Artigo de método

Uma abordagem baseada em Espectrometria Tandem Cromatografia Líquida de Massachusetts para análise de metabolitos de

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DOI:

10.3791/55558

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28 de março de 2017

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Georgetown University, 2Division of Infectious Diseases, Weill Cornell Medical College, 3Department of Medicine, Weill Cornell Medical College

Neste artigo

Resumo

Aqui, descrevemos um protocolo para a extracção de metabolitos a partir de Staphylococcus aureus e a sua subsequente análise por meio de cromatografia líquida e espectrometria de massa.

Resumo

Em um esforço para frustrar patógenos bacterianos, os anfitriões muitas vezes limitam a disponibilidade de nutrientes no local da infecção. Esta limitação pode alterar as abundâncias de metabólitos chave para os quais fatores regulatórios respondem, ajustando o metabolismo celular. Nos últimos anos, um número de proteínas e de ARN surgiram como importantes reguladores da expressão de genes de virulência. Por exemplo, a proteína Cody responde a níveis de aminoácidos de cadeia ramificada e de GTP e é amplamente conservada em baixo G + C bactérias Gram-positivas. Como um regulador global em Staphylococcus aureus, Cody controla a expressão de dúzias de genes de virulência e metabólicas. Nossa hipótese é que S. aureus usa Cody, em parte, para alterar seu estado metabólico em um esforço para se adaptar às condições de limitação de nutrientes potencialmente encontrados no ambiente de host. Este manuscrito descreve um método para a extracção e análise de metabolitos a partir de S. aureus utilizando cromatografia líquida acoplada com espectrometria de massatrometry, um protocolo que foi desenvolvido para testar esta hipótese. O método também destaca as melhores práticas que irão garantir rigor e reprodutibilidade, tais como manter o estado estacionário biológico e aeração constante sem o uso de culturas quimiostato contínuas. Em relação aos USA200 sensível à meticilina S. aureus isolar UAMS-1 estirpe parental, o mutante isogico Cody exibiram aumentos significativos na aminoácidos derivados a partir de aspartato (por exemplo, treonina e isoleucina) e diminui em seus precursores (por exemplo, aspartato e O -acetylhomoserine ). Estes resultados correlacionam-se bem com os dados obtidos com análise de transcrição de ARN-seguintes: os genes nestas vias foram supra-regulados entre 10 e 800 vezes no mutante nulo Cody. Acoplamento análises globais do transcriptoma e metaboloma pode revelar como as bactérias alterar o seu metabolismo, quando confrontado com o estresse ambiental ou nutricional, proporcionando potencial visão sobre as physmudanças iological associados com esgotamento de nutrientes experimentado durante a infecção. Tais descobertas podem abrir o caminho para o desenvolvimento de novos anti-infecciosos e terapêutica.

Introdução

patógenos bacterianos devem lidar com muitos desafios dentro do ambiente de host. Além de ataque directo por células do sistema imunológico, o hospedeiro também sequestra nutrientes essenciais para a sobrevivência das bactérias e a replicação, gerando imunidade nutricional 1, 2. Para sobreviver nestes ambientes hostis, patógenos bacterianos implantar fatores de virulência. Alguns destes factores de permitir que as bactérias para evadir a resposta imune; Outros factores incluem segregada enzimas digestivas, tais como hialuronidase, termonuclease, e lipases, que podem permitir que as bactérias para reabastecer nutrientes em falta por consumir constituintes derivadas de tecido 3, 4, 5. Com efeito, as bactérias têm evoluído sistemas reguladores que ligam o estado fisiológico da célula para a produção de factores de virulência 6, 7, -se class = "xref"> 8, 9, 10.

Um crescente corpo de evidências aponta para Cody como um regulador crítico que liga o metabolismo e virulência. Embora descoberto pela primeira vez em Bacillus subtilis como um repressor do gene dipéptido permease (dpp) 11, Cody é agora conhecido por ser produzido por quase todas as bactérias em G + C Gram-positivos baixos 12, 13 e regula dezenas de genes envolvidos em carbono e metabolismo 14, 15, 16, 17, 18, 19 de azoto. Em espécies patogénicas, Cody também controla a expressão de alguns dos mais importantes genes de virulência de 20, 21,. ef "> 22, 23, 24, 25, 26, 27 Cody é activada como uma proteína de ligação de ADN por duas classes de ligandos: aminoácidos de cadeia ramificada (BCAA, isoleucina, leucina, e valina [ILV]) e GTP . Quando estes nutrientes são abundante, Cody reprime (ou em alguns casos, estimula) a transcrição. Como estes nutrientes tornam-se limitadas, actividade Cody é progressivamente reduzido, o que resulta em uma resposta transcripcional graduada que re-rotas precursores por meio de várias vias metabólicas ligados ao metabolismo central 28, 29, 30.
Em tandem cromatografia luida acoplada a espectrometria de massa (LC-MS) é uma técnica poderosa que pode identificar e quantificar com precisão pequenas moléculas metabolitos intracelulares 31. Quando emparelhado com transcanálise riptome (por exemplo, ARN-SEQ), este fluxo de trabalho analítico pode fornecer informações sobre as alterações fisiológicas que ocorrem em resposta ao stress ambiental ou nutricional. Aqui, apresentam-se um método para a extracção de metabolitos a partir de células de Staphylococcus aureus e subsequente análise por meio de LC-MS. Esta abordagem tem sido usada para demonstrar os efeitos pleiotrópicos das Cody sobre S. aureus fisiologia.

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Protocolo

1. Preparação de Soluções Tampão

  1. Preparar solução salina tamponada com fosfato (PBS; pH 7,4) por diluição de uma solução de reserva de 10x PBS para uma concentração final de 1x com água ultrapura (desionizada destilada e).
  2. Preparar a solução de têmpera através da combinação de 2 mL de acetonitrilo, 2 mL de metanol, 1 mL de H2O ultra-pura, e 19 uL (concentração final 0,1 mM) de ácido fórmico.
  3. Prepare LC-MS solvente A pela adição de ácido fórmico (0,2% [v / v] concentração final) de água ultrapura.
  4. Prepare LC-MS solvente B por adição de ácido fórmico (0,2% [v / v] de concentração final) a acetonitrilo.
    Nota: Todas as soluções devem ser preparadas utilizando os reagentes de maior grau de pureza disponível (geralmente de alto desempenho de grau de cromatografia luida). Soluções deve ser preparada fresca antes de cada experiência e armazenados em gelo antes do uso.

2. Estabelecimento de estado estacionário S. aureus Crescimento

  1. Streak S. aureus estirpes de interesse para o isolamento em agar de soja tríptica (TSA) a partir de um stock de glicerol congelado. Incubar a 37 ° C durante 16-24 h.
  2. Inocular 4 ml de caldo tríptico de soja (TSB) ou outro meio adequado de incubação em tubos de vidro estéreis, com colónias únicas de cada estirpe. Incubar inclinada (~ 70 ° de ângulo), com rotação a 60 rotações por minuto (rpm) a 37 ° C durante 16-20 h.
    NOTA: Culturas durante a noite são propensos a gradientes de oxigénio quando são usados ​​métodos convencionais, incluindo os descritos na etapa 2.2, que afectam a fisiologia celular. Assim, nós empregamos uma estratégia de múltiplos back-diluição para garantir estado de equilíbrio biológico (veja as etapas 2,4-3,2, abaixo).
  3. Utilizar um espectrofotómetro para determinar a densidade óptica das culturas a partir do passo 2.2 a 600 nm (OD 600). Use meio estéril como uma referência óptica (em branco). Dilui-se estas células para uma DO600 de 0,05 em 50 ml de meio TSB estil (pré-aquecido a 37 ° C) em separado, 250 mL DeLong frascos.
  4. incuBATE as culturas a 37 ° C em um banho de água com agitação a 280 rpm.
  5. Cada 30 minutos, tomar OD 600 medições; como as densidades ópticas aumentar, pode tornar-se necessário diluir as culturas com TSB para que permaneçam dentro do intervalo linear de absorvância do espectrómetro.
  6. Quando as culturas a partir do passo 2.5 atingir uma OD 600 de ~ 0,8-1,0, subcultura-los em 50 ml de 37 ° C TSB para um OD 600 de 0,01-0,05 e repetir os passos 2.4 e 2.5.

