गोल्गी-कॉक्स विधि का उपयोग करते हुए वृद्ध चूहों में हिप्पोकैम्पल वृक्ष वृत्तीय जटिलता का आकलन
Summary
यहां हम व्यापक विस्तार में गोल्गी-कॉक्स प्रोटोकॉल पेश करते हैं। यह विश्वसनीय ऊतक दाग पद्धति हिप्पोकैम्पस में cytoarchitecture के एक उच्च गुणवत्ता वाले मूल्यांकन के लिए, और पूरे दिमाग में, न्यूनतम समस्या निवारण के साथ अनुमति देता है।
Abstract
वृक्ष के समान कणिकाएं न्यूरोनल वृक्ष के समान शाफ्ट से उत्तेजित होती हैं जिनमें उत्तेजक संक्रमण होते हैं। हिप्पोकैम्पस के भीतर न्यूरोनल डेंड्राइट की आकृति विज्ञान और शाखाबद्ध रूपांतरों को अनुभूति और स्मृति निर्माण में फंसाया गया है। गोल्गी के धुंधला होने के कई तरीके हैं, जो सभी वृक्ष के समान वृहदों की रूपात्मक विशेषताओं को निर्धारित करने और एक स्पष्ट पृष्ठभूमि का उत्पादन करने के लिए उपयोगी हैं। वर्तमान गोल्गी-कॉक्स विधि, (एक व्यावसायिक गोल्गी स्टाइंग किट के साथ प्रदान की जाने वाली प्रोटोकॉल की थोड़ी भिन्नता), यह मूल्यांकन करने के लिए डिजाइन किया गया था कि कैसेमोथेरेप्यूटिक दवा 5-फ्लूउरासिल (5-फू) की एक अपेक्षाकृत कम खुराक वृक्ष के समान आकारिकी को प्रभावित करेगी , कताई की संख्या, और हिप्पोकैम्पस के भीतर भूगर्भीय की जटिलता 5-फ़ू ने वृक्षसंचार संबंधी जटिलता को काफी व्यवस्थित किया और क्षेत्र-विशिष्ट तरीके से हिप्पोकैम्पस में रीढ़ की घनत्व को कम किया। प्रस्तुत आंकड़े बताते हैं कि गोल्गी धुंधला विधि efसीए 1, सीए 3, और हिप्पोकैम्पस के दांतेदार गहरेर (डीजी) में परिपक्व न्यूरॉन्स को सख्ती से दाग दिया। यह प्रोटोकॉल प्रत्येक चरण के लिए विवरण की रिपोर्ट करता है ताकि अन्य शोधकर्ता मस्तिष्क में उच्च गुणवत्ता के परिणाम और कम से कम समस्या निवारण वाले टिशू को मज़बूत रूप से दाग सकते हैं।
Introduction
डेंड्रिट्स न्यूरॉन्स का सबसे बड़ा हिस्सा हैं जो प्रीस्कैनेप्टिक इनपुट 1 प्राप्त करते हैं और प्रोसेस करते हैं उनके वृक्ष के समान प्रक्रियाओं में एक जटिल ज्यामिति होती है, जहां समीपस्थ शाखाओं की शाखाएं शाखाओं की तुलना में अधिक व्यास होती हैं। जैसा कि डेन्ड्रैइट विकसित होते हैं, वे अन्य न्यूरॉन्स के साथ कई कनेक्शन बनाते हैं, जिसे एक वृक्ष के वृक्ष arborization कहा जाता है। इस शाखा का हद और पैटर्न एक अन्तर्ग्रथनी इनपुट की मात्रा को निर्धारित करता है जो कि डेन्ड्रैइट पर्याप्त रूप से प्रक्रिया कर सकता है 2 ।
वृक्षारोपण संबंधी गतिविधि, गतिविधि-निर्भरता और न्यूरोनल सर्किटों के उचित विकास के लिए एक आवश्यक प्रक्रिया है। विस्तार, पीछे हटना, शाखाएं, और सिनाप्टोजेनेसिस जटिल प्रक्रियाएं हैं जिनमें आंतरिक आनुवांशिक कार्यक्रम और बाहरी कारकों से प्रभाव शामिल हैं। हिप्पोकैम्पस के भीतर न्यूरोनल डेंड्राइट्स के रूपिकी और शाखाओं में भिन्नता अनुभूति और स्मृति के निर्माण में फंसा होती हैएफ "> 3 , 4। वृक्षसंचार संबंधी जटिलता में परिवर्तन रोगोफिज़ियोलॉजिकल और व्यवहार में बदलाव के साथ जुड़ा हुआ है 5. असामान्यताएं कई रोग राज्यों से संबंधित हैं, जिनमें फ्रैगेज़ एक्स सिंड्रोम और डाउन सिंड्रोम 6 शामिल हैं ।
वृक्ष के समान कणें वृक्ष के वृक्ष arbors के विशेष subcellular डिब्बों कि केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के भीतर उत्तेजक इनपुट प्राप्त कर रहे हैं। वृक्ष के समान spines के तीन morphological वर्गों, उनके आकार और आकार के आधार पर प्रत्येक वर्ग के नाम के साथ: 1) मशरूम कताई, जो अन्य spines 7 की तुलना में अधिक ग्लूटामेट रिसेप्टर्स के साथ जटिल पोस्टिनेप्टिक घनत्व है; 2) स्टबबी स्पाइन, जो एक स्टेम की कमी है; और 3) पतली कताई, जिसमें एक दीर्घ, संकीर्ण स्टेम और एक गोलाकार सिर 8 होता है । वृक्ष के समान रीढ़ की हड्डी की मात्रा उन्हें परिभाषित करने के लिए भाग में प्रयोग की जाती है, आमतौर पर छोटे (0.01 माइक्रोन 3 </sup>) मशरूम कताई (0.8 माइक्रोन 3 ) 9 , 10 की तुलना में । स्पाइन परिपक्वता के साथ स्थिर होते हैं। उदाहरण के लिए, पतली कणें कुछ दिनों के बाद वापस ले जाती हैं या मशरूम के कणों में विकसित होती हैं। वैकल्पिक रूप से, मशरूम की कताएं अपेक्षाकृत स्थिर हैं और एक विस्तारित अवधि के लिए जीवित रह सकती हैं। न्यूरोनल कनेक्शन की ताकत स्पाइनों और / या उनकी मात्रा 11 , 12 , 13 की संख्या के आधार पर लगाई जाती है।
क्लासिकल गोल्गी स्टेनाइजिंग विधि और इसके आधुनिक रूपों में वृक्ष के समान रीढ़ की आकृति विज्ञान और घनत्व की जांच के लिए सभी उपयोगी हैं। गोलगी धुंधला के एक अनूठे पहलू यह है कि यह कुल न्यूरॉन्स का लगभग 5% दाग करता है, जो कि व्यक्तिगत न्यूरॉन्स 14 , 15 के अनुरेखण के लिए अनुमति देता है। हालांकि सटीक तंत्र जिसमें गोल्गी मेथ हैOd stains व्यक्तिगत न्यूरॉन्स अभी भी अज्ञात है, इस विधि का सिद्धांत चांदी क्रोमेट (एजी 2 क्रो 4 ) 16 , 17 के क्रिस्टलीकरण पर आधारित है। गोल्गी पद्धति के तीन मुख्य प्रकार हैं: तेजी से गॉल्गी, गोल्गी-कॉक्स, और गोल्गी-कॉपचा 18 , 1 9 । सभी तीन तरीकों से कई दिनों से महीनों तक क्रोमियम लवण में एक प्रारंभिक ऊष्मायन चरण के साथ शुरू होता है, लेकिन उनके बीच कुछ महत्वपूर्ण अंतर हैं तेज़ी से गोल्गी ने पहले चरण में ओस्मीन टेट्रोक्साइड का उपयोग किया है, जबकि गॉलगी-कॉप्सच में पैराफॉर्मालाइडहाइड शामिल हैं। तेजी से गोल्गी और गोल्गी-कॉप्सच दोनों में धुंधला होने के बाद लगभग 7 दिनों के लिए 1-2% रजत नाइट्रेट समाधान में ऊष्मायन किया जाता है। गोल्गी-कॉक्स विधि रजत नाइट्रेट के बजाय मर्क्यूरिक क्लोराइड और पोटेशियम डिचोमैट का उपयोग करती है और इसमें 2-4 सप्ताह का संसेचन समय होता है। ऊतकों को फिर से वर्गीकृत किया जाता है और जल्दी से एक पतला अमोनिया में रखा जाता हैसमाधान, एक फोटो फिक्सर द्वारा पीछा लवण हटाने के लिए। तीन प्रकारों में से, गोल्गी-कॉक्स विधि को डेन्ड्रिटिक आर्कबर्स को बिना पृष्ठभूमि के हस्तक्षेप के धुंधला होने का सबसे अच्छा माना जाता है, क्योंकि भाग में, क्रिस्टल कलाकृतियों ऊतक की सतह पर नहीं होती हैं (तेजी से गोल्गी पद्धति के विपरीत) 17 , 20 , 21
वर्तमान विधि वाणिज्यिक गोल्गी स्टेनेस किट के साथ प्रदान किए गए प्रोटोकॉल का एक मामूली बदलाव है, और इसे 5-फू की एक अपेक्षाकृत कम खुराक वृक्ष के समान आकार संबंधी विशेषताओं और रीढ़ घनत्व को प्रभावित करने के लिए कैसे तैयार किया गया था। किसी भी डेटा का अधिग्रहण किया जा सकता है इस बारे में और जानकारी प्रदान कर सकता है कि कैसेमोथेरेप्यूटिक उपचार न्यूरोनल सर्किटरी को प्रभावित करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
अधिक आधुनिक तकनीकों की तुलना में, गोल्गी-कॉक्स विधि में कई फायदे हैं, जो रीढ़ की आकृति विज्ञान की जांच करने के लिए पसंदीदा विधि बनाते हैं: 1) धुंधला हो सकता है अनिवार्य रूप से किसी भी ऊतक के लिए इस्तेमाल क?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम एनआईएच पी 20 जीएम 10 9 005 (एआरए) के तहत पायलट अनुदान द्वारा समर्थित था और सेंटर फॉर ट्रांसलेजनल न्यूरोसाइंस आईडीईए कार्यक्रम पुरस्कार पी 30 जीएम 110702
Materials
| superGolgi Kit | Bioenno Lifesciences | 30100 | Contains hazardous materials. |
| PBS 10X powder concentrate | Fisher | BP665-1 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
| Permount | Fisher | SP 15-100 | |
| Slide cover | Fisher | 12-546-14 | |
| 7mL Transfer pipette | Globe Scientific | 135030 | |
| 10 mL Falcon tubes | BD Biosciences | 352099 | |
| Foil | Fisher | 01-213-105 | |
| 12-well plate | BD Biosciences | 353043 | |
| 200 proof Ethanol | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Xylene | Acros Organics | 1330-20-7 | Hazardous. |
| Permabond 200 | Permabond LLC | GF2492 | |
| 25 mL serological pipette | Sigma | SIAL1489 | |
| Parafilm | Midsci | HS234526C | |
| Vibratome | World Precision Instruments | NVSLM1 | |
| C57Bl/6 Male Mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Axio Imager 2 | ZEISS | Multiple components, see website for details. | |
| AxioCam MRc Camera | ZEISS | 426508-9902-000 | |
| Staining Dish , Green | Tissue-Tek | 62541-12 | |
| Staining Dish Set | Electron Microscopy Sciences | 70312-20 | |
| Motorized Pipet Filler | Fisher | 03-692-168 | |
| Neurolucida | mbf Bioscience | ||
| Neurolucida Explorer | mbf Bioscience | ||
| Prism | GraphPad |
Referências
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