Choque hemorrágico não controlado modelado via laceração hepática em ratos com monitorização hemodinâmica em tempo real

Resumo

A hemorragia descontrolada, uma importante causa de mortalidade entre os pacientes com trauma, pode ser modelada utilizando uma laceração hepática padrão em um modelo murino. Este modelo resulta em perda de sangue consistente, sobrevivência e permite o teste de agentes hemostáticos. Este artigo fornece o processo passo a passo para executar este modelo valioso.

Resumo

A hemorragia não controlada é uma causa importante de óbitos evitáveis ​​entre pacientes com trauma. Desenvolvemos um modelo murino de hemorragia descontrolada através de uma lacera- ção hepática que resulta em perda sanguínea consistente, alterações hemodinâmicas e sobrevida.

Os ratos sofrem uma ressecção padronizada do lobo médio esquerdo do fígado. Eles são autorizados a sangrar sem intervenção mecânica. Os agentes hemostáticos podem ser administrados como terapia de pré-tratamento ou de resgate, dependendo do interesse do investigador. Durante o tempo de hemorragia, é realizada monitorização hemodinâmica em tempo real através de uma linha arterial femoral esquerda. Os ratinhos são então sacrificados, a perda de sangue é quantificada, o sangue é recolhido para análise posterior e os órgãos são colhidos para análise da lesão. O desenho experimental é descrito para permitir o teste simultâneo de múltiplos animais.

Hemorragia hepática como modelo de hemorragia não controlada existeNa literatura, principalmente em modelos de ratos e suínos. Alguns destes modelos utilizam monitorização hemodinâmica ou quantificam a perda de sangue mas não têm consistência. O presente modelo incorpora a quantificação de perda sangüínea, monitoramento hemodinâmico em tempo real em um modelo murino que oferece a vantagem de usar linhas transgênicas e um mecanismo de alto rendimento para investigar os mecanismos fisiopatológicos em hemorragia não controlada.

Introdução

O trauma é a principal causa de morte e incapacidade entre os jovens em todo o mundo. ¹ A hemorragia não controlada continua a ser uma das principais causas de mortalidade entre os pacientes com traumatismos gravemente feridos. ^{2 O} tratamento do paciente com trauma hemorrágico é duplo: controle do sangramento cirúrgico e ressuscitação e reposição do sangue perdido.

Modelos animais de choque hemorrágico têm sido a pedra angular na pesquisa de trauma e podem ser utilizados na avaliação da fisiopatologia e tratamento de choque traumático / hemorrágico. ^{3 , 4 O} choque em modelos animais pode ser conseguido amplamente por dois métodos: hemorragia controlada e hemorragia descontrolada. ^{5 , 6 A} hemorragia controlada é realizada pela remoção de um volume fixo de sangue ou por remoção de sangue para atingir determinada pressão sanguínea (pressão fixa). Enquanto oOs modelos são úteis na avaliação dos mecanismos e das alterações imunes no choque hemorrágico, não são aplicáveis ​​ao teste de agentes hemostáticos e não imitam o cenário clínico de hemorragia após trauma. Nesse sentido, procurou-se desenvolver um modelo de hemorragia descontrolada que nos permitisse testar alterações hemostáticas e agentes pró-coagulantes em um modelo murino. O fígado é uma opção atraente para a hemorragia descontrolada, em parte por causa do fornecimento de sangue dupla para o fígado e é um dos mais comumente lesionado órgãos intrabdominais, tanto em trauma fechado e penetrante. Dada a alta relevância clínica, o fígado tem sido utilizado como um modelo de hemorragia não controlada, mais comumente em modelos de ratos e porcinos, mas recentemente também em primatas. ^{7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12} 13 ^{, 14}

Os modelos de ratos e porcinos de hemorragia hepática descontrolada, embora valiosos na observação de práticas de ressuscitação e monitorização hemodinâmica, são menos vantajosos do que um modelo murino por várias razões, tais como custo, número de animais utilizados e, sobretudo, a falta relativa de linhas transgénicas disponíveis para análise De sinalização celular e molecular específica. O presente modelo de murino compartilha semelhanças importantes com modelos de hemorragia hepática existentes, incluindo laceração hepática padronizada, quantificação de perda de sangue, monitorização hemodinâmica e capacidade para realizar a análise de sobrevivência. Muitos modelos existentes incorporam apenas alguns destes aspectos, enquanto o nosso modelo foi desenvolvido para medir muitas das variações fisiológicasBles simultaneamente e em múltiplos ratos. Além disso, o desenvolvimento de um modelo murino abre a porta a investigações além da reanimação e a mecanismos fisiopatológicos maiores em hemorragia descontrolada com o potencial de um modelo de baixo custo e alto rendimento usando técnicas moleculares avançadas.

Protocolo

Os murganhos foram alojados de acordo com as orientações de cuidados com animais da Universidade de Pittsburgh (Pittsburgh, PA, EUA) e National Institutes of Health (NIH, Bethesda, MD, EUA) em condições livres de agentes patogénicos com ciclos claro-escuro de 12 h e livre acesso a Alimentação padrão e água. Todos os experimentos com animais foram aprovados e conduzidos de acordo com as diretrizes estabelecidas pelo Animal Research and Care Committee da Universidade de Pittsburgh.

1. Campo Cirúrgico e Configuração do Instrumento

1. Esterilize todos os instrumentos cirúrgicos, sutura, gaze, aplicadores de ponta de algodão, tubulação e conectores de tubulação antes do procedimento.
   1. Esterilizar instrumentos cirúrgicos, sutura, gaze e aplicadores de ponta de algodão em uma autoclave. Esterilizar os conectores da tubulação e da tubulação com óxido de etileno.
2. Campo cirúrgico
   1. Ligue uma almofada de aquecimento de circulação de água e ajuste para 37 ° C. Coloque um surgiCal azul pad em cima dela e, em seguida, um drapeado estéril em cima da almofada azul cirúrgica.
   2. Abra todos os instrumentos esterilizados sobre a cortina estéril. Use luvas estéreis para evitar quebrar a esterilidade durante esta etapa.
   3. Encha uma tigela de aço inoxidável com etanol a 70% e reserve. Isto será usado para limpar instrumentos entre animais.
   4. Ligue o esterilizador de micro bolas e deixe aquecer até 150 ° C. Isto também será usado para limpar instrumentos entre animais. Se realizar a cirurgia em mais de 5 ratos, certifique-se de mudar os instrumentos para um novo conjunto estéril.
3. Configuração do Transdutor
   1. Conecte um transdutor estéril, tubulação PE-50, duas agulhas 23G e macho-macho luer, e uma torneira de três vias. ⁶
   2. Calibrar e zerar o transdutor de acordo com as instruções do fabricante.

2. Procedimento Cirúrgico de Laceração do Fígado

1. Indução e posicionamento da anestesia
2. Injectar pentobarbital sódico por via intraperitoneal à dose de 70 mg / kg. A anestesia deve ter efeito entre 5-10 min; Avaliar a profundidade da anestesia com uma pitada de dedo do pé. Se o rato tiver resposta ao pinçamento do dedo do pé, é necessário tempo adicional ou anestesia. Se for necessária anestesia adicional durante o procedimento, suplementar pentobarbital de sódio. Não administrar suplementos em quantidades maiores do que 0,05 mL para evitar a sobredosagem.
3. Depois que o mouse está completamente sob anestesia, posicione o mouse em posição supina em uma placa cirúrgica. Segure os quatro membros do mouse na placa com fita adesiva.
4. Raspar o abdômen e as virilhas bilaterais com uma navalha.
5. Embeber gaze estéril com betadine e aplicar no abdómen e virilhas bilaterais para a cirurgia. Para experimentos de sobrevivência, prepare o abdómen e as virilhas com betadina seguido de etanol para um total de três ciclos de preparação.
6. Insira uma sonda de temperatura retal para monitorar a temperatura do núcleo durante todo o procedimento. Mantenha o cTemperatura entre 35-37 ° C.

Artéria femoral e cânula venosa

1. Para instalação de cateter venoso: preencher a tubagem de PE-10, uma agulha de 30 G e uma torneira de três vias com solução de Ringer lactato de um saco IV.
2. Para instalação do cateter arterial: preencher a tubagem de PE-10 e agulha 30G com solução salina heparinizada (diluição 1:10 de 1.000 U de heparina). Heparina-salina é necessária para evitar a coagulação.
3. Coloque o mouse sob um microscópio de dissecação.
4. Faça uma incisão longitudinal de 4-5 mm sobre o músculo da virilha usando tesoura de íris cirúrgica. Usando pinças Dumont agarrar o tecido adiposo conectado ao músculo adutor e puxar lateralmente para uma exposição limpa do feixe femoral. Não dissecar através do tecido adiposo, pois isso levará a lesão vascular.
5. Cuidadosamente dissecar o nervo longe da artéria e veia com a pinça Dumont. Há um bloco de gordura adjacente ao nervo. Pegue isso com um Dumont forcep umD puxar lateralmente; Isso puxa o nervo longe da artéria criando um plano para dissecção. Com outros Dumont forcep dissecar sem rodeios o tecido conjuntivo entre o nervo ea artéria.
   1. Não agarre o nervo durante esta parte da dissecção.
6. Loop três suturas de seda 6-0 em torno da artéria e veia proximal ao femoral profunda decolar.
   1. Coloque a sutura 1 mais proximalmente e deixe solta.
   2. Coloque a sutura 2 mais distalmente e amarre imediatamente.
   3. Coloque a sutura 3 entre a sutura 1 e 2 e deixe solta.
7. Faça uma arteriotomia na superfície ventral do vaso. O uso de tesoura microvascular é recomendado para fazer a arteriotomia para evitar a transecção do vaso.
8. Insira o cateter de três vias na artéria. Imediatamente amarrar Sutura 1 e 2 para fixar o cateter no lugar.
9. Conecte o cateter de três vias ao transdutor e colete os dados da pressão arterial basal.
10. Repita os passos 2.2.4 - 2.2.6 na virilha oposta. Canular a veia femoral de forma semelhante à artéria. Realizar uma venotomia na superfície ventral do vaso seguido de inserção do cateter. Este cateter pode ser utilizado para administração de fluido ou fármaco.

Laceração do fígado

1. Pré-pesar um tubo contendo 0,5 mL de PBS, três triângulos de absorção e um barco de pesagem por mouse.
2. Faça uma incisão da laparotomia da linha média ventral começando no processo xifóide e estendendo-se caudalmente para permitir a exposição do fígado completamente.
3. Insira um triângulo de absorção no abdômen contra a parede abdominal direita. Repita no lado esquerdo.
   1. Certifique-se que o triângulo de absorção está longe do fígado para evitar um efeito hemostático de embalagem após o fígado ser lacerado.
4. Cuidadosamente pegue o lobo meio-esquerdo do fígado e lacerar 75% do lobo com uma tesoura de íris cirúrgica. Coloque o laceradoD num tubo contendo PBS.
5. Feche a parede abdominal com agrafos através de um aplicador de grampos. Segure a pele eo músculo em conjunto e disparar o grampo. Faça isso o mais rápido possível após a laceração do fígado para evitar a perda de sangue fora do abdômen. Em experimentos de sobrevivência, o abdômen é fechado em duas camadas. Uma sutura absorvível corrente para o músculo seguida por uma camada em execução de sutura não absorvível para a pele proporciona um fecho adequado.
6. Para ratinhos que sejam para tempos de sobrevivência superiores a 30 minutos, os cateteres femorais devem ser removidos, a artéria ea veia amarradas com a sutura 3 do passo 2.2.6. As virilhas bilaterais são então fechadas em duas camadas como descrito no passo anterior.
7. Após um período específico de interesse para hemorragia (30 min até 72 h), retire os grampos. Remova os triângulos de absorção e coloque em pesados ​​pesados ​​pré-pesados ​​correspondentes. Use triângulos de absorção adicionais para absorver qualquer sangue não absorvido.
8. Pesar filtros de absorção para calcular a perda total de sangue.

Cuidados pós-operatórios

1. Deixar os ratos que devem ser sacrificados aos 30 min na placa cirúrgica e sob monitoração constante e sob anestesia completa até o momento do sacrifício. Os ratinhos são eutanasiados com uma combinação de punção cardíaca e uma sobredosagem de isoflurano inalado.
2. Coloque camundongos que são para pontos de tempo de sobrevivência mais longa em uma gaiola de recuperação em cima de uma almofada de aquecimento de circulação de água. Constantemente monitorar os ratos durante a recuperação e não deixar sem vigilância até que recuperar a consciência para manter a recumbência esternal. Retornar o mouse para gaiola espaço com outros ratos apenas uma vez que se recuperou da anestesia.
3. Administrar analgesia pós-operatória com 0,1 mg / kg de buprenex via injeção subcutânea uma vez acordado da anestesia e a cada 12 h após até o momento do sacrifício.
4. Permitir aos ratos acesso livre a comida e água depois de serem devolvidos aos seusGaiolas normais pós-operatórias.
5. No momento do sacrifício para ratinhos de sobrevivência, a anestesia é realizada com isoflurano inalado. Uma vez sob anestesia, o sangue é recolhido através de uma punção cardíaca direita, a perda de sangue é registada como descrito acima e finalmente a eutanásia é segurada com uma sobredosagem de isoflurano.

Resultados

O modelo de laceração hepática resulta em perda de sangue reproduzível e consistente em ratos. A Figura 1A demonstra o peso consistente de fígado lacerado que pode ser obtido com um desvio padrão de apenas 0,02 g. Esta consistência no peso de fígado lacerado permite a capacidade de reproduzir o modelo entre camundongos e em diferentes configurações experimentais, tais como diferentes protocolos de ressuscitação. Além disso, o peso reproduzível do fígado lacerado, com um ...

Discussão

O modelo de laceração de fígado murino aqui descrito fornece um modelo confiável e consistente de hemorragia não controlada. Este modelo é simples de executar, mas há etapas importantes que exigem consideração meticulosa. A parte mais desafiadora tecnicamente do modelo é a canulação dos vasos femorais para monitorização hemodinâmica e administração de fluido / fármaco. Cuidado deve ser tomado durante a dissecção do nervo e da arteriotomia / venotomia. É importante não tocar o nervo durante a dissecção dos vasos para evi...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
SS / 45 dumonts	Fine Science Tools	11203-25
tesoura cirúrgica	Fine Science Tools	14068-12
hemostatos	Fine Science Tools	13009-12
microtesouras	Fine Science Tools	15000-08
pinça curva de 0,8 mm	Fine Science Tools	11009-13
carretel de sutura 6-0	Ferramentas de Ciência Fina	18020-60
sutura 4-0 seda com agulha	Gaze Owens Minor	K188H
4 x 4	pode ser comprada através de qualquer fornecedor
aplicador de ponta de algodão	pode ser comprado através de qualquer fornecedor
Agulha de 30 G	pode ser comprada através de qualquer fornecedor
Agulha	de 23 Gpode ser comprado através de qualquer fornecedor
Seringa de 10 cc	pode ser comprada através de qualquer fornecedor
Tubo cônico de 50 cc	pode ser comprado através de qualquer fornecedor
Seringa de 1 cc com agulha 25G	Fisher Scientific	14-826-88
Tubo de Polietileno 10 100'(PE-10)	Fisher Scientific	14-170-12P
Tubo de polietileno 50 100'(PE-50)	Fisher Scientific	14-170-12B
torneira de 3 vias	Fisher Scientific	NC9779127
almofada azul cirúrgica	Fisher Scientific	50-7105
Curativos de campo estéreis	Fisher Scientific	NC9517505
rolos de fita 1"	Corporate Express	MMM26001
frascos de boca larga de lado reto	VWR	159000-058
bandeja de aço inoxidável 8" x 11"	VWR	62687-049
fechadura leur macho-macho 3 vias	VWR	20068-909
bolsa de esterilização 3" x 8"	VWR	24008
bolsa de esterilização 5" x 10"	VWR	24010
triângulos de absorção	Fine Science Tools	18105-03
	Fisher Scientific	E0522687
1.000 clipes de ferida de 7 mm	Fisher Scientific	E0522687
betadine (4 oz)	pode ser comprado através de qualquer fornecedor
luvas estéreis	podem ser compradas através de qualquer fornecedor
eppendorfs	pode ser comprado através de qualquer fornecedor
Seringa de insulina Lo-Dose de 1/2 cc	Fisher Scientific	12-826-79
pequeno barco de pesagem	pode ser comprado através de qualquer fornecedor
ringers lactato	podem ser comprados através de qualquer fornecedor
solução salina hepranizada (.1 µL; hep + 9.9 µL; NaCl)	pode ser comprado através de qualquer fornecedor
de solução salina tamponada com fosfato	pode ser adquirido através de qualquer fornecedor
pentobarbital	pode ser adquirido através de qualquer fornecedor
Microscópio Wild M650 com suporte de lança	Analisador Leica
Digi-Med BPA-400 e integrador de sistemas	Micro-Med	SYS-400
TXD-310 (Transdutor Digi-Med)	Micro-Med	TXD-300
Computador	Dell
microbead instrumento esterilizador	VWR	11156-002
Oster A5 clippers w. tamanho 40 lâmina	VWR	10749-020
almofada de aquecimento circulante 18 x 26	Harvard	py872-5272
termômetro retal	Kent Scientific	RET-3

globalglobalglobalglobalglobalglobalAplicador de clipe de ferida de 7 mm da globalglobalglobalglobalglobalglobalglobalglobal