Setup Coleção 3. Amostra

  1. Prepara-se uma cama de gelo seco esmagado num recipiente apropriado (por exemplo, um prato de vidro, balde de gelo, ou mais frio).
  2. À medida que as densidades ópticas das culturas aproximar do ponto de colheita desejada, adicionar 1 mL de uma solução não tratada para um prato de Petri 35 mm, e pré-arrefecer em gelo seco para têmpera ≥5 min.
    NOTA: O "ponto de colheita desejada" irá variar dependendo objetivos experimentais. Por exemplo, se alguém fosse examinar metabolites durante o crescimento aeróbico, os principais indicadores desse estado incluem excreção de etilo e re-assimilação do acetato de durante a fase de crescimento exponencial pós-32, 33. Geralmente, este ponto deve estar dentro de uma fase de crescimento específico (por exemplo, fase exponencial). Os 600 valores de DO específicos associados com esta fase pode variar entre diferentes estirpes bacterianas e meios de crescimento.
  3. Coloque uma frita de filtro de aço inoxidável (pré-arrefecido a -20 ° C) em uma rolha de borracha e colocá-la no topo de um frasco de vácuo ligada a uma câmara de vácuo ou bomba de vácuo.
  4. Aplicar o vácuo e colocar uma membrana de éster de celulose misturados (0,22 de tamanho de poro) no topo.
    NOTA: É importante a utilização de um filtro com um diâmetro igual ao da frita e para centrar correctamente este filtro para garantir que a amostra é retirada através do filtro, em vez de ao longo da borda. Molhar a membrana com gelo-frio, H2O esterilizada pode ajudarcom o posicionamento da membrana.

4. Colheita de Amostra

  1. A uma DO600 de ~ 0,4-0,5, utilizar uma pipeta serológica para remover 13 ml de cultura a partir do frasco e para aplicar a amostra ao filtro.
  2. Depois de toda a amostra foi filtrada, lava-se imediatamente o filtro com ≥5 mL de PBS gelado para lavar metabolitos associados a médias.
  3. Desligar o vácuo e usar um par de pinças estéreis para remover o filtro de frita. Inverter o filtro (no lado da célula para baixo) para a solução de paragem pré-gelada.
    NOTA: É importante realizar os passos acima rapidamente (isto é, dentro de segundos) e, assim que o líquido tiver sido removida para assegurar a rápida extinção das células, prendendo actividade metabólica.
  4. Incubar o filtro numa solução de arrefecimento rápido em gelo seco para ≥20 min.
  5. Usando pinças estéreis, inverter o filtro (-lado célula para cima) na placa de petri e usar uma micropipeta para lavar as células fora de tele membrana na solução de extinção.
  6. Re-suspendeu as células em solução de paragem e, em seguida, transferir a suspensão de células para um tubo resistente a impacto 2 mL estéril contendo ~ 100 mL de esferas de sílica de 0,1 mm. Conserva-se a em gelo seco ou a -80 ° C.

5. Metabolito Extraction

  1. Descongelar amostras em gelo húmido e perturbar as células em um homogeneizador com quatro rajadas s 30 a 6.000 rpm, com períodos de arrefecimento 2 min em gelo seco entre os ciclos.
  2. Esclarecer os lisados durante 15 minutos numa pré-arrefecido, de microcentruga refrigerada a velocidade máxima (isto é, 18,213 xg à ≤4 ° C).
  3. Transferir o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga limpo.
  4. Usando uma micropipeta, transferir uma pequena parte da amostra para um tubo de microcentrífuga para a quantificação do teor de péptido residual no passo 6; armazenar o restante à temperatura de -80 ° C.
    NOTA: O volume da amostra reservados varia, dependendo do ensaio BCA usado no passo 6.1. esteamostra deve ser armazenada em gelo húmido para análise imediata ou congeladas a -80 ° C.

