. As diferenças significativas entre as linhas de células são correlacionados com o seu nível distinto de receptores de superfície celular GnRH-I. Os experimentos introduzidas contêm métodos práticos para visualizar, quantificar e comparar a eficiência de absorção de conjugados de GnRH-FITC em um tempo e forma dependente da concentração em várias culturas de células aderentes. Esses resultados poderiam predizer a eficácia da segmentação de drogas de conjugados de GnRH na cultura celular dado, e oferecem uma boa base para novas experiências no exame dos sistemas de entrega de medicamentos à base de GnRH.
Introduction
Sistemas de entrega de drogas específicas base de péptidos tornaram-se um desenvolvimento rápido e a área promissor na terapia do cancro ao longo dos últimos anos um, 2. Gonadotropina humana tipo I libertando receptor da hormona (GnRH-IV) situa-se principalmente na glândula pituitária, mas também está presente em vários outros tecidos que são responsáveis por auto-reprodução 3. GnRH-IV é também expressa num número de tecidos de cancro, relacionada ou não com o sistema reprodutivo 4, 5. A expressão elevada de GnRH-IR em várias células de tumores malignos em comparação com tecidos saudáveis fornece uma oportunidade para terapia alvo 5, 6.
Muitos hormona libertadora de gonadotropina (GnRH) análogos têm sido desenvolvidos nas últimas décadas, que poderiam ser utilizados como porções de direccionamentof "> 7, 8, 9. Estes péptidos são capazes de entregar agentes anticancerígenos com elevada selectividade para as células tumorais malignas que sobre-expressa a GnRH-IV 6. Vários fármacos anti-tumorais conjugados da GnRH com maior selectividade e maior eficiência do que o não conjugado correspondendo livre de drogas foram relatados 7, 8, 9.
Publicações anteriores cerca de péptidos da GnRH e seus receptores relatado que a GnRH-IR pode assumir várias conformações diferentes que têm selectividade para GnRH análogos 10. A GnRH-IR altamente variável tem complexos e várias vias de sinalização são dotados de actividade diferente contra os seus ligandos naturais e artificiais 11. Estes fatos fazem investigação de sistemas baseados em GnRH desafiador. Por outro lado, o y possuem potencial terapêutico promissor. Várias experiências com péptidos GnRH radiomarcados foram anteriormente relatados 12, 13, 14, 15, mas experimentos nos quais foram usados análogos de GnRH fluorescente etiquetado ainda são limitados. Enquanto marcação radioactiva oferece alta sensibilidade, marcação fluorescente tem várias outras vantagens, por exemplo, o manuseio mais fácil, ea capacidade de contracoloração com diferentes fluoróforos. Três análogos de GnRH comuns que têm sido utilizados com sucesso para a entrega de drogas são a [D-Lys6] -GnRH-I, [D-Lys6] -GnRH-II e III-GnRH, mas a eficácia destes péptidos como porções de direccionamento é raramente comparado 16, 17. Por outro lado, os resultados obtidos em experiências separadas em que foram utilizadas células de cancro diferentes e os análogos da GnRH é diversa.
ntent "> Com base nestas considerações, nós nos concentramos em que o tumor alvo e potencial de entrega da droga destes péptidos GnRH e, assim, sintetizada e caracterizada a [D-Lys 6 (ITCF)] - GnRH-I, [D-Lys 6 (FITC )] - a GnRH-II e [Lys 8 (FITC)] - conjugados peptídicos de GnRH-III 18 Estes análogos são marcados selectivamente com FITC na cadeia lateral do seu (razão de péptido-FITC Lys ou D-Lys 1: 1 em cada um. conjugado). a ideia era que a marcação fluorescente seletivo pode oferecer novas informações sobre esses peptídeos, e permite que sua boa localização e quantificação confiável. estes conjugados têm um manuseamento seguro e detecção confiável, o que tornará mais fácil para comparar sua eficiência segmentação tumor, ea triagem de numerosos tipos de células tumorais malignas. esperamos que up-to experimentos data com estes conjugados peptídeo poderia contribuir para o desenvolvimento de câncer de romance alvo conjugados GnRH-drogas, e ajudar a identificar novos tar terapêuticafica bem.O presente artigo propõe demonstrar algumas experiências bem reprodutíveis e rápidos com conjugados de GnRH-FITC. A expressão na superfície celular da GnRH-R é uma condição determinante sobre a absorção de GnRH, por isso investigado simultaneamente o nível da superfície celular da GnRH-IR sobre as linhas de células testadas. Nós visualizados os conjugados da GnRH-IR e GnRH-FITC por microscopia confocal de varrimento laser (CLSM) e quantificado a absorção celular de conjugados da GnRH-FITC utilizando células activadas por fluorescência (FACS).
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Protocol
1. Preparação de Culturas de Células e Reagentes
- Manter as culturas de células em meio recomendado pelo fabricante, suplementado com 10% (v / v) de soro fetal bovino e antibióticos (meio completo chamado). Manter o frasco de cultura de células numa atmosfera humidificada, 5% de CO2 incubadora a 37 ° C. Seguir a proliferação de células de confluência e por microscópio invertido (usando 10X objectiva de contraste de fase).
- Quando as células atingem a confluência adequada, remover o meio, e lava-se a cultura com 2-3 ml, estéril tamponada de fosfato-salina (PBS). Remover o PBS e adicionar 0,5 mL, solução estéril de 0,25% de tripsina-EDTA para a cultura de células e incubar a 37 ° C até que as células de separar (aproximadamente 10 min).
- Suspender as células em 3-4 mL de meio completo estéril para parar tripsina e transferi-los para um tubo de centrífuga estéril. Centrifugar as células a 150 xg durante 4 minutos à temperatura ambiente (TA). Descartar o sobrenadante com cuidado e suspender o pEllet em 2-3 mL de meio completo estéril.
- Retire 100 uL da suspensão de células e misturar-se com 100 uL de 0,4% (m / V) de tripano azul solução, para corar as células mortas. Carga de 10 ul desta mistura em um hemocitómetro e determinar o número de células viáveis por microscópio invertido.
- Dilui-se a quantidade necessária de suspensão de células preparada no Passo 1.3 até 10 mL com meio completo estéril, contendo 4 x 10 4 células / mL.
- Adicionar 250 uL de suspensão de células (preparado no passo 1.5) por poço (10 4 células / cavidade) em sete poços do primeiro vidro de fundo de 8 poços lâmina de microscópio. Use este slide no método de captação de GnRH.
- Adicionar 250 uL de suspensão de células (preparado no passo 1.5) por poço (10 4 células / cavidade) em cinco poços da segunda corrediça de 8 poços microscópica. Esta corrediça vai ser utilizada no método de expressão do GnRH-IR.
- Adicionar 1 mL de suspensão de células (preparado no passo 1.5) por poço (4 x 10 4 células / cavidade) em sete WELsl de uma placa de 12 poços. Esta placa irá ser utilizado no método de quantificação de GnRH.
- Deixe as células aderir sobre as duas lâminas de microscopia e a placa. Incubar-los numa atmosfera humidificada, 5% de CO2 numa estufa a 37 ° C durante 48 h.
- Após a incubação de verificar as células por microscópio invertido (usando 10X objectiva de contraste de fase). Se as células são saudáveis e anexado, continue com os seguintes passos.
- Preparar solução mãe de 10 mM a GnRH-FITC em dimetil sulfóxido (DMSO) a partir de cada um dos três conjugados de 18. (Utilize estas concentrações de diluição: 16,43 mg / mL [D-Lys 6 (ITCF)] - GnRH-I, 16,97 mg / mL [D-Lys 6 (ITCF)] - GnRH-II e 16,47 mg / mL [Lys 8 ( FITC)] - GnRH-III) Manter estas soluções estoque em um local escuro à temperatura ambiente e usá-los dentro de algumas semanas.
- Diluir 1,7 mL de cada uma das três soluções de estoque 10 mM de GnRH-FITC em 1,7 ml de meio completo. Agitar estas soluções. (Tse são a 10 uM GnRH-FITC tratamento de meios.) Diluir 150 uL cada uma das três 10 uM de GnRH-FITC meio de tratamento de 1,35 ml de meio completo. Agitar estas soluções, bem como (estas são a 1 uM a GnRH-FITC meio de tratamento).
NOTA: Todos GnRH-FITC contendo meio de tratamento deve ser protegido da luz e usou-se dentro de poucos h. - Pré-aqueça o seis GnRH-FITC meio de tratamento (preparado no passo 1.12) e 4 ml de meio completo a 37 ° C.
- Dilui-se 3 mL de solução de sonda fluorescente a 5 mM (de contraste nuclear mencionado na Lista de Materiais) em 3 mL de PBS a 5 uM. Esta solução deve ser protegido da luz, mantê-lo à temperatura ambiente e usá-lo dentro de algumas horas.
2. Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM)
- Método de captação de GnRH
- Tome a primeira lâmina de microscópio, preparada no passo 1.6 e pipeta o meio completo de cada um dos sete também. Adicionar 250 mL de medi completo pré-aquecidoUM para o primeiro poço. Usar isso como controlo negativo. Adicionar 250 mL de pré-aquecido a GnRH-FITC tratamento de meios (de 1,13) para cada um dos próximos seis poços (3 poços com 1 uM e 3 com 10 uM). Incubar a lâmina numa atmosfera humidificada, 5% de CO2 incubadora a 37 ° C durante 5 h.
