Apresentamos um método para quantificar a metilação do DNA com base na mancha ponto 5-metilcitosina (5-mC). Determinamos os níveis de 5-mC durante a desdiferenciação de condrócitos. Esta técnica simples poderia ser usada para determinar rapidamente o fenótipo condrócito em tratamento com ACI.
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Artigo de método
Um Ensaio de Blot de Ponto de 5 mC Quantificando o N�el de Metila�o de ADN da Dediferencia�o de Condrocitos
Neste artigo
Resumo
Resumo
A desdiferenciação de condrócitos hialinos em condrócitos fibroblásticos acompanha frequentemente a expansão monocamada de condrócitos in vitro . O nível global de metilação do ADN dos condrócitos é considerado um biomarcador adequado para a perda do fenótipo dos condrócitos. No entanto, resultados baseados em diferentes métodos experimentais podem ser inconsistentes. Portanto, é importante estabelecer um método preciso, simples e rápido para quantificar os níveis globais de metilação do DNA durante a desdiferenciação dos condrócitos.
As técnicas atuais de análise de metilação do genoma abrangem amplamente o seqüenciamento genômico do bisulfito. Devido à degradação do ADN durante a conversão de bissulfito, estes métodos requerem tipicamente um grande volume de amostra. Outros métodos utilizados para quantificar os níveis globais de metilação do DNA incluem a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). No entanto, a HPLC requer a digestão completa do ADN genómico. Além disso, o custo proibitivamente alto de HPLC emLimita a aplicação mais ampla da HPLC.
Neste estudo, o ADN genómico (gDNA) foi extraído de condrócitos humanos cultivados com número variável de passagens. O nível de metilação de gDNA foi detectado utilizando um ensaio dot blot de metilação específica. Nesta abordagem dot blot, uma mistura de gDNA contendo o ADN metilado a ser detectado foi manchada directamente sobre uma membrana N + como um ponto dentro de um padrão de molde circular previamente desenhado. Em comparação com outras abordagens de blotting baseadas em electroforese em gel e outros processos de transferência de blot, o método dot blot economiza tempo significativo. Além disso, as transferências de pontos podem detectar o nível geral de metilação do ADN utilizando um anticorpo 5-mC comercialmente disponível. Descobrimos que o nível de metilação do DNA diferiu entre as subcultações monocamadas e, portanto, poderia desempenhar um papel chave na desdiferenciação dos condrócitos. A mancha ponto 5-mC é um método confiável, simples e rápido para detectar o nível geral de metilação do DNA para avaliarE fenótipo condrócito.
Introdução
O implante de condrócitos autólogos (IAC) é um procedimento relativamente novo e de última geração para o tratamento de defeitos da cartilagem articular 1 , 2 . Um dos passos cruciais no ACI é a amplificação de condrócitos através da cultura monocamada in vitro . Durante a amplificação, os condrócitos hialinos perdem facilmente o seu fenótipo e se tornam desdiferenciados, o que é indesejável para o tratamento com ACI 3 , 4 . Para optimizar o resultado do tratamento com ACI, a extensão da desdiferenciação dos condrócitos deve ser determinada a....
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Protocolo
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Humana do Segundo Hospital Popular de Shenzhen.
1. Coleção de Tecidos de Cartilagem Articular Humana e Cultura de Condrócitos
- Preparação de materiais
- Preparar meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro bovino fetal e 1% de penicilina-estreptomicina. Preparar 1 mg / mL de colagenase II, 0,25% de tripsina-EDTA, solução salina tamponada com fosfato (PBS) e um filtro de células (nylon 40 μm).
- Coleção de tecido da cartilagem articular humana
- Isolar a cartilagem articular das articulações....
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Resultados
Os condrócitos foram cultivados numa monocamada até à passagem 6 (P6). Os condrócitos mostraram alterações fenotípicas progressivas com passagens sucessivas da cultura monocamada. A morfologia dos condrócitos P0 foi redonda, enquanto que as células tornaram-se altamente comprimidas e achatadas com passagens sucessivas até P6 ( Figura 1 ). Esta alteração morfológica é típica do processo de desdiferenciação dos condrócitos. Entretanto, os resultados do mapa de calor indica.......
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Discussão
A desdiferenciação de condrócitos in vitro compromete gravemente o desfecho da ACI no tratamento da reparação de defeitos da cartilagem 11,12. Para otimizar o resultado do ACI, é crucial evitar o uso de condrócitos desdiferenciados 13 . Estudos sugeriram que o nível geral de metilação do DNA está associado à extensão da desdiferenciação dos condrócitos 4,6. Assim, é imperativo estabelecer um método fiável e rápido para detectar o estado geral de metilação do ADN dos condrócitos antes da .......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelas seguintes subvenções: Natural Science Foundation of China (No. 81572198; No. 81260161; No. 81000460); Fundação de ciência natural da província de Guangdong, China (No. 2015A030313772); Projeto financiado da fundação da ciência de Postdoctoral de China (No. 2013M530385); A Fundação de Pesquisa Médica da Província de Guangdong, China (No. A2016314); Shenzhen Science and Technology Projects (No. JCYJ20160301111338144; No. JSGG20151030140325149; No. JSGG20140519105550503; No.GJHZ20130412153906739; No. JCYJ20140414170821160; No.JCYJ20140414170821200).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Reagents | |||
| DMEM | Gibco Inc. | 11965– 092 | Quente em 37 &graus; C banho-maria antes |
| do uso Solução salina tamponada com fosfato (PBS) | HyClone Inc. | SH30256.01B | D-PBS, livre de Ca2+/Mg2+ |
| FBS | Gibco Inc. | 10099-141 | |
| 0,25% de tripsina / EDTA | Gibco Inc. | 25200-056 | |
| 1% Penicilina-Estreptomicina | Gibco Inc. | 15140-122 | |
| Clorofórmio | Mallinckrodt | 4440 | |
| Álcool Isoamílico | Sigma | I-3643 | |
| Fenol | Gibco BRL | 15513-039 | |
| Proteinase K | Gibco BRL | 24568-2 | |
| Tampão TAE | Bio Whittaker | 16-011V | |
| Gibco BRL | 15230-170 | ||
| 1 M Tris-HCl | Biosharp Inc. | BL514A | |
| Tween20 | Biotopped Inc. | ||
| BSA | Proliant Inc. | 68700 | |
| Colgenase, Tipo II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| [cabeçalho] | |||
| Equipamento | |||
| Hemocitômetro | ISOLAB Inc. | 075.03.001 | |
| de 353003 | Corning de prato Falcon 100 mm | ||
| TPP AG | 91050 | esterilizada por gama | |
| Eppendorf | 5804R | ||
| ThermoMixer | MIULAB | MTH-100 | |
| Incubadora de células de dióxido de carbono | Thermo scientific | 3111 | |
| Sistema de análise por quimiografia | UVITEC Cambridge | ALLIANCE |
Referências
- Brittberg, M., et al. Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation. N Engl J Med. 331, 889-895 (1994).
- Pareek, A., et al. Long-Term Outcomes After Au....
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Reimpressões e permissões