6. ácido bicinconínico (BCA) Ensaio

  1. Realizar um ensaio de BCA tal como recomendado pelo fabricante do kit, utilizando amostras a partir do passo 5.4 para determinar a concentração de péptido residual para cada amostra.

7. LC-MS

  1. Misturar 75 mL de S. aureus extracto com 75 ul de LC-MS solvente B, preparado no passo 1.4.
  2. Vortex para misturar e centrifugação a 13000 xg durante 5 min.
  3. Colocar 100 uL de sobrenadante para uma cromatografia líquida (LC) frasco e cap. Garantir que nenhuma bolha de ar estão presos na amostra.
  4. Coloque os frascos LC para o amostrador automático LC-MS e editar a lista de execução no software "offline Worklist Editor."
    1. Para preencher o "Nome da Amostra" (por exemplo, de tipo selvagem-1), "Amostra Posição" (por exemplo, P1-A1), "Processo" (por exemplo, fórmico Umcid-negativa Método), e (por exemplo, de tipo selvagem) 1-colunas "do ficheiro de dados". Clique no botão "Salvar Lista de trabalho". Abra o software "Mass Spectrometry Aquisição de Dados da Estação de Trabalho" e insira a lista de trabalho salva anteriormente. Clique no botão "Iniciar Lista de trabalho Executar" para iniciar a medição contínua LC-MS.
  5. Separaram-se as amostras numa coluna, ligar a coluna para um tempo de voo (TOF) espectrómetro, e acoplar o espectrómetro TOF com o sistema de LC. Utilizar um gradiente de fase móvel como se segue: 0-2 min, 85% de solvente B; 3-5 min, 80% de solvente B; 6-7 min, 75% de solvente B; 8-9 minutos, 70% de solvente B; 10-11,1 min, 50% de solvente B; 11,1-14 min, 20% de solvente B; e 14,1-24 min, 5% de solvente B; acabar com um período de re-equilíbrio de 10 min a 85% de solvente B e uma velocidade de fluxo de 0,4 ml min -1.
  6. Usando uma bomba isocrática, infundir uma solução de massa de referência com o correr para permitir a calibração do eixo massa simultânea.
    NOTA: Este passoé baseado no manual de TOF espectrômetro padrão.
    1. Utilizar a mistura de ácido acético D4 e hexaquis (1H, 1H, 3H-tetrafluoropropoxi) fosfazina como a solução de massa de referência para realizar a calibração em tempo real. Utilizar a bomba isocrática com o caudal de 2,5 ml min -1 para a infusão.

8. Lote Correcção de Contagem de iões

  1. Designa qualquer exemplo para servir como uma amostra de referência para o lote de correcção (por exemplo, de tipo selvagem, replicar 1).
  2. Calcular a soma das contagens de iões para todos os metabolitos dentro da amostra de referência. Repita este cálculo para todas as amostras.
  3. Dividir a contagem total de iões de cada amostra por contagem do total de iões da amostra de referência para gerar um rácio.
  4. Dividir a contagem de iões para cada metabolito dentro de uma amostra pela relao entre a amostra / de referência para se obter uma contagem de iões corrigido-lote para cada metabolito.

9. Péptido Normalização

  1. Divide os valores de contagem de iões corrigido-lote para cada amostra obtida no passo 8 pela concentração de péptido determinado com o ensaio BCA no passo 6, para se obter um valor normalizado para cada metabolito.
    NOTA: As normalizados, lote-batch corrigido contagens de iões para cada metabolito obtido na etapa 9.1 pode ser directamente comparada entre estirpes e sujeitos a análise estatística (por exemplo, um U de Mann-Whitney -teste). Alternativamente, um metabolito conhecido por ser inalterada quer pelo tratamento ou fundo genético pode ser usado como um normalizador para detectar mudanças devido ao metabolito decomposição. A inclusão de uma quantidade conhecida de L-norvalina ou ácido gluraric no tampão de extracção pode ser utilizado para corrigir a perda durante o processamento da amostra 34.