- Pipetar a meio de cada poço e lava-se as células com 250 uL de PBS. Adicionar 250 uL de solução de fixação (10% de formalina tamponada neutra) a cada poço e incubar a corrediça à TA, durante 10 min.
- Pipetar a solução de fixação a partir de cada cavidade e lavar as células com 250 uL de PBS. Adicionar 250 uL de PBS contendo 5 uM solução de sonda fluorescente preparado no passo 1.14 a cada poço e incubar a corrediça à TA, durante 10 min.
- Pipetar a solução de sonda fluorescente de cada poço, e lavar as células duas vezes com 250 ul de PBS com cuidado. Adicionar 3-4 gotas de meio de montagem em cada poço, finalmente. Mantenha o slide no escuro à temperatura ambiente, até que a imagem.
- Método de expressão do GnRH-IR
- Aqui a segunda lâmina de microscópio, de 8 poços preparado no passo 1.7 e pipetar para a forma completa a partir de cada um dos cinco poços.
- Adicionar 250 mL de meio completo pré-aquecido no primeiro poço, use esta como controle negativo. Adicionar 250 mL de meio completo pré-aquecido no segundo poço também, e usar isso para examinar expressão GnRH-IR antes do tratamento GnRH.
- Adicionar 250 uL de cada uma das três pré-aquecido 10 uM meios tratam a GnRH-FITC para os próximos três poços. Use esses poços para pré-tratamento das células com conjugados de GnRH-FITC antes de examinar a expressão GnRH-IR. Incubar a lâmina numa atmosfera humidificada, 5% de CO2 incubadora a 37 ° C durante 1 h.
- Pipetar para fora do meio de tratamento a partir de cada um dos três poços, que vai ser utilizado para examinar a expressão de GnRH-IR após o tratamento com GnRH e lavar estes poços com 250 uL de meio completo pré-aquecido. Adicionar 250uL de meio completo pré-aquecido em cada um dos três poços. Incubar a lâmina numa atmosfera humidificada, 5% de CO2 incubadora a 37 ° C durante 1 h.
- Pipetar para a forma de cada um dos cinco poços e lava-se as células com 250 uL de PBS. Adicionar 250 uL de solução de fixação a cada poço e incubar a corrediça à TA, durante 10 min.
- Pipetar a solução de fixação a partir de cada cavidade e lavar as células com 250 uL de PBS. Adicionar 250 uL de PBS contendo albumina de soro bovino a 5% (BSA) em solução de bloqueio a cada poço e incubar a corrediça à TA, durante 1 h.
- Diluir 10 uL de anticorpo primário GnRH-IV em 1 mL de PBS (1: 100 ratio). Mantê-lo à temperatura ambiente e usá-lo dentro de algumas horas.
- Pipetar para fora a solução de bloqueio de BSA a partir de cada cavidade, excepto o controlo negativo (primeira cavidade). Lavam-se as células com 250 ul de PBS (excepto o controlo negativo). Adicionar 250 uL de PBS contendo anticorpo primário GnRH-IV preparado no passo 2.2.7 em EACh poço (excepto o controlo negativo). Incubar a lâmina à TA, durante 1 hora, num local escuro.
- Diluir 2,5 mL de anticorpo secundário marcado Alexa 546 em 1,25 ml de PBS (1: 500 ratio).
NOTA: Esta solução deve ser protegido da luz, mantê-lo à temperatura ambiente e usá-lo dentro de algumas horas. - Pipeta soluções de cada um dos cinco poços e lava-se as células com 250 uL de PBS. Adicionar 250 uL de PBS contendo 546 AF anticorpo secundário marcado, preparado no passo 2.2.9 em cada poço. Incubar as lâminas à temperatura ambiente, durante 1 h na escuridão.
- Pipetar a solução de cada cavidade e lavar as células com 250 uL de PBS. Adicionar 250 uL de PBS contendo 5 uM solução de sonda fluorescente preparado no passo 1.14 a cada poço e incuba-se a lâmina durante 10 min, à RT.
- Pipetar a solução de sonda fluorescente de cada cavidade e lavar as células duas vezes com 250 ul de PBS com cuidado. Adicionar 3-4 gotas de meios de montagem para cada poço, depois. Mantenha o slide no escuroà temperatura ambiente até a imagem microscópica.
- imagiologia
- Imagem as células por confocal invertido microscópio de varredura a laser (usando 63X objetiva de imersão em óleo)
- Use as seguintes comprimentos de onda de excitação / emissão. conjugados GnRH: 488/514 nm, anticorpo marcado Alexa 546: 488/546 nm (uso apenas para o método de expressão GnRH-IR), DRAQ5 sonda fluorescente: 633/680 nm.
- Configurar os parâmetros de imagem usando as células de controlo negativo. Use esses parâmetros para células de imagem tratada (Figura 3). Re-ajustar parâmetros de imagem em cada lâmina de microscópio, no início da análise. Aperfeiçoar e exportar as imagens com o software fornecido pelo fabricante, se necessário.
- Imagem as células por confocal invertido microscópio de varredura a laser (usando 63X objetiva de imersão em óleo)
3. celular activada por fluorescência (FACS)
- Método de quantificação de GnRH
- Pegue a placa preparado no passo 1.8 e pipeta o meio completo da EACH dos sete poços. Adicione 1 mL de meio completo pré-aquecido no primeiro poço. Usar isso como controlo negativo. Adicionar 1 mL de cada uma das seis pré-aquecido tratamento de imagens (3 poços com 1 uM e 3 poços com 10 ^ M) para os próximos seis poços. Incubar a placa numa atmosfera humidificada, 5% de CO2 incubadora a 37 ° C durante 5 h.
- Pipetar a meio de cada poço. Lavar as células duas vezes com 2 mL de PBS com cuidado. Adicionar 500 ul de solução de tripsina-EDTA em cada poços. Incubar a placa a 37 ° C até que as células de separar (aproximadamente 10 min).
- Adicionar 1 ml de meio completo a cada poço para parar a tripsina. Agitar a placa. Suspender as células suavemente com uma pipeta, e transferir a suspensão de cada cavidade para tubos FACS. Centrifugar os tubos a 150 xg durante 4 min, a 4 ° C.
- Derrama o sobrenadante cuidadosamente, com um movimento. Adicionar 500 uL de PBS arrefecido em gelo a cada tubo de FACS e gentilmente re-suspender as células. Manter os tubos em gelo até ao fimda experiência.
- Análise e cálculo
- Analisar as células por citometria de fluxo. Por excitação, utilizar a 488 nm de comprimento de onda do laser de árgon e utilizar para a detecção de comprimento de onda de 530 nm. Configure o citômetro de fluxo parâmetros executando as células de controlo negativo. Usar estes parâmetros para analisar as células tratadas (Figura 4A). Avaliar os dados com o software do fabricante, determinar os valores de média intensidade de fluorescência (MFI), e calcular os valores relativos das IFM.
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Representative Results
Imagens obtidas por microscopia confocal de varrimento laser (CLSM) oferecem informações espetacular sobre a absorção de conjugados de GnRH-FITC na cultura de células dada em um tempo e forma dependente da concentração. Em paralelo com estes conjugados da GnRH-FITC, a presença da GnRH-IV na superfície da célula, também é verificável pela experiência CLSM. Além disso, usando uma sonda fluorescente de ADN de coloração vermelho-extremo, é possível contracoloração os núcleos de células além de GnRH e da GnRH-IR. No entanto, enquanto a imagem confocal não é quantificável, o simples "método de absorção de GnRH" pode facilmente estimar se as células testadas conter maior ou menor quantidade de conjugados da GnRH-FITC. Os conjugados aplicados GnRH-FITC, e as suas concentrações, o tempo do tratamento é variável, neste método, como necessário. Como mostrado na Figura 1 as células cancerosas diferentes contêm diferentes níveis da GnRH-FITC de uma forma dependente da concentração. O avançado "método de expressão do GnRH-IR" descreve a visualização da superfície celular de GnRH-IR por imunocitoquímica, antes e depois do tratamento com GnRH-FITC. Na primeira parte deste método (antes do tratamento com GnRH-FITC), que visualiza a GnRH-IR por imunocitoquímica, sem tratamento com GnRH-FITC. Na segunda parte do presente método (depois do tratamento com GnRH-FITC), que o tratamento de células durante 1 h com 10 ^ M de GnRH-FITC. Após o tratamento, incubar as células em meio completo durante mais 1 h e visualizar a GnRH-IR por imunocitoquímica. Como mostrado na Figura 2A, as células cancerosas diferentes exibem diferentes níveis de GnRH-IR na sua superfície antes do tratamento com GnRH-FITC. Tal como mostrado na Figura 2B, após o tratamento com GnRH-FITC, a GnRH-IR células expressando manter (-562 Detroit) nível de GnRH-IV (EBC-1) ou o aumento nas suas membranas. Neste ponto, note que nós já confirmou que BxAs células PC-3 também expressam a GnRH-IV, mas não apresentá-lo na sua membrana 18. GnRH-IR pode ser visualizada no interior das células BxPC-3 por imunocitoquímica se as suas membranas são permeabilizadas. Este fenómeno explica a relativamente baixa eficiência de absorção GnRH das células BxPC-3. Com base nestes declaração nos concentramos apenas na superfície celular GnRH-IR aqui. Comparando a Figura 1 a Figura 2 confirma que o nível da superfície de células a GnRH-IR se correlaciona com a quantidade de GnRH-FITC nas células correspondentes. Além disso, a Figura 3C esclarece que a GnRH-FITC é internalizado em células, porque a localização da GnRH-FITC é separado a partir do sinal de superfície de células a GnRH-I-viga 1 h do tratamento com GnRH-FITC. Conclui-se que "método de expressão GnRH-IR" apoia as informações obtidas a partir do "método de captação de GnRH".
É importante o uso de conjunto bem ajustadoinclinações em durante a imagiologia. Tal como ilustrado na Figura 3A, no comprimento de onda de emissão de FITC (514 nm) e o anticorpo secundário marcado fluoroforo (546 nm), as células de controlo não tratadas negativos também têm uma ligeira autofluorescência. Esta fluorescência indesejada pode proporcionar resultados falsos positivos. Deste modo, no início do gerador de imagens, é importante ajustar a intensidade da fluorescência nas células de controlo como mostrado na Figura 3B. Espera-se que um sinal claro irá observar dos núcleos no comprimento de onda de emissão do corante nuclear (680 nm), com o sinal de fluorescência para os outros dois comprimentos de onda é apenas visível ou próximo de zero. Todas as outras amostras de células deve ser trabalhada com estes parâmetros de bem-ajustadas e fixas. Desta forma, o sinal observado a 514 nm é derivado a partir do sinal de apenas FITC-GnRH, a 546 nm, a partir do sinal de GnRH-IR em particular e a 680 nm, a partir do sinal de núcleos, conforme mostrado na Figura 3C. Imagens poderia ser fine-ajustado após a imagem usando o software, se necessário.
A citometria de fluxo oferecem informação quantificável experiências sobre a quantidade de conjugados da GnRH-FITC que foram absorvidos pelas células. Os conjugados da GnRH-FITC aplicadas, as suas concentrações e o tempo de tratamento também são variáveis neste método, conforme necessário. As células não tratadas são utilizados como controlo negativo para ajustar o fluxo de citometria de parâmetros e para determinar a sua intensidade de fluorescência média (IFM) no início da análise. Como ilustrado na Figura 4A o MFI foi determinada para cada amostra utilizando os mesmos parâmetros. Os valores relativos de MFI são calculados a partir dos valores de MFI, utilizando a fórmula de cálculo na Figura 4B. Utilizando esta fórmula, o valor MFI em relação às células de controlo é sempre zero. Os valores de MFI relativo calculado quantificar a intensidade de fluorescência dos conjugados de FITC-GnRH, que são proporcionais ao seu umverage concentrações nas células. Tal como ilustrado na Figura 5, com estes dados, pode-se demonstrar e comparar a eficiência com que estas células cancerosas ocupam os conjugados da GnRH-FITC. Assim, os resultados obtidos por citometria de fluxo complementar e apoiar as imagens obtidas por microscopia confocal.
Figura 1: imagens confocal do tratado e do [Lys 8 (ITCF)] - GnRH-III trataram células cancerosas. mancha azul: núcleos; mancha verde: [Lys 8 (ITCF)] - GnRH-III. Estas imagens são obtidas usando o "método de captação de GnRH". (A) Os sinais de fluorescência das células não tratadas são ajustados para perto de zero a 514 nm (verde) em cada linha celular. O DRAQ5 sonda fluorescente far-vermelho é utilizado para corar os núcleos das células. (B) Depois de aplicar as configurações, o câncer de pulmão e EBC-1 humano Detroit-562células de câncer da faringe mostrar detectável, mas baixo sinal a 514 nm (verde) após 5 h de tratamento com 1 mM [Lys 8 (ITCF)] - GnRH-III. (C) após 5 h de tratamento com 10 uM [Lys 8 (FITC)] - a GnRH-III, cada uma das três linhas de células presentes sinal fluorescente superior. Os resultados desta experiência sugerem que os BxPC-3 de células de cancro do pâncreas levou-se GnRH-FITC com muito menor eficácia, em comparação com as outras duas linhas de células que são facilmente segmentado pelos conjugados da GnRH. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: As imagens confocais de superfície celular de GnRH-IR antes e depois de [D-Lys6 (FITC)] - a GnRH-I tratamento. mancha azul: núcleos; mancha verde: [D-Lys 6 (ITCF)] - GnRH-I; mancha vermelha : GnRH-IR. Estas imagens são geradas usando o "método de expressão GnRH-IR". (A) Antes do tratamento GnRH-FITC, células BxPC-3 não tem GnRH-IR na membrana, no entanto EBC-1 células apresentam alto, e certas células Detroit-562 apresentam nível moderado de GnRH-IR. (B) Após o tratamento GnRH-FITC, células BxPC-3 ainda não apresentam GnRH-IR na sua membrana. células EBC-1 mantêm a sua expressão GnRH-IR e a GnRH-FITC aparece dentro deles. células de Detroit-562 parece ser exibindo maior nível de GnRH-IR após o tratamento e tomam-se GnRH-FITC, como bem. Esta experiência revela que diferentes tipos de células de tumores malignos exibem diferentes níveis da GnRH-IR na sua superfície, e a absorção de GnRH-FITC parece estar estreitamente relacionada com a expressão da GnRH-IR da superfície celular. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: imagens confocal de células EBC-1 do cancro do pulmão. mancha azul: núcleos; mancha verde: [Lys 8 (ITCF)] - GnRH-III; mancha vermelha: GnRH-IR. Estas imagens são feitas pelo "método de expressão do GnRH-IR". (A) células expostos do controlo negativo (sem GnRH-FITC e Alexa 546) têm de fluorescência detectável e indesejada a 514 nm e 546 nm ao usar as configurações do instrumento over-amplificados. (B) Ajustar as configurações do instrumento sobre as células de controlo negativo não tratados, o verde (514nm) e vermelho sinal (546 nm) é quase zero. (C) parâmetros ajustados resultar em sinais claros e confiáveis para a GnRH-FITC tratada e GnRH-IR células coradas. Após o tratamento com GnRH-FITC, a localização da GnRH-FITC (verde) é separado a partir da superfície celular de GnRH-IV (vermelho).529fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Avaliação de citometria de fluxo de dados. (A) Histograma do não tratado e as células de Detroit-562 tratados. valores de MFI das amostras de células são determinadas a partir do histograma. O eixo x representa a intensidade de fluorescência de células, e o eixo y representa as contagens. linha preta: MFI antes do tratamento com GnRH-FITC; linha pontilhada verde: MFI após o 5 h de tratamento com 1 mM [Lys 8 (ITCF)] - GnRH-III; linha tracejada vermelha: MFI após o 5 h de tratamento com 10? M [Lys 8 (ITCF)] - GnRH-III. (B) Fórmula de cálculo de valores relativos das IFM. Os valores relativos de MFI são calculados a partir dos valores de MFI. Usando este cálculo, o valor MFI relativa da amostra de controlo não tratada é sempre zero. o relat ive valores de MFI das amostras tratadas representam a quantidade de conjugados da GnRH-FITC, que estão dentro das células. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Os valores relativos das IFM de células cancerosas após 5 h de tratamento com 1 mM de conjugados de GnRH-FITC. Os valores das IFM relativas são comparáveis e definir o grau de eficiência dos tipos de células dadas poderia levar até análogos do GnRH. As células não exibindo BxPC-3 GnRH-IR contêm apenas vestígios destes análogos de GnRH. A GnRH-IR expressar EBC-1 células de câncer de pulmão conter moderada e as células cancerosas faringe Detroit-562 contêm grande quantidade de análogos de GnRH. Os resultados são apresentados como média ± DP, n = 3."_blank"> Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
As experiências aqui descritas usar análogos de GnRH marcadas seletivamente para o rastreio aderente culturas de células in vitro. A microscopia confocal e métodos de citometria de fluxo são adequados para controlar e quantificar a absorção celular destes conjugados da GnRH-FITC em um momento e de modo dependente da concentração. Estas experiências têm os seguintes passos críticos: 1) manter uma cultura de células estéril e saudável; 2) péptidos GnRH deve ser de elevada qualidade; 3) concentrações razoáveis e tempos de incubação devem ser seguidas; 4) tratamento e passos de lavagem; 5) bem ajustado configurações do instrumento.
As células são mantidas em meio recomendado pelo fabricante suplementado com 10% (V / V) de soro fetal bovino e antibióticos (meio completo). As células devem ser mantidos e tratados em um ambiente estéril até que as etapas de tratamento (com conjugados GnRH-ITCF). Antes dos experimentos, verifique as células utilizando um microscópio invertido. Eles devem ser saudável, Em anexo e deve atingir as quantidades necessárias.
É importante a utilização de péptidos da GnRH com alta qualidade e pureza. Nós sintetizado esses peptídeos e purificou-los para mais de 98% 18. O péptido pode ser armazenado a -25 ° C num frigorífico de um pó liofilizado. As soluções de estoque 10 mM GnRH-FITC em DMSO deve ser mantido em um local escuro em temperatura ambiente e usado para cima dentro de algumas semanas. Foi investigada a estabilidade destes conjugados e descobriu que eles são estáveis em DMSO e a sua intensidade de fluorescência são mantidas após 1 mês de armazenamento adequado. A concentração dos conjugados da GnRH-FITC e o tempo de tratamento são variáveis nestas experiências, o que oferece grandes vantagens, mas com certas limitações (ver abaixo). As concentrações aplicadas e tempos de incubação neste protocolo são apenas recomendações, mas eles fornecem uma boa base para os experimentos iniciais.
experimentos CLSM exigem cortarpassos de lavagem al. Estes passos devem ser realizados com cuidado. Não transferir o líquido diretamente sobre as células. Em vez disso, use o lado ou canto dos poços para esta finalidade. Isso pode minimizar lavando e perder as células aderidas. Também é recomendado para evitar a luz direta durante todo o experimento, uma vez que pode dessensibilizar as amostras fluorescentes (efeito fotodegradação). Mantenha as amostras tratadas em um local escuro ou coberto com um pedaço de folha de alumínio durante o experimento. Com base nos resultados anteriores, percebemos que a concentração final de DMSO na mídia tratamento aplicado é insignificante (0,1% (V / V) DMSO na mídia tratamento de 10 mM) e não tem efeito nos resultados, meio completo, assim, DMSO-livre é também adequados como controlo negativo.
É importante a utilização de parâmetros do instrumento bem ajustados durante os experimentos CLSM e FACS. Estes parâmetros precisam ser re-calibrados em cada tipo de célula, antes de ambas as análises. No experimento CLSM, o Siintensidade nal de imagens confocal depende dos seguintes parâmetros: intensidade do laser, ganho de detector e deslocamento, e tamanho pinhole. Ao ajustar esses parâmetros, use a menor potência do laser para produzir uma imagem aceitável e evitar a fotodegradação. Definir os parâmetros de imagem para ajustar a fluorescência das células de controlo negativo não coradas para perto de zero (Figura 3B) de fundo. Imagem células tratadas com estes parâmetros ajustados para evitar resultados positivos falsos. Sinais adicionais emitidos a partir de células tratadas a 514 nm e 546 nm contêm as informações necessárias sobre GnRH ou GnRH-IR. Estes passos exigem experiência nos experimentos CLSM. No experimento FACS, criar um gráfico padrão para a frente de dispersão do lado de dispersão (escala linear) e tensões definidas para corrigir a população célula viva principal no meio da trama. Desenhe uma região em torno de células vivas. Criar um histograma, defina abscissa para canalizar um (FL1-530 nm, escala logarítmica) e definir a região previamente definida como uma portapara este histograma. Definir tensão FL1 para trazer o sinal de células de controlo negativo não coradas sob 10 1 (Figura 4A). Analise as células tratadas com estes parâmetros ajustados.
Além disso, é importante para verificar o estado micoplasma das culturas de células ao longo do tempo. Vários ensaios estão disponíveis para este fim. No caso de positividade micoplasma, células descartar e começar a trabalhar com uma nova cultura. Recomenda-se utilizar uma mistura de antibióticos no meio de cultura, que é optimizada para evitar a micoplasma. A concentração aplicada de conjugados da GnRH-FITC, e o tempo de tratamento são variáveis nestas experiências, no entanto aplicar baixas concentrações e tempos de incubação curtos pode resultar em sinais muito fracos para detecção de fluorescência.
Quando imagiologia da GnRH-IR em paralelo com os análogos da GnRH, a concentração maior de GnRH-FITC é recomendada (10 uM é ideal). A razão para a concentração mais elevadaé o tempo de incubação curto (1 hora) e o sinal de fluorescência relativamente elevada do anticorpo marcado, em comparação com os conjugados da GnRH-FITC. Por outro lado, uma pequena sobreposição entre as duas emissões de corante fluorescente (514 nm e 546 nm) foi encontrado, o que ocorre apenas a 546 nm e é derivado a partir do sinal de conjugados da GnRH-FITC. No entanto, o sinal de fluorescência relativamente mais elevada de Alexa 546 e os parâmetros bem ajustadas pode minimizar este efeito, tal como demonstrado na Figura 3. Outra solução possível, para evitar a sobreposição, é aplicar anticorpo secundário marcado, que tem diferentes comprimentos de onda de excitação e / ou espectro de emissão separada melhor em comparação com FITC (se os parâmetros técnicos CLSM permitir isto). Esta possibilidade oferece grande vantagem para o método CLSM, o que permite a utilização de sondas fluorescentes opcionais em paralelo com os conjugados da GnRH-FITC. Por exemplo, estas sondas fluorescentes alternativos podem ser utilizados para outros organelos contracoloração conforme necessário.
A concentração aplicada de conjugados de GnRH-FITC tem as seguintes limitações. Limite máximo de concentração de conjugados de GnRH-FITC é baseado em sua solubilidade 18. Estes valores são as seguintes em PBS à temperatura ambiente: a GnRH-I: 90 uM; GnRH-II: 40 uM; GnRH-III: 200 uM. Por outro lado, em experiências anteriores que suposto que a absorção destes péptidos GnRH pode ter lugar por outros do que os receptores de GnRH-I humana receptores; esta absorção parece ser mais significativa a concentrações mais elevadas (acima de 10 uM) 18. O limite inferior de detecção de conjugados de FITC-GnRH baseia-se numa variedade de parâmetros, mas em configurações ideal é de cerca de 1 | iM para as experiências CLMS. Descobrimos que citometria de fluxo oferece melhor sensibilidade do que a microscopia confocal. Em configurações ideais, o limite de quantificação dos conjugados de FITC-GnRH pode ser inferior a 1 uM. O limite de detecção ou quantificação poderiaser diferente em cada experiência, porque eles são dependentes do tipo de célula e do tempo de incubação. Note-se que os dados obtidos por FACS é mais confiável do que CLSM, porque ele detecta milhares de células por amostra e a média do sinal de células é calculado. No entanto, no protocolo, FACS não fornece informações sobre a localização celular de conjugados da GnRH-FITC e a expressão da superfície celular da GnRH-IR. Com base nestas considerações, concluímos que, a CLSM e experiências de FACS tem vantagens distintas, e eles se complementam. Por outro lado, a análise de imagem elevada teor poderia ser uma interessante e uma boa alternativa para a análise de FACS e CLSM.
Em resumo, os dados obtidos a partir destas experiências confirmam que cada um dos três conjugados de FITC-GnRH pode entrar nas células que expressam superfície celular GnRH-IR. Estes análogos de GnRH têm potência segmentação semelhante nas mesmas concentrações. No entanto, o nível de GnRH-IR na superfície de diferentes podemcélulas CER é altamente variável. Resultados calculado a partir dos dados de análise de citometria de fluxo permite a comparação de linhas celulares ou análogos de GnRH. Ao mesmo tempo, as imagens obtidas por microscopia confocal poderia revelar o nível de expressão de superfície celular da GnRH-IR e confirmar que estes conjugados são internalizados nas células. Com base nestes resultados, pode-se confirmar que os experimentos introduzidas contêm métodos práticos e variáveis para a investigação de sistemas de entrega de medicamentos à base de GnRH e oferecem uma boa base para novas experiências.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EBC-1 | JCRB Cell Bank | JCRB0820 | Human lung squamous cell carcinoma |
| BxPC-3 | ATCC | CRL-1687 | Human pancreatic adenocarcinoma |
| Detroit-562 | ATCC | CCL-138 | Human pharyngeal carcinoma |
| RPMI-1640 Medium with L-glutamine | Lonza | BE12-702F | Culture medium for BxPC-3 cells |
| Eagle's Minimum Essential Medium | Lonza | BE12-611F | Culture medium for EBC-1 cells, and complemented with 0.1% sodium pyruvate for Detroit-562 cells |
| Fetal Bovine Serum | Euro Clone | ECS0180L | Complements the culture medium |
| MycoZap Plus-CL | Lonza | VZA-2012 | Complements the culture medium (antibiotics) |
| Standard Line Cell Culture Flasks | VWR | 10062-872 | Provide consistent, sterile growth environment for cells |
| Trypsin-EDTA Mixture | Lonza | BE17-161E | Remove attached cells |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Lonza | BE17-516F | Solvent |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | Solvent |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Used to counting cells |
| [D-Lys6(FITC)]-GnRH-I | made by us | - | Purity ≥98% (HPLC) |
| [D-Lys6(FITC)]-GnRH-II | made by us | - | Purity ≥98% (HPLC) |
| [Lys8(FITC)]-GnRH-III | made by us | - | Purity ≥98% (HPLC) |
| glass bottom 8-well microscopic slide | Ibidi | 80826 | Use in CLSM experiment |
| Corning Costar cell culture plate, 12 well | Sigma-Aldrich | CLS3513-50EA | Use in FACS experiment |
| Fixing solution (10% neutral buffered formalin) | Bio-Optica | 01V60P | Fix adherent cells |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-10G | Prevent the nonspecific binding of the antibodies |
| GnRHR Antibody | Proteintech | 19950-1-AP | Immunocytochemistry reagent, bind to the human type-I GnRH receptors |
| Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A11035 | Immunocytochemistry reagent, bind to the primary antibody |
| Fluorescent probe solution (Draq5) | Thermo Fisher Scientific | 62254 | Counterstain nuclei |
| Fluoromount Aqueous Mounting Medium | Sigma-Aldrich | F4680-25ML | Use in CLSM experiment, preserving fluorescence |
| Inverted microscope | Elektro-Optika Ltd. | Alpha XDS-2T | Check the phenotype and confluency of cell cultures |
| Inverted confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM-710 | Use in CLSM experiment |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD FACSCalibur | Use in FACS experiment |
References
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