Artigo de método

Um Ensaio de Blot de Ponto de 5 mC Quantificando o N�el de Metila�o de ADN da Dediferencia�o de Condrocitos In Vitro

DOI:

10.3791/55565

⸱

17 de maio de 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Guangzhou Medical University, 2Shenzhen Key Laboratory of Tissue Engineering, Shenzhen Laboratory of Digital Orthopeadic Engineering, Department of Orthopedics, Shenzhen Second People's Hospital (The First Hospital Affiliated to Shenzhen University), 3Department of Chemistry, The Chinese University of Hong Kong, 4School of Biomedical Engineering, Shanghai Jiao Tong University, 5Renji Hospital Clinical Stem Cell Research Center, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 6Shantou University Medical College

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Apresentamos um método para quantificar a metilação do DNA com base na mancha ponto 5-metilcitosina (5-mC). Determinamos os níveis de 5-mC durante a desdiferenciação de condrócitos. Esta técnica simples poderia ser usada para determinar rapidamente o fenótipo condrócito em tratamento com ACI.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A desdiferenciação de condrócitos hialinos em condrócitos fibroblásticos acompanha frequentemente a expansão monocamada de condrócitos in vitro . O nível global de metilação do ADN dos condrócitos é considerado um biomarcador adequado para a perda do fenótipo dos condrócitos. No entanto, resultados baseados em diferentes métodos experimentais podem ser inconsistentes. Portanto, é importante estabelecer um método preciso, simples e rápido para quantificar os níveis globais de metilação do DNA durante a desdiferenciação dos condrócitos.

As técnicas atuais de análise de metilação do genoma abrangem amplamente o seqüenciamento genômico do bisulfito. Devido à degradação do ADN durante a conversão de bissulfito, estes métodos requerem tipicamente um grande volume de amostra. Outros métodos utilizados para quantificar os níveis globais de metilação do DNA incluem a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). No entanto, a HPLC requer a digestão completa do ADN genómico. Além disso, o custo proibitivamente alto de HPLC emLimita a aplicação mais ampla da HPLC.

Neste estudo, o ADN genómico (gDNA) foi extraído de condrócitos humanos cultivados com número variável de passagens. O nível de metilação de gDNA foi detectado utilizando um ensaio dot blot de metilação específica. Nesta abordagem dot blot, uma mistura de gDNA contendo o ADN metilado a ser detectado foi manchada directamente sobre uma membrana N + como um ponto dentro de um padrão de molde circular previamente desenhado. Em comparação com outras abordagens de blotting baseadas em electroforese em gel e outros processos de transferência de blot, o método dot blot economiza tempo significativo. Além disso, as transferências de pontos podem detectar o nível geral de metilação do ADN utilizando um anticorpo 5-mC comercialmente disponível. Descobrimos que o nível de metilação do DNA diferiu entre as subcultações monocamadas e, portanto, poderia desempenhar um papel chave na desdiferenciação dos condrócitos. A mancha ponto 5-mC é um método confiável, simples e rápido para detectar o nível geral de metilação do DNA para avaliarE fenótipo condrócito.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O implante de condrócitos autólogos (IAC) é um procedimento relativamente novo e de última geração para o tratamento de defeitos da cartilagem articular 1 , 2 . Um dos passos cruciais no ACI é a amplificação de condrócitos através da cultura monocamada in vitro . Durante a amplificação, os condrócitos hialinos perdem facilmente o seu fenótipo e se tornam desdiferenciados, o que é indesejável para o tratamento com ACI 3 , 4 . Para optimizar o resultado do tratamento com ACI, a extensão da desdiferenciação dos condrócitos deve ser determinada antes da replantação. É imperativo estabelecer uma maneira econômica e rápida de determinar o status dos condrócitos. Recentemente, a associação entre metilação do DNA e desdiferenciação de condrócitos atraiu muita atenção 4 , 5 , 6 . A metilação do DNA é um processoGrupos metilo são adicionados ao ADN, resultando na conversão de resíduos de citosina em 5-metilcitosina (5-mC).

Para elucidar a biologia da metilação do DNA na desdiferenciação dos condrócitos, o primeiro passo é avaliar o nível de metilação do DNA dos condrócitos, que até agora tem se mostrado desafiador. A sequenciação genômica do bisulfito é a técnica mais utilizada para analisar a metilação do DNA 7 , 8 . Neste ensaio, a conversão de bisulfito provoca a degradação do ADN, e assim uma quantidade substancial de amostra deve ser proporcionada para o ensaio. Além disso, a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) foi utilizada para quantificar os níveis globais de metilação do DNA 9,10. No entanto, a análise por HPLC requer digestão com ADN genómico. Além disso, são necessários instrumentos experimentais avançados e caros. Portanto, além do alto custo, esses procedimentos experimentais são contra-tempoUming Os anticorpos anti-5-mC tornaram-se agora comercialmente disponíveis, o que criou a possibilidade de imunotransferência de ADN genómico contendo 5 mC a partir de genomas complexos.

Neste relatório, extraímos DNA genômico de condrócitos cultivados em uma série de culturas monocamadas. Utilizou-se um ensaio dot blot para avaliar o teor de 5-mC em condrócitos humanos com diferentes números de passagens. Verificou-se que o teor de 5-mC foi aumentado em condrócitos altamente desdiferenciados em comparação com condrócitos com desdiferenciação de baixo grau. Além disso, identificamos uma relação entre o status de desdiferenciação e os níveis de 5-mC. Finalmente, relatamos que as alterações no conteúdo de 5 mC foram associadas ao fenótipo condrócito. Deste modo, o ensaio de dot blot de 5 mC é um método fiável, simples e rápido para detectar o nível de metilação do ADN em condrócitos.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Humana do Segundo Hospital Popular de Shenzhen.

1. Coleção de Tecidos de Cartilagem Articular Humana e Cultura de Condrócitos

  1. Preparação de materiais
    1. Preparar meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro bovino fetal e 1% de penicilina-estreptomicina. Preparar 1 mg / mL de colagenase II, 0,25% de tripsina-EDTA, solução salina tamponada com fosfato (PBS) e um filtro de células (nylon 40 μm).
  2. Coleção de tecido da cartilagem articular humana
    1. Isolar a cartilagem articular das articulações do joelho dos pacientes doadores após o trauma. Obter o consentimento informado de todos os participantes.
    2. Corte a cartilagem em 1-2 mm 3 pedaços usando um bisturi estéril e digerir condrócitos da cartilagem picada com 1 mg / ml de colagenase II em DMEM a 37 ° C durante 12-16 h.
    3. Filtrar o resultado celL de suspensão através de um filtro de células (40 μm) e lavagem duas vezes com PBS.
    4. Contar as células com um hemocitómetro e semente a uma densidade de 20.000-30.000 células / cm 2 em DMEM suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina.
    5. Cultura em incubadora a 37 ° C.
  3. Expansão de condrócitos monocamadas
    1. Colheita de células sub-confluentes usando 0,25% de tripsina-EDTA e re-placa a uma densidade de 6,600 células / cm 2 . Alterar o meio duas vezes por semana.
    2. Cultura de condrócitos em monocamadas para até seis passagens e avaliar nas passagens 1, 2, 3, 4 e 5.

2. Extração de DNA genômico (gDNA)

  1. Recolher as células e ressuspender em 500 μL de tampão de lise (Tris 15 mM, pH 8,0, EDTA 10 mM, pH 8,0, SDS a 0,5%, RNase A 200 μg / mL) por 10 milhões de células. Ressuspender as células por pipetagem e rápida inversão e, em seguida, incubar durante 1 h a 37 ° C.
  2. UMADd proteinase K a uma concentração de 160 μg / mL de lisado celular e inverter a mistura vigorosamente. Incubar 6 h a 55 ° C.
  3. Adicionar um volume de Tris pH 7,9 saturado fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (25: 24: 1) para a amostra. Vortex ou agitar a amostra cuidadosamente à mão durante aproximadamente 20 s.
  4. Centrifugar a amostra à temperatura ambiente durante 5 min a 13 000 x g. Remover a fase aquosa superior e transferir a camada para um tubo fresco.
  5. Extrair com um volume igual de clorofórmio para remover fenol e transferir a fase aquosa superior para um tubo fresco.
  6. Precipitar o ADN adicionando 0,1 volume de amostra de acetato de sódio 3 M pH 8,0 e 2 volumes de etanol a 100%.
  7. Armazenar o tubo a -20 ° C durante a noite para precipitar o gDNA.
  8. Centrifugar a amostra a 4 ° C durante 10 min a 16000 xg para sedimentar gDNA.
  9. Lavar a amostra três vezes com etanol a 70% e centrifugar a 4 ° C durante 2 min a 13 000 x g.
  10. Remover o supernatanT cuidadosamente e depois secar ao ar. Ressuspender o ADN em Tris 10 mM pH 8,0, EDTA 0,1 mM.

3. Perfis de metilação de ADN

  1. Utilizar um kit de metilação de ADN para realizar a reacção de conversão de bissulfito utilizando um total de 500 ng do ADN genómico, de acordo com o protocolo do fabricante. Eluir em 10 μL de tampão de eluição (50 ng / μL).
  2. Realizar o perfilamento de metilação do DNA usando um kit comercial de acordo com o protocolo do fabricante.

4. Dot Blot Analysis

  1. Desnaturação do ADN isolado (1 mg por amostra) em NaOH 0,1 M durante 10 min a 95 ° C. Neutralize o DNA com NH4OAc 1 M em gelo e depois dilua duas vezes. Spot 2 μL do DNA genômico diluído em série em uma membrana N + .
  2. Misturar a membrana a 80 ° C durante 30 min.
  3. Bloquear locais de ligação a anticorpos não específicos por imersão da membrana N + em BSA a 5% em TBS-T durante 1 h. Use uma placa de Petri de 10 cm comoCâmara de iões à temperatura ambiente.
  4. Após lavagem de 5 min três vezes em TBST, incubar a membrana com um anticorpo monoclonal de rato anti-5-metilcitosina (5: mC) (1: 1000) em TBS-T a 4 ° C de um dia para o outro.
  5. Lavar a membrana durante 5 min três vezes em TBS-T, e depois incubar com um anticorpo secundário, imunoglobulina-G (IgG) de ovelha conjugada com HRP (1: 5000) em TBS-T durante 1 h à temperatura ambiente.
  6. Lavar a membrana durante 5 min três vezes em TBS-T.
  7. Adicionar o substrato enzimático à membrana e incubar durante 5-10 min. Visualize o sinal de anticorpo secundário utilizando um kit de quimioluminescência de acordo com as instruções do fabricante.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os condrócitos foram cultivados numa monocamada até à passagem 6 (P6). Os condrócitos mostraram alterações fenotípicas progressivas com passagens sucessivas da cultura monocamada. A morfologia dos condrócitos P0 foi redonda, enquanto que as células tornaram-se altamente comprimidas e achatadas com passagens sucessivas até P6 ( Figura 1 ). Esta alteração morfológica é típica do processo de desdiferenciação dos condrócitos. Entretanto, os resultados do mapa de calor indica...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A desdiferenciação de condrócitos in vitro compromete gravemente o desfecho da ACI no tratamento da reparação de defeitos da cartilagem 11,12. Para otimizar o resultado do ACI, é crucial evitar o uso de condrócitos desdiferenciados 13 . Estudos sugeriram que o nível geral de metilação do DNA está associado à extensão da desdiferenciação dos condrócitos 4,6. Assim, é imperativo estabelecer um método fiável e rápido para detectar o estado geral de metilação do ADN dos condrócitos antes da ...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado pelas seguintes subvenções: Natural Science Foundation of China (No. 81572198; No. 81260161; No. 81000460); Fundação de ciência natural da província de Guangdong, China (No. 2015A030313772); Projeto financiado da fundação da ciência de Postdoctoral de China (No. 2013M530385); A Fundação de Pesquisa Médica da Província de Guangdong, China (No. A2016314); Shenzhen Science and Technology Projects (No. JCYJ20160301111338144; No. JSGG20151030140325149; No. JSGG20140519105550503; No.GJHZ20130412153906739; No. JCYJ20140414170821160; No.JCYJ20140414170821200).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Reagents
DMEMGibco Inc.11965– 092Quente em 37 &graus; C banho-maria antes
do uso Solução salina tamponada com fosfato (PBS)HyClone Inc.SH30256.01BD-PBS, livre de Ca2+/Mg2+
FBSGibco Inc.10099-141
0,25% de tripsina / EDTAGibco Inc.25200-056
1% Penicilina-EstreptomicinaGibco Inc.15140-122
ClorofórmioMallinckrodt4440
Álcool IsoamílicoSigmaI-3643
FenolGibco BRL15513-039
Proteinase KGibco BRL24568-2
Tampão TAE Bio Whittaker16-011V
Gibco BRL15230-170
1 M Tris-HClBiosharp Inc.BL514A
Tween20Biotopped Inc.
BSAProliant Inc.68700
Colgenase, Tipo IISigma-AldrichC6885
[cabeçalho]
Equipamento
HemocitômetroISOLAB Inc.075.03.001
de 353003Corning de prato Falcon 100 mm
TPP AG91050esterilizada por gama
Eppendorf5804R
ThermoMixerMIULABMTH-100
Incubadora de células de dióxido de carbonoThermo scientific3111
Sistema de análise por quimiografiaUVITEC CambridgeALLIANCE
Água Destilada C58H114O26 Tubos de centrífuga Centrífuga de alta velocidade

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brittberg, M., et al. Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation. N Engl J Med. 331, 889-895 (1994).
  2. Pareek, A., et al. Long-Term Outcomes After Autologous Chondrocyte Implantation: A Systematic Review at Mean Follow-Up of 11.4 Years. Cartilage. 7 (4), 298-308 (2016).
  3. Duan, L., et al. Cytokine networking of chondrocyte dedifferentiation in vitro and its implications for cell-based cartilage therapy. Am J Transl Res. 7 (2), 194-208 (2015).
  4. Ma, B., et al. Gene expression profiling of dedifferentiated human articular chondrocytes in monolayer culture. Osteoarthritis Cartilage. 21 (4), 599-603 (2013).
  5. Duan, L., Liang, Y., Ma, B., Zhu, W., Wang, D. Epigenetic regulation in chondrocyte phenotype maintenance for cell-based cartilage repair. Am J Transl Res. 7 (11), 2127-2140 (2015).
  6. Duan, L., et al. DNA methylation profiling in chondrocyte dedifferentiation in vitro. J Cell Physiol. , [Epub ahead of print] (2016).
  7. Bhat, S., et al. DNA methylation detection at single base resolution using targeted next generation bisulfite sequencing and cross validation using capillary sequencing. Gene. , (2016).
  8. Shi, X. W., et al. Exploring Genome-wide DNA Methylation Profiles Altered in Kashin-Beck Disease Using Infinium Human Methylation 450 Bead Chips. Biomed Environ Sci. 29 (7), 539-543 (2016).
  9. Li, X. L., et al. Optimization of an HPLC Method for Determining the Genomic Methylation Levels of Taxus Cells. J Chromatogr Sci. 54 (2), 200-205 (2016).
  10. Maghbooli, Z., et al. Global DNA methylation as a possible biomarker fordiabetic retinopathy. Diabetes Metab Res Rev. 31 (2), 183-189 (2015).
  11. Barlic, A., Drobnic, M., Malicev, E., Kregar-Velikonja, N. Quantitative analysis of gene expression in human articular chondrocytes assigned for autologous implantation. J Orthop Res. 26 (6), 847-853 (2008).
  12. Legendre, F., et al. Enhanced hyaline cartilage matrix synthesis in collagen sponge scaffolds by using siRNA to stabilizechondrocytes phenotype cultured with bone morphogenetic protein-2 under hypoxia. Tissue Eng Part C Methods. 19 (7), 550-567 (2013).
  13. Niethammer, T. R., et al. Analysis of the autologous chondrocyte quality of matrix-based autologous chondrocyte implantation in the knee joint. Int Orthop. 40 (1), 205-212 (2016).
  14. Hayatsu, H. The bisulfite genomic sequencing used in the analysis of epigenetic states, a technique in the emerging environmental genotoxicology research. Mutat Res. 659 (1-2), 77-82 (2008).
  15. Haque, N., Nishiguchi, M. Bisulfite sequencing for cytosine-methylation analysis in plants. Methods Mol Biol. 744, 187-197 (2011).
  16. Ananiev, G. E., et al. Optical mapping discerns genome wide DNA methylation profiles. BMC Mol Biol. 9, 68(2008).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Dot Blot de 5 MetilcitosinaEnsaio de Metila o do DNAExtra o de DNA Gen micoProcedimento de Dot BlotDetec o por Anticorpo 5 mCAn lise do Fen tipo de Condr citosImplante de Condr citos Aut logosM todo de Desnatura o do DNADetec o por Quimiluminesc ncia

Artigos relacionados