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Resultados

Analisamos piscinas metabolitos intracelulares em S. aureus durante crescimento in vitro num meio rico, complexo. Como prova de princípio, foram comparados os perfis de metabolitos entre o S. aureus sensível à meticilina osteomielite isolar UAMS-1 (tipo selvagem [WT]) e uma estirpe isogénica sem o regulador transcricional mundial Cody (Δ Cody) 26. O estado estacionário, culturas exponenciais das estirpes WT e Cody foram...

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Discussão

Todos os metabolitos de pequenas moléculas são ligadas uma à outra através das suas origens comuns em vias metabólicas centrais. Durante o crescimento exponencial, as células bacterianas são em estado estacionário biológica e metabólica, fornecendo um instantâneo do estado fisiológico sob condições específicas. Cody monitora suficiência de nutrientes por responder a ILV e GTP. Como ILV e GTP piscinas gota, actividade Cody é provável progressivamente reduzido, ajustando a expressão dos seus genes-alvo para se adaptar ao ...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado em parte por uma NIH Pathway to Prêmio Independência (conceder GM 099.893) e os fundos de arranque faculdade de SRB, bem como um projeto de Grant Research (conceder GM 042.219). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e interpretação, ou a decisão de enviar o trabalho para publicação.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Material/Equipamentoa
DeLong Culture Flask (250 mL)Belco2510-00250
Frasco de Pistola, 500 mLPyrex5340
Rolha de borracha de 3 furos, #7Fisher14-131E
Porta-filtro/frita em aço inoxidávelVWR89428-936
Placa de Petri, 35 mmCorning430588Não tratada com cultura de tecidos
Membrana de éster de celulose mista, 0,22 μ m tamanho do poroMilliporeGSWP02500
Tubos resistentes ao impacto, 2 mLUSA Scientific1420-9600
Contas de Sílica, 0.1 mmBiospec Products Inc11079101Z
Homogeneizador Precellys 24Bertin InstrumentsEQ03119-200-RD000.0
Pierce (Thermo Scientific)23235
Coluna de hidreto de diamante tipo C Agilent70000-15P-2
Tempo de voo de massa precisa (TOF) LC-MS, bombaAgilentG6230B
, série 1290 AgilentG4204A 
Bomba de Bin, Série 1290AgilentG4220A 
Válvula de Acionamento, Série 1290AgilentG1107A 
Bomba Isocrática, Série 1290AgilentG1310B 
TCC, Série 1290AgilentG1316C 
Amostrador, Série 1290AgilentG4226A 
Termostato, Série 1290AgilentG1330B 
Químico
Tríptico Caldo de SojaÁgar Becton Dickinson211825
Difco, GranuladoBecton Dickinson214530Meio sólido contém 1,5% [p/v] de ágar
Solução salina tamponada com fosfato (pH 7,4) 10xAmbionAM9624Diluir fresco até 1x com água ultrapura
AcetonitrilaFisher ScientificA955-500Optima LC-MS
MetanolFisher ScientificA456-500Optima LC-MS; ácido
fórmicoSigma Aldrich94318Para espectrometria de massa, 98%
Software
MassHunterAgilentG3337AA
Cepa bacterianaEspécieCepaGenótipo
SRB 337Staphylococcus aureusUSA200 MSSA UAMS-1tipo selvagem
SRB 372Staphylococcus aureusUSA200 MSSA UAMS-1Δ codY::erm
aOs produtos químicos e materiais enumerados são específicos do método descrito e não incluem produtos químicos ou materiais de laboratório normalizados.
Kit de Ensaio de Proteína Micro BCA de quat série 6200 tóxico

Referências

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