כאן אנו מציגים פרוטוקול Golgi-Cox בפירוט רב. זו שיטה אמינה רקמת כתם מאפשר הערכה איכותית גבוהה של cytoarchitecture בהיפוקמפוס, ובכל רחבי המוח כולו, עם פתרון מינימלי.
קוצים דנדריטים הם הבולטים של פירים דנדריטים נוירונים המכילים סינפסות מעוררות. ההבדלים המורפולוגיים וההסתעפויות של הדנדריטים העצביים בתוך ההיפוקמפוס מעורבים בהבנה קוגניטיבית וזיכרון. ישנן מספר גישות מכתים Golgi, אשר כולם היו שימושיים לקביעת המאפיינים המורפולוגיים של דנדריטים סוכות לייצר רקע ברור. השיטה הנוכחית Golgi-Cox, (וריאציה קלה של הפרוטוקול מסופק עם ערכת מכתים Golgi מסחרי), נועד להעריך כיצד מינון נמוך יחסית של התרופה chemotherapeutic 5-flurouracil (5-Fu) ישפיע על המורפולוגיה הדנדריטים , את מספר הקוצים, ואת המורכבות של arborization בתוך ההיפוקמפוס. 5-Fu מאופיינת באופן משמעותי את המורכבות הדנדריטים והורידה את צפיפות עמוד השדרה לאורך ההיפוקמפוס באופן ספציפי לאזור. הנתונים המוצגים מראים כי שיטת מכתים Golgi efמוכתמים בצורה נוקשה את הנוירונים הבוגרים ב- CA1, CA3, ואת gyrus משוננת (DG) של ההיפוקמפוס. פרוטוקול זה מדווח על הפרטים עבור כל צעד, כך שחוקרים אחרים יכולים לרקום כתם אמין ברחבי המוח עם תוצאות באיכות גבוהה ופתרון בעיות מינימלי.
הדנדריטים הם החלק הגדול ביותר של נוירונים המקבלים ומעבדים קלט presynaptic 1 . לתהליכים הדנדריטים שלהם יש גיאומטריה מורכבת, שבה לענפים הפרוקסימליים יש קוטר גדול יותר מאשר הענפים הדיסטליים. כמו דנדריטים לפתח, הם יוצרים מספר קשרים עם נוירונים אחרים בתהליך המכונה arborization דנדריטים. היקף ודפוס של הסתעפות זו קובעת את כמות התשומות הסינפטי כי דנדריט יכול לעבד כראוי 2 .
דבורריזם arborization הוא תהליך הכרחי עבור פעילות גמישות הפלסטיות ופיתוח תקין של מעגלים נוירונים. הארכה, חזרה, הסתעפות וסינפוגנזה הם תהליכים מורכבים הכוללים תוכניות גנטיות פנימיות והשפעות מגורמים חיצוניים. ההבדלים המורפולוגיים וההסתעפויות של הדנדריטים העצביים בתוך ההיפוקמפוס מעורבים בהבנה קוגניטיבית וזיכרוןF "> 3 , 4. השינויים במורכבות הדנדריטים קשורים לשינויים פתופיזיולוגיים והתנהגותיים 5. הפרעות קשורות למספר מצבי מחלה, כולל תסמונת X שבירה ותסמונת דאון 6 .
הקוצים הדנדריטים הם תאים תת תאיים מיוחדים של דבורות arbors לקבל קלט מעורר בתוך מערכת העצבים המרכזית. ישנם שלושה סוגים מורפולוגיים של קוצים דנדריטים, עם שם של כל שיעור על פי גודלם וצורתם: 1) קוצים פטריות, אשר יש צפיפויות מורכבות postsynaptic עם קולטני גלוטמט יותר מאשר קוצים אחרים 7 ; 2) קוצים קטנטנים, שאין להם גזע; ו 3) קוצים דקים, המורכבת גזע מתמשך, צר ראש גלובלית 8 . נפח עמוד השדרה הדנדריטי משמש בחלקו להגדרתם, עם קוצים דקים בדרך כלל קטנים יותר (0.01 מיקרומטר 3 </sup>) לעומת קוצים פטריות (0.8 מיקרומטר 3 ) 9 , 10 . הקוצים מתייצבים עם ההתבגרות. לדוגמה, קוצים דקים או נסוג לאחר כמה ימים או להתפתח פטיש spines. לחלופין, קוצים הפטרייה יציבים יחסית יכול לשרוד במשך תקופה ארוכה.החוזק של קשרים נוירונים הוא חשב להיות מבוסס על מספר הקוצים ו / או נפח שלהם 11 , 12 , 13 .
שיטת הקולי הקלסית הקלאסית והווריאציות המודרניות יותר שלה היו מועילות לבחינת המורפולוגיה והצפיפות של עמוד השדרה הדנדריטים. היבט ייחודי אחד של מכתים Golgi היא כי כתמי אקראי על 5% מכלל הנוירונים, המאפשר מעקב אחר נוירונים בודדים 14 , 15 . אמנם את המנגנון המדויק שבו Golgi מתכתמי אוד נוירונים בודדים עדיין לא ידוע, העיקרון של השיטה מבוססת על התגבשות של כרומט כסף (Ag 2 CrO 4 ) 16 , 17 . ישנם שלושה סוגים עיקריים של שיטת Golgi: Golgi מהירה, Golgi-Cox, ואת Golgi-Kopsch 18 , 19 . כל שלוש שיטות להתחיל עם שלב הדגירה הראשונית של מלחי כרום במשך מספר ימים עד חודשים, אבל יש הבדלים מפתח מסוימים ביניהם. Golgi מהירה משתמשת tetroxide אוסמיום בשלב הראשון, ואילו Golgi-Kopsch כולל paraformaldehyde. מכתים הן מהיר Golgi ו Golgi-Kopsch ואחריו הדגירה של פתרון חנקתי 1-2% כסף במשך כ -7 ימים. שיטת Golgi-Cox משתמשת כלוריד כספית אשלגן dichromate במקום חנקתי כסף יש זמן הספגה של 2-4 שבועות. הרקמות נחתכות וממוקמות במהירות באמוניה מדוללתפתרון, ואחריו מסדר צילום כדי להסיר מלחים. מבין שלושת הסוגים, שיטת Golgy-Cox נחשבת הטובה ביותר להכתים את הנמלים הדנדריטים ללא הפרעות רקע רבות, בין היתר, משום שמוצרי הבדולח אינם מופיעים על פני הרקמה (בניגוד לשיטת Golgi המהירה) 17 , 20 , 21 .
השיטה הנוכחית היא וריאציה קלה של הפרוטוקול שסופק עם ערכת מכתים Golgi מסחרי, והוא נועד להעריך כיצד מינון נמוך יחסית של 5-פו ישפיע על המאפיינים המורפולוגיים הדנדריטים וצפיפות עמוד השדרה. כל הנתונים שנרכשו יכולים לספק תובנה נוספת כיצד טיפול כימותרפי משפיע על המעגל העצבית.
לעומת טכניקות מודרניות יותר, שיטת Golgi-Cox יש כמה יתרונות שהופכים אותו לשיטה המועדפת לבדיקת מורפולוגיה עמוד השדרה: 1) מכתים ניתן להשתמש עבור כל רקמה, 2) אור בסיסי מיקרוסקופ ההתקנה היא כל מה שצריך לרכוש תמונות מבוסס Golgi, 3) ההדמיה Golgi-Cox הוא מהיר יותר מאשר הדמיה confocal, ו 4) חלקים …
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי מענק פיילוט תחת NIH P20 GM109005 (ARA) ועל ידי המרכז לתרגום Neuroscience IDeA תוכנית הפרס P30 GM110702.
superGolgi Kit | Bioenno Lifesciences | 30100 | Contains hazardous materials. |
PBS 10X powder concentrate | Fisher | BP665-1 | |
Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
Permount | Fisher | SP 15-100 | |
Slide cover | Fisher | 12-546-14 | |
7mL Transfer pipette | Globe Scientific | 135030 | |
10 mL Falcon tubes | BD Biosciences | 352099 | |
Foil | Fisher | 01-213-105 | |
12-well plate | BD Biosciences | 353043 | |
200 proof Ethanol | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
Xylene | Acros Organics | 1330-20-7 | Hazardous. |
Permabond 200 | Permabond LLC | GF2492 | |
25 mL serological pipette | Sigma | SIAL1489 | |
Parafilm | Midsci | HS234526C | |
Vibratome | World Precision Instruments | NVSLM1 | |
C57Bl/6 Male Mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
Axio Imager 2 | ZEISS | Multiple components, see website for details. | |
AxioCam MRc Camera | ZEISS | 426508-9902-000 | |
Staining Dish , Green | Tissue-Tek | 62541-12 | |
Staining Dish Set | Electron Microscopy Sciences | 70312-20 | |
Motorized Pipet Filler | Fisher | 03-692-168 | |
Neurolucida | mbf Bioscience | ||
Neurolucida Explorer | mbf Bioscience | ||
Prism | GraphPad |