Os ensaios de competição de péptidos são amplamente utilizados numa variedade de experiências moleculares e imunológicas. Este artigo descreve um método detalhado para um ensaio de quinase competitiva com oligopéptido in vitro e os procedimentos de validação associados, que podem ser úteis para encontrar locais de fosforilação específicos.
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Artigo de método
Ensaio de Competição Oligopeptídica para Determinação de Sítio de Fosforilação
Neste artigo
Resumo
Resumo
A fosforilação de proteínas em locais específicos determina sua conformação e interação com outras moléculas. Assim, a fosforila�o proteica afecta as fun�es biol�icas e as caracter�ticas da c�ula. Atualmente, o método mais comum para descobrir sítios de fosforilação é a análise por cromatografia líquida / espectrometria de massa (LC / MS), um método rápido e sensível. Contudo, as porções de fosfato relativamente lábeis são frequentemente libertadas dos fosfopéptidos durante o passo de fragmentação, o que muitas vezes produz sinais falso-negativos. Nesses casos, um ensaio de quinase in vitro tradicional utilizando mutantes dirigidos ao local seria mais preciso, mas este método é laborioso e demorado. Por conseguinte, pode ser vantajoso um método alternativo utilizando a competição de péptidos. O motivo de reconhecimento de consenso da quinase de proteína activada por monofosfato de adenosina 5 '(AMPK) foi estabelecido 1 e foi validado utilizando um colo de biblioteca de peptídeo de localização de varrimentoAy 2 . Assim, os locais de fosforila�o de AMPK para um novo substrato poderiam ser previstos e confirmados pelos ensaios de competi�o de p�tidos. Neste relatório, descrevemos os passos e procedimentos detalhados para o ensaio de quinase competitiva de oligopéptido in vitro ilustrando a fosforilação do fator 2 do factor nuclear 2 mediado por AMPK (Nrf2). Para autenticar o local de fosforila�o, realizou-se um ensaio sequencial in vitro de quinase utilizando um mutante espec�ico do local. Em geral, o ensaio de competição de péptidos proporciona um método para pesquisar múltiplos locais de fosforilação potenciais e para identificar locais para validação pelos mutantes de sítio de fosforilação.
Introdução
A fosforilação de proteínas num resíduo específico desempenha um papel significativo numa vasta gama de processos celulares. Assim, a compreensão das redes de sinalização requer a identificação de locais específicos de fosforilação. Além disso, o local de fosforilação determina o efeito na função da proteína porque os domínios individuais dentro de uma proteína possuem estruturas e funções diferentes. A atividade do fator nuclear 2 relacionado ao eritróide 2 (Nrf2), um importante fator de transcrição antioxidante, é regulada bidirecionalmente através da fosforilação em diferentes locais. Nossos estudos têm se concentrado nas quinases que catalisam a fosforilação de N....
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Protocolo
1. Segurança
ATENÇÃO: Este protocolo utiliza [γ- 32 P] -ATP para avaliar a actividade da AMPK. Fósforo-32 é um isótopo radioativo, em grande parte emitindo radiação beta. Uma vez que o tamanho de uma partícula beta é extremamente pequeno, ele pode facilmente penetrar roupas e pele. Tanto a exposição externa quanto a interna à radiação beta podem ser prejudiciais para a saúde humana, inclusive causando queimaduras na pele e danos nos tecidos.
- Realizar todas as etapas que exigem a utilização de [γ- 32 P] -ATP usando proteção adequada, como a blindagem acrílica.
- Assegurar que todo o pessoal esteja e....
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Resultados
A Figura 1 e a Figura 2 demonstram os resultados de experiências repetidas no artigo anteriormente relatado 8 . Foram sintetizados três oligosséptidos de 10 resíduos diferentes imitando os locais alvo de AMPK putativos (# 1, 148-157 compreendendo Ser153; # