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Developmental Biology

दो और तीन आयामी embryoid निकायों में मूषक भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं की रेटिनोइक एसिड प्रेरित तंत्रिका विभेदन का विश्लेषण

Published: April 22, 2017 doi: 10.3791/55621
Automatic Translation
1, 2, 1, 1,3
1Department of Medicine, Cardeza Vascular Research Center, Sidney Kimmel Medical College, Thomas Jefferson University, 2Department of Molecular Cardiology, Cleveland Clinic Foundation, 3Department of Cancer Biology, Cardeza Vascular Research Center, Sidney Kimmel Medical College, Thomas Jefferson University

Summary

हम दो या तीन आयामी embryoid निकायों पैदा करने के लिए murine भ्रूण स्टेम कोशिकाओं का उपयोग कर के लिए एक तकनीक का वर्णन। हम तो रेटिनोइक एसिड, और कैसे द्वारा embryoid शरीर की कोशिकाओं के तंत्रिका भेदभाव प्रेरित करने के लिए कैसे पूर्वज सेल मार्कर इम्यूनोफ्लोरेसेंस और immunoblotting द्वारा भेदभाव के अपने राज्य का विश्लेषण करने के लिए समझाने।

Abstract

माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ESCs) ब्लास्टोसिस्ट (आमतौर पर दिन E3.5 पर) के भीतर बड़े पैमाने पर से अलग, जल्दी भ्रूण के विकास के अध्ययन के लिए इन विट्रो मॉडल प्रणाली के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता। ल्यूकेमिया निरोधात्मक कारक (LIF) के अभाव में, ESCs तंत्रिका अग्रदूत कोशिकाओं में डिफ़ॉल्ट रूप से अंतर। वे प्रारंभिक चरण भ्रूण को इसकी समानता के कारण एक तीन आयामी (3 डी) में जमा कर रखे जा सकती है, गोलाकार कुल embryoid शरीर (ईबी) करार दिया। ईबीएस, फ़ाइब्रोनेक्टिन लेपित coverslips पर वरीयता प्राप्त किया जा सकता है जहां वे दो आयामी (2 डी) एक्सटेंशन बढ़ रही द्वारा विस्तार, या 3 डी कोलेजन मैट्रिक्स, जहां वे spheroids के रूप में बढ़ जारी रखने, और तीन रोगाणु परतों में भेद में प्रत्यारोपित: endodermal, mesodermal, और बहिर्जनस्तरीय। 3 डी कोलेजन संस्कृति 2 डी ईबीएस की तुलना में अधिक बारीकी से इन विवो वातावरण की नकल करता। 2 डी ईबी संस्कृति इम्यूनोफ्लोरेसेंस और भेदभाव को ट्रैक करने के immunoblotting द्वारा विश्लेषण की सुविधा। हम एक दो कदम तंत्रिका वैशिष्ट्य का विकास किया हैtion प्रोटोकॉल। पहले चरण में, ईबीएस फांसी ड्रॉप तकनीक द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं, और, एक साथ, रेटिनोइक एसिड (आरए) के संपर्क से अलग करने के लिए प्रेरित किया जाता है। दूसरे चरण में, आरए के अभाव में एक 2 डी या 3 डी प्रारूप में तंत्रिका भेदभाव आय।

Introduction

ESCs ब्लास्टोसिस्ट आंतरिक कोशिका द्रव्यमान से उत्पन्न होते हैं। इन कोशिकाओं को, pluripotent हैं यानी वे मूल के जीव के किसी भी प्रकार की कोशिका में अंतर करने के लिए क्षमता है। ESC इन विट्रो भेदभाव विकास के रास्ते और तंत्र की जांच के लिए एक प्रायोगिक प्रणाली के रूप में व्यापक ब्याज की है। यह सेल और ऊतक शिथिलता के सुधार के लिए नई चिकित्सा दृष्टिकोणों को परीक्षण करने के लिए एक शक्तिशाली और लचीला मॉडल प्रणाली प्रदान करता है। ईबीएस जल्दी embryogenesis दौरान सेल भेदभाव के कई पहलुओं पुनरावृत्ति। विशेष रूप से, ईबीएस जब भ्रूण घातकता को यह मुश्किल भ्रूण दोष 1, 2 के सेलुलर आधार निर्धारित करने में आता है इस्तेमाल किया जा सकता। ईबीएस फांसी ड्रॉप या तरल निलंबन तकनीक 3 से या तो गठित किया जा सकता। पूर्व का लाभ लगातार आकार और घनत्व के ईबीएस उत्पन्न करने के लिए, इस प्रकार प्रयोगात्मक reproducibility को सुविधाजनक बनाने की क्षमता है।

4 इंटीग्रिन कोशिका-सतह के 10 प्रकार के द्वारा मान्यता प्राप्त है।

आरए विटामिन ए कि तंत्रिका भेदभाव 5, 6 को प्रेरित करता है की एक छोटी lipophilic मेटाबोलाइट है। आरए की उच्च सांद्रता तंत्रिका जीन की अभिव्यक्ति को बढ़ावा देने और ईबी गठन 7, 8 के दौरान mesodermal जीन अभिव्यक्ति represses। आरए एक ऑक्सीकरण विटामिन या तो शराब या रेटिनोल डिहाइड्रोजनेज, retinaldehyde डिहाइड्रोजनेज 9 से अंतिम उत्पाद के लिए retinaldehyde ऑक्सीकरण के बाद से retinaldehyde करने द्वारा निर्मित है। तंत्रिका भेदभाव कोशिका द्रव्य से आरए के परिवहन की आवश्यकता है सेलुलर आरए बाध्यकारी प्रोटीन 2 (CRABP2) द्वारा नाभिक के लिए। नाभिक में, आरए अपने सजातीय रिसेप्टर एक RAR-RXR heterodimer के 10 से मिलकर जटिल को बांधता है। यह ट्रांस्क्रिप्शनल सह activators की भर्ती, और प्रतिलेखन 9, 11 की दीक्षा का परिणाम है। इसके अलावा, आरए फॉस्फोरिलेटेड (सक्रिय) SMAD1 की गिरावट को बढ़ावा देता है, इस प्रकार बीएमपी और SMAD संकेत 12 antagonizing। इन गतिविधियों के अलावा, आरए Pax6 अभिव्यक्ति, एक प्रतिलेखन कारक तंत्रिका भेदभाव 13 का समर्थन करता है कि बढ़ जाती है। आरए संकेतन sirtuin -1 (SIRT1), एक परमाणु निकोटिनामाइड एडीनाइन डाईन्यूक्लियोटाइड (NAD +) द्वारा ठीक किया जाता है - निर्भर एंजाइम है कि CRABP2 deacetylates, नाभिक के लिए अपने अनुवादन के साथ दखल दे, और इसलिए आरए RAR-RXR heterodimer के 14, 15 के लिए बाध्य के साथ, 16।

e_content "> यहाँ वर्णित आरए इलाज ईबी प्रोटोकॉल को डिजाइन करने में हमारा लक्ष्य आदेश संकेत दे रास्ते कि neuronal अग्रदूत कोशिकाओं में ESC भेदभाव को विनियमित की इन विट्रो विश्लेषण की सुविधा में तंत्रिका भेदभाव का अनुकूलन है। इस प्रोटोकॉल के लाभों में से एक की सुविधा है इम्यूनोफ्लोरेसेंस। 3 डी ईबीएस द्वारा कोशिकाओं के कार्य का विश्लेषण अच्छी तरह से एंटीबॉडी द्वारा प्रवेश और दौरान तंत्रिका भेदभाव कोंफोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा immunolabeling और कोशिकाओं की इमेजिंग की सुविधा विशिष्ट समय बिंदुओं पर एक 2 डी monolayer में छवि। ईबी पृथक्करण के लिए मुश्किल हैं नहीं कर रहे हैं।

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Protocol

1. माउस भ्रूणीय Fibroblasts की संस्कृति (MEFs)

  1. MEF मध्यम तैयार करें, Dulbecco संशोधित ईगल के मध्यम (DMEM, उच्च ग्लूकोज), 15% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के साथ पूरक।
  2. कोट 100 मिमी कमरे के तापमान पर 30 मिनट (आर टी) के लिए 0.5% जिलेटिन समाधान के साथ सेल संस्कृति व्यंजन।
  3. एक कोशिकामापी का उपयोग कर MEFs की गणना करें। जिलेटिन समाधान निकालें और तुरंत डालना MEF मध्यम 37 डिग्री सेल्सियस के लिए पहले से गरम। तेजी से 2 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में mitomycin सी इलाज MEFs की शीशियों पिघलना, तो प्रति 100 मिमी जिलेटिन में लिपटे पकवान 2.8 x 10 6 MEFs बीज। तदनुसार यदि अन्य आकार के बर्तन का उपयोग कर सेल नंबर समायोजित करें। 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर रात में MEFs सेते हैं।
  4. अगले दिन मध्यम बदलें। MEF परत जब तक 2-3 दिनों के लिए संस्कृति संगामी है।

2. माउस ESC संस्कृति

  1. ESC मध्यम तैयार करें, Iscove के संशोधित है Dulbecco मध्यम (IMDM) 15% एफबीएस और 10 के साथ पूरक3 यू / एमएल ल्यूकेमिया निरोधात्मक कारक (LIF), 0.1 मिमी अनावश्यक अमीनो एसिड होता है, 55 मिमी 2-mercaptoethanol, पेनिसिलिन (100 यू / एमएल), स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 माइक्रोग्राम / एमएल), जेंटामाइसिन (200 माइक्रोग्राम / एमएल), और 0.2% माइकोप्लाज़्मा एंटीबायोटिक।
  2. चरण 1 में तैयार पकवान से MEF मध्यम निकालें और 37 डिग्री सेल्सियस पूर्व गर्म ESC माध्यम के साथ बदलें।
  3. एक ESC शीशी और MEF परत के शीर्ष पर बीज कोशिकाओं डीफ्रोस्ट। 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 में सेते हैं, जब तक ESCs संगम तक पहुँचते हैं।
  4. नए सेल संस्कृति MEFs के एक सहधारा monolayer युक्त व्यंजन तैयार करें। पारित होने के लिए ESCs, पीबीएस के साथ एक बार धोने और 0.25% ट्रिप्सिन साथ / 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 में 2-5 मिनट के लिए EDTA अलग। अलग करने की कोशिकाओं के लिए 15% एफबीएस के साथ नए सिरे IMDM जोड़कर trypsinization बंद करो, आरटी पर 5 मिनट के लिए 160 XG पर एक 15 एमएल ट्यूब सेल निलंबन, और अपकेंद्रित्र हस्तांतरण।
  5. सतह पर तैरनेवाला, ताजा IMDM और पारित होने के प्रत्येक नए MEF में लिपटे पकवान के लिए कोशिकाओं की पांचवां साथ resuspend ESCs निकालें; कोशिकाओं तक सेतेसंगम (आमतौर पर 4-5 दिन) तक पहुँचते हैं।

3. जिलेटिन में लिपटे प्लेट्स पर MEFs और संस्कृति ESCs वापस लेने

  1. एक बार जब ECSs संगम पर पहुंच गया, कदम 2.4 में के रूप में 0.25% ट्रिप्सिन / EDTA के साथ उन्हें और MEFs अलग, ताजा IMDM में कोशिकाओं resuspend, एक गैर चिपकने वाला जीवाणु पेट्री डिश में स्थानांतरित, और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ पर 40 मिनट के लिए सेते हैं 2।
  2. ध्यान से ESCs और एक 5 एमएल पिपेट का उपयोग एक नया जिलेटिन में लिपटे थाली MEFs युक्त मध्यम हस्तांतरण, pipetting दोहराया से परहेज। के बाद से ESCs पालन नहीं करते कोशिकाओं पेट्री डिश में शेष, MEFs हैं।
  3. मार्ग ESCs हर 3-4 दिन। लगातार कम passaging के लिए ESC pluripotency कम कर सकते हैं। 60% संगम से आगे न जाएं, क्योंकि यह भेदभाव के पक्ष में हो सकता है।
  4. दोहराएँ 3.2-3.3 तीन बार या उससे अधिक कदम के रूप में आवश्यक है, जब तक MEFs एक 20x उद्देश्य का उपयोग, सुनिश्चित करें कि MEFs मौजूद नहीं हैं बनाने के लिए, एक सेल संस्कृति माइक्रोस्कोप से नहीं रह गया है पता लगता है।
  5. ESC की जाँच करके ESC pluripotency सत्यापित करेंयदि कोशिकाओं ठेठ ESC बहुभुज आकृति विज्ञान (चित्रा 1 ए) के साथ घने कालोनियों फार्म संस्कृति को देखने के लिए। मात्रात्मक रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस पोलीमरेज़ चेन प्रतिक्रिया (QRT- पीसीआर) 17, 17 immunoblotting, या कोर pluripotency प्रतिलेखन के इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा टेस्ट सेल stemness कारक 17 (चित्रा 2)।

4. ईबी गठन

  1. अखिल ट्रांस-आरए शेयर 10 मिमी पर DMSO में 1.5 एमएल प्रकाश संरक्षित microfuge ट्यूबों में समाधान, और विभाज्य तैयार करें। समाधान अप करने के लिए दो सप्ताह के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर है। प्रकाश से बचाने के।
  2. कदम 2.4 में के रूप में Trypsinize ESCs; LIF बिना ताजा IMDM में replate, एक एकल कोशिका निलंबन के रूप में।
  3. एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं गणना, और 0.5 सुक्ष्ममापी आरए साथ IMDM में एक 5 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल निलंबन तैयार करते हैं।
  4. प्लेट 100 100 म पेट्रि डिश प्रति एक 8 चैनल विंदुक के साथ और 20 μL-बूँदें 200 μL टिप्स, invertव्यंजन, और सुखाने से लटका बूंदों को रोकने के लिए पीबीएस के साथ उल्टे ढक्कन भरें। प्रकाश से RA-युक्त संस्कृति मीडिया को सुरक्षित रखें।
  5. फांसी में संस्कृति ईबीएस 4 दिनों के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 में चला जाता है।

5. 2 डी ईबी संस्कृति

  1. कोट 12 मिमी आरटी पर 30 मिनट के लिए 30 माइक्रोग्राम / एमएल फ़ाइब्रोनेक्टिन साथ परिपत्र कांच coverslips। एक 24 अच्छी तरह से थाली के एक कुएं में प्रत्येक coverslip रखें, और अच्छी तरह से प्रति 1 एमएल IMDM जोड़ें।
  2. हार्वेस्ट 3 दिन देसी 200 μL विंदुक युक्तियाँ के साथ एक के बाद फांसी ड्रॉप ईबीएस एक और अच्छी तरह से प्रति, फ़ाइब्रोनेक्टिन लेपित coverslips पर उन्हें बीज 20 ईबीएस, एक ही विंदुक युक्तियाँ का उपयोग।
    नोट: क्योंकि वे coverslips के लिए बेहतर पालन 3 दिन ईबीएस 4 दिन ईबीएस से अधिक बेहतर हैं।
  3. LIF बिना IMDM-15% एफबीएस के साथ संस्कृति को जारी रखें। हर 3-4 दिनों मध्यम बदलें। आवश्यकतानुसार प्रोटीन स्राव विश्लेषण के लिए उपयोग किए गए माध्यम इकट्ठा।

6. स्रावित प्रोटीन की जांच

  1. ईबी मेडी के 500 μL स्थानांतरणउम 10 केडीए-कटौती केन्द्रापसारक फिल्टर, 4 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए 20,000 XG पर स्पिन।
  2. मध्यम केन्द्रापसारक फिल्टर के अंदर शेष अत्यधिक संवर्धन को रोकने के लिए हर 15-20 मिनट की जांच करना। centrifugation बंद करो जब शेष माध्यम की मात्रा 25 μL करने के लिए गिर गया है।
  3. फिल्टर inverting और 4 डिग्री सेल्सियस पर 160 XG पर कताई, निर्माता के निर्देशों के बाद शेष केंद्रित मध्यम इकट्ठा।
  4. विशिष्ट एंटीबॉडी 17 के साथ immunoblotting द्वारा स्रावित प्रोटीन का पता लगाने।

7. 3 डी ईबी संस्कृति

  1. ईबीएस कदम 5.2 में वर्णित के रूप बूँदें फांसी में 4 दिनों के लिए बड़ा हो गया इकट्ठा, और उन्हें 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब (ट्यूब प्रति 30 EBS) में रखें।
  2. 3 डी कोलेजन संस्कृति किट का निर्देश (देखें सामग्री / उपकरण तालिका) निम्नलिखित कोलेजन जेल समाधान तैयार करें। कोलेजन समाधान और 5x DMEM (एक किट घटक) की उचित मात्रा में पतला; n जोड़नेeutralization समाधान (एक किट घटक) और मिश्रण अच्छी तरह से तुरंत, और बर्फ पर रखें।
  3. ईबीएस युक्त 1.5 एमएल ट्यूब में ठंडा कोलेजन समाधान की एक उचित मात्रा पिपेट, और धीरे से एक 1 एमएल विंदुक टिप का उपयोग कर एक 6 अच्छी तरह से थाली के कुओं में स्थानांतरित। बुलबुले बनाने से बचें।
  4. इसके तत्काल बाद, 60 मिनट के लिए कोलेजन बहुलकीकरण शुरू करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 के लिए थाली हस्तांतरण।
  5. IMDM साथ ईबी युक्त थाली ओवरले।
  6. मध्यम बदलें हर 3-4 दिन।

8. ईबी हदबंदी

  1. दिन 4 ईबीएस 200 μL विंदुक युक्तियाँ के साथ, एक के बाद एक (चरण 4 से) इकट्ठा करने और उन्हें 15% एफबीएस के साथ एक गैर चिपकने वाला जीवाणु पेट्री डिश IMDM युक्त करने के लिए हस्तांतरण; 37 डिग्री सेल्सियस, 4 दिनों के लिए 5% सीओ 2 में संस्कृति। सुनिश्चित करें कि वे नीचे करने के लिए संलग्न नहीं करना ईबीएस दो बार हर दिन की जाँच करें; धीरे नीचे करने के लिए ईबी लगाव को रोकने के लिए पकवान हिला।
  2. पर 5 मिनट के लिए 185 XG पर ईबीएस अपकेंद्रित्रआर टी, एक benchtop अपकेंद्रित्र में।
  3. supernatants निकालें। गोली प्रत्येक ट्यूब में 100 μL अधिक नहीं होनी चाहिए।
  4. ईबीएस 1 एमएल 0.25% प्रकार मैं ट्यूब प्रति collagenase, पीबीएस में 20% एफबीएस के साथ पूरक pelleted में जोड़े।
  5. , 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 में 1 घंटे के लिए EB-कोलैजिनेज़ मिश्रण सेते यह धीरे pipetting हर 20 मिनट, 1 एमएल विंदुक टिप का उपयोग करके।
  6. कोशिकाओं धीरे पीबीएस के साथ 3x धो लें। सेल समुच्चय मौजूद हैं, एक 100 सुक्ष्ममापी जाल के साथ एक सेल छन्नी का उपयोग उन्हें हटाने के लिए।
  7. IMDM में एक जिलेटिन में लिपटे 60 मिमी बर्तन पर कोशिकाओं replate। फिर 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 में सेते हैं।

9. Dissociated ईबीएस के अभिकर्मक

  1. QRT- पीसीआर और immunoblotting, कोट 0.5% जिलेटिन के साथ एक 6 अच्छी तरह से थाली के लिए।
  2. इम्यूनोफ्लोरेसेंस, आरटी पर 30 मिनट के लिए 30 माइक्रोग्राम / एमएल फ़ाइब्रोनेक्टिन साथ कोट कांच coverslips के लिए। एक 24 अच्छी तरह से थाली के एक कुएं में प्रत्येक coverslip रखें। IMDM जोड़ें।
  3. बीज 4.75 x 10 5 या 1 x 10 5
  4. अभिकर्मक से पहले 70% संगम करने के लिए कोशिकाओं की संख्या बढ़ाएं।
  5. एक nonliposomal लिपिड स्टेम कोशिका इष्टतम अभिकर्मक 17 से कोशिकाओं transfect (देखें सामग्री / उपकरण तालिका), निर्माता के निर्देशों के।
    ध्यान दें: अभिकर्मक हम इस्तेमाल किया आम तौर पर 50% की अभिकर्मक दक्षता पर पहुंच गया (प्रतिनिधि परिणाम देखें)।
  6. QRT- पीसीआर द्वारा या क्रमशः 17 2 या 3 दिन अभिकर्मक के बाद immunoblotting, द्वारा नमूनों का विश्लेषण करें।

इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा ईबी विभेदन की 10 विश्लेषण

  1. धो 2 डी ईबीएस या पीबीएस के साथ अलग 3 डी ईबीएस और आरटी पर 30 मिनट के लिए पीबीएस में 4% paraformaldehyde के साथ ठीक। धो तय कोशिकाओं पीबीएस के साथ 3 गुना चल सेल मलबे को हटाने के लिए।
    नोट: Paraformaldehyde एक त्वचा और आंखों अड़चन है; सावधानी बरतें जब यह से निपटने के। पीबीएस में 1% ट्राइटन X-100 जोड़े आरटी पर 20 मिनट के लिए कोशिकाओं permeabilize के लिए, तो पीबीएस के साथ 3x धोने।
  2. पीबीएस निकालें और 30 मिनट के लिए पीबीएस में 5% बीएसए के साथ ब्लॉक।
  3. 1% बीएसए में प्राथमिक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने को तैयार / पीबीएस 0.03% ट्राइटन X-100 के साथ पूरक। प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान द्वारा अवरुद्ध समाधान बदलें। आरटी पर 3 घंटे के लिए सेते हैं, या रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर, तो कोशिकाओं 3x पीबीएस के साथ धोएं।
  4. निर्माता के निर्देशों के अनुसार पीबीएस में माध्यमिक एंटीबॉडी लागू करें। आरटी पर 1 घंटे के लिए सेते हैं, तो धो कोशिकाओं पीबीएस के साथ 3 गुना।
  5. माउंट ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी के लिए एक विरोधी फीका माध्यम के साथ कांच स्लाइड पर coverslips।

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Representative Results

Oct4, Nanog, और Sox2 कोर प्रतिलेखन कारक है कि प्रदान के लिए ESC आत्म नवीकरण और pluripotency हैं। हम जंगली प्रकार से और आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों जहां Syx, एक जीन RhoA विशेष विनिमय कारक Syx के लिए कोडिंग, बाधित होता है की एक नस्ल से ESCs के तंत्रिका भेदभाव तुलना करने के लिए ऊपर प्रोटोकॉल लागू होता है। हम एंजियोजिनेसिस 18 में Syx फंसा था। / - - ESCs, और अगर Syx के तंत्रिका भेदभाव का परीक्षण करने के लिए रवाना - / - ESCs उनके Syx + / + समकक्षों की तुलना में तेजी से होता है हम ईबीएस के व्यवहार में अंतर Syx + / + और Syx से एकत्रित देखा।

Syx की प्रारंभिक अवस्था की तुलना करने के + / + और Syx - / - ESCs, हम प्रत्येक में मात्रा निर्धारित Oct4, Nanog, और Sox2, कोर प्रतिलेखन कारक टी की प्रचुरता जीनोटाइपटोपी प्रदान ESC आत्म नवीकरण और pluripotency। प्रोटोकॉल के 10 कदम में वर्णित है, ESCs Oct4, Sox2, और Nanog एंटीबॉडी द्वारा immunolabeled रहे थे। Syx + / + और Syx में 3 प्रतिलेखन कारक की प्रचुरता - / - के रूप में इम्यूनोफ्लोरेसेंस (चित्रा 2) और 17 immunoblotting (चित्रा 2) द्वारा निर्धारित ESCs, समान थे।

एक 3 डी कोलेजन मैट्रिक्स में प्रत्यारोपित ईबीएस (चित्रा 1 बी) सेलुलर एक्सटेंशन है कि एक 10X उद्देश्य, 2 दिन आरोपण के बाद के साथ एक सेल संस्कृति माइक्रोस्कोप पर दिखाई दे रहे अंकुरण शुरू करते हैं। दिन 6, 200 सुक्ष्ममापी या उससे कम की 5 से 10 अंकुरित सामान्य रूप से, Syx + / + ईबीएस में मनाया जा सकता Syx में जबकि बीच पर - / - ईबीएस, 30-50 अंकुरित अक्सर मनाया जाता है, जिनमें से अधिकांश अब 200 से सुक्ष्ममापी हैं , (चित्रा 1C)।

Syx से बढ़ाया कोशिकाओं - / - Syx + / + 2 डी ईबीएस (चित्रा 3 ए) से अधिक है। / - - कोशिकाओं है कि Syx + / + और Syx से बढ़ाया के तंत्रिका भेदभाव की दर की तुलना करने के लिए ईबीएस, हम तंत्रिका स्टेम कोशिका मार्कर nestin, एक मध्यवर्ती रेशा विनियामक प्रोटीन 19 से 2 डी संस्कृति के 6 दिन बाद उन्हें immunolabeled। Nestin की बहुतायत Syx से विस्तार कोशिकाओं में काफी अधिक था - / - ईबीएस (चित्रा 3 बी)। हम तो nestin और ट्यूबिलिन β3 की बहुतायत (Tubβ3), एक axonal cytoskeleton प्रोटीन 20, 13 दिन की 2 डी ईबीएस से अलग कक्षों में की तुलना में। उनके Syx + / + समकक्षों (चित्रा -3 सी) की तुलना में ईबीएस - / - दोनों प्रोटीन से Syx अलग कोशिकाओं में प्रचुर मात्रा में थे। हम immunoblo की मात्रा द्वारा इसी तरह के परिणाम प्राप्तएक ही प्रोटीन 17 की tting।

चित्रा 4 से पता चलता constitutively हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) द्वारा ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं सक्रिय RhoA (RhoA-Q63L) -fused एक स्टेम कोशिका इष्टतम अभिकर्मक अभिकर्मक (देखें सामग्री / उपकरण तालिका) का उपयोग करते हुए।

आकृति 1
चित्र 1: Syx + / + और Syx से स्प्राउट उभार - / - 3 डी संस्कृति में EBS। (ए) Syx + / + और Syx - / - ESCs तंत्रिका भेदभाव के शामिल होने से पहले क्लस्टर कालोनियों में वृद्धि हुई। (बी और सी) ईबीएस की छवियों 0.5 सुक्ष्ममापी आरए साथ बूँदें फांसी में गठन किया गया, और फिर चरणों 7.1-7.4 में वर्णित है, आरए के बिना एक 3 डी कोलेजन मैट्रिक्स में डाला। छवियाँ संकेत दिया उद्देश्यों से 6 दिन पर कब्जा कर लिया गया (स्केल ख आर्स = ए और सी में 100 सुक्ष्ममापी, बी में 200 सुक्ष्ममापी)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्र 2: pluripotency कोर प्रतिलेखन कारक की उपस्थिति। Syx + / + और Syx में संकेत कोर pluripotency मार्कर की प्रचुरता दिखा प्रतिनिधि छवियों - / - ESCs (स्केल बार = 50 सुक्ष्ममापी)। यांग एट अल देखें। Immunolabeling विधि की जानकारी के लिए 17 (स्केल बार = 50 सुक्ष्ममापी; DAPI, 2- (4-amidinophenyl) -1H -indole-6-carboxamidine)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

आंकड़ा 3 "src =" / फ़ाइलें / ftp_upload / 55,621 / 55621fig3.jpg "/>
चित्र 3: ईबी कोशिकाओं में तंत्रिका विभेदन मार्करों का विजुअलाइजेशन। 2 डी ईबी की (ए) चरण चित्र दिखाने से किनारों को कोशिकाओं में तेजी से विस्तार Syx - / - (= 200 सुक्ष्ममापी स्केल बार) Syx + / + ईबीएस से की तुलना में। दिखा रहा है कि तंत्रिका भेदभाव मार्कर nestin 6 दिन 2 डी Syx से विस्तार हो रहा कोशिकाओं में प्रचुर मात्रा में था (बी) इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियों - / - उनके Syx + / + समकक्षों (स्केल बार = 50 सुक्ष्ममापी) से की तुलना में ईबीएस। (सी) इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियों दिखा रहा है कि तंत्रिका भेदभाव मार्कर nestin और Tubβ3 से 13 दिन 3 डी Syx अलग कोशिकाओं में प्रचुर मात्रा में थे - उनके Syx + / + समकक्षों (स्केल बार = 50 सुक्ष्ममापी) से की तुलना में ईबीएस - /। होड़ लिए यहां क्लिक करेंइन आंकड़ों की वा बड़ा संस्करण।

चित्रा 4
चित्र 4: अभिकर्मक अभिकर्मक की क्षमता का विजुअलाइजेशन। constitutively सक्रिय RhoA द्वारा ट्रांसफ़ेक्ट ESCs दिखा इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियों के तीन प्रतिकृति GFP के लिए जुड़े हुए प्रोटोकॉल (स्केल बार = 50 सुक्ष्ममापी) के कदम 9.5 में इस्तेमाल किया अभिकर्मक के अभिकर्मक दक्षता वर्णन करने के लिए। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में हम murine ESCs के तंत्रिका भेदभाव का अध्ययन करने के एक अपेक्षाकृत सरल और सुलभ विधि प्रस्तुत करते हैं। पिछले प्रोटोकॉल में, आरए दिन 2 या ईबी फांसी ड्रॉप 8 में से 4 दिन में या निलंबन संस्कृति 7 से माध्यम से जोड़ा गया था, क्रमशः, या तुरंत बाद ईबी ड्रॉप एकत्रीकरण 21 फांसी। प्रोटोकॉल हम तैयार में, आरए पहले जोड़ा गया है। ईबीएस के लिए आर ए के पहले परिचय निलंबन संस्कृति द्वारा गठित होने के बावजूद, इस प्रोटोकॉल तंत्रिका भेदभाव मार्करों 8 के उच्च अभिव्यक्ति का उत्पादन किया।

यहाँ, हम आरए लागू करने और फांसी ड्रॉप संस्कृति के शुरू में तंत्रिका भेदभाव उत्प्रेरण का समर्थन किया। इस संशोधन ईबी एकत्रीकरण से पहले ESCs के बराबर आरए जोखिम की अनुमति देता है, जब वे एक एकल कक्ष निलंबन में अब भी कर रहे हैं। आरए एकत्रित ईबीएस में जोड़ा जाता है, ईबी भीतरी मास में कोशिकाओं आरए concentrati करने के लिए एक कम समझ होने की संभावना हैबाहरी परत में कोशिकाओं की तुलना में पर। ईबी एकत्रीकरण के शुरू में आरए का आवेदन भी फायदेमंद है क्योंकि यह बहिर्जनस्तरीय परत 7, 8 के तंत्रिका भेदभाव के पक्ष में endodermal और mesodermal रोगाणु परत विकास को दबा है। हम पुष्टि की है कि आरए उपचार 10 मार्करों 17 के करीब की बहुतायत का परीक्षण करके तंत्रिका भेदभाव को बढ़ावा दिया।

इस प्रोटोकॉल में तीन महत्वपूर्ण विचार कर रहे हैं। पहले MEF फीडर कोशिकाओं की अधिकतम हटाने एक उच्च शुद्धता के लिए ESC आबादी प्राप्त करने के लिए है। दूसरा आरए के प्रकाश के प्रति संवेदनशीलता है: अपने शेयर समाधान और फांसी बूंदों आरए आवेदन के बाद प्रकाश से संरक्षित किया जाना चाहिए। आरए शेयर समाधान केवल दो सप्ताह है, जिसके बाद एक ताजा समाधान तैयार रहना चाहिए के लिए स्थिर है। तीसरा विचार आरए एकाग्रता है। हमारे पायलट प्रयोगों में, हम 10 माइक्रोन आरए मंद कोशिकाओं की वृद्धि और समर्थक की एकाग्रता पर कि पायापेश छोटे आकार ईबीएस कम सांद्रता की तुलना में, शायद क्योंकि आरए एपोप्टोसिस उच्च conncentrations 22, 23 पर पैदा कर सकता है, 24। हम ने कहा कि 0.5 माइक्रोन की आरए एकाग्रता या तो उच्च 25 या कम सांद्रता में से अच्छी तरह से गठित ईबीएस की एक बड़ी संख्या का उत्पादन किया, और ईबीएस लगभग 200 सुक्ष्ममापी के एक औसत व्यास पर पहुंच गया है। बड़ा ईबीएस एक 10X उद्देश्य के क्षेत्र आकार से अधिक और थे, फलस्वरूप, छवि के लिए कड़ी मेहनत। इसलिए, हम इष्टतम आरए एकाग्रता के रूप में 0.5 सुक्ष्ममापी चुना है।

क्योंकि वे जमे हुए सेक्शनिंग के लिए भी भंगुर होते हैं 3 डी ईबीएस की इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा विश्लेषण समस्याग्रस्त है। इसके अलावा, हम में पाया गया कि जमे हुए ईबी वर्गों uncoated electrostatically का इलाज गिलास स्लाइड करने के लिए अच्छी तरह से टिक नहीं पाता। क्योंकि कुछ ईबीएस सब्सट्रेट करने के लिए अच्छी तरह से संलग्न नहीं है 2 डी ईबी संस्कृति की तैयारी, अतिरिक्त फांसी बूंदों के एकत्रीकरण की आवश्यकता है। ईबी dissociation है, जो अपेक्षाकृत धीमी है, कोलैजिनेज़ के साथ अपने गर्मी के दौरान ईबीएस ऊपर और नीचे एक 1.5 एमएल microfuge ट्यूब में pipetting द्वारा त्वरित किया जा सकता है।

Neurally विभेदित ESCs क्षतिग्रस्त अंतर्जात कोशिकाओं, पार्किंसंस रोग 26 से पीड़ित रोगियों के मस्तिष्क में द्रव्य नाइग्रा में खो जैसे डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स को बदलने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता। जबकि मानव ESC भेदभाव की वर्तमान तकनीक ईबी गठन (ibid।) की आवश्यकता नहीं है, ईबीएस अभी भी आण्विक स्तर पर तंत्रिका भेदभाव के विस्तृत विश्लेषण के लिए एक उपयोगी उपकरण है।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा वे कोई प्रतिस्पर्धा या वित्तीय हित हैं

Acknowledgments

इस अध्ययन एएच को एनआईएच अनुदान R01 HL119984 द्वारा समर्थित किया गया

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
MEFs EMD Millipore PMEF-CF ESC feeder layer
ESC EMD Millipore CMTI-2
Cell culture dish (60 mm) Eppendorf 30701119 Cell culture
Cell culture dish (100 mm) Falcon 353003 Cell culture
Petri dish (100 mm) Corning 351029 Hanging drops
24-well plate Greiner Bio-One 662160 2D EBs
6-well plate Eppendorf 30720113 Transfection
Dark 1.5 mL centrifuge tube Celltreat Scientific Products 229437 RA stock solution
Microscope cover-glass Fisherbrand 12-545-80 Circular, 12 mm diameter
Superfrost-plus microscope slides Fisherbrand 12-550-15
3D collagen culture kit EMD Millipore ECM675 3D culture
Effectene Transfection Reagent Qiagen 301427 Stem cell transfection
Microcon Centrifugal Filters (10 kDa) EMD Millipore MRCPRT010 Protein concentration
Name  Company Catalog Number Comments
Reagents
DMEM Lonza 12-709F MEFs culture
IMDM Gibco 12440-046 ESCs culture
Fetal bovine serum (FBS) EMD Millipore ES-009-B ESCs culture
Gelatin Sigma-Aldrich G2625 Dish coating
LIF R&D Systems 8878-LF-025 To maintain ESC pluripotency
MEM Non-Essential Amino Acids Solutions Gibco 11140050 Cell culture
2-Mercaptoethanol Gibco 21985023 Cell culture
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 Cell culture
Gentamicin Gibco 15750060 Cell culture
MycoZap Plus-PR Lonza VZA-2022 Cell culture
0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200-072 Cell culture
DMSO Sigma-Aldrich D2650
All-trans-retinoic acid Sigma-Aldrich R2625-50MG Induction of neural differentiation
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7030-50G Blocking and antibody dilution 
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787-100ML Cell membrane permeabilization
Cell strainer Corning 352360
Prolong Gold anti-fade reagent with DAPI Life Tech. P36931 Mounting reagent
16% Paraformaldehyde  Electron Microscopy Sciences 15710 Cell fixation
Fibronectin R&D Systems 1030-FN Dish coating
PBS Gibco 10010049
Collagenase type I Worthington Biochem. Corp LS004196 EB dissociation
Name  Company Catalog Number Comments
Primary Antibodies
Nestin (Rat-401) Santa Cruz Biotech sc-33677 Detection of neural differentiation
Oct4 Santa Cruz Biotech sc-5279 Detection of neural differentiation
Nanog Bethyl Laboratories A300-398A Detection of neural differentiation
Sox2 Cell Signaling 3579 Detection of neural differentiation
Tubulin b3 (AA10) Santa Cruz Biotech sc-80016 Detection of neural differentiation
Name  Company Catalog Number Comments
Secondary Antibodies
Donkey anti-Mouse-Alexa555 Life Tech. A31570 Immunofluorescence
Donkey anti-mouse-Alexa488  Life Tech. A21202 Immunofluorescence
Name  Company Catalog Number Comments
Instruments
Wide-field microscope Nikon Eclipse TS100 Cell culture imaging
Confocal microscope Nikon C2 Immunofluorescence imaging

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References

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विकासात्मक जीवविज्ञान अंक 122 मूषक भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं तंत्रिका भेदभाव रेटिनोइक एसिड embryoid शरीर तंत्रिका पूर्वज कोशिकाओं इम्यूनोफ्लोरेसेंस nestin ट्यूबिलिन β3
दो और तीन आयामी embryoid निकायों में मूषक भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं की रेटिनोइक एसिड प्रेरित तंत्रिका विभेदन का विश्लेषण
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Yang, J., Wu, C., Stefanescu, I.,… More

Yang, J., Wu, C., Stefanescu, I., Horowitz, A. Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies. J. Vis. Exp. (122), e55621, doi:10.3791/55621 (2017).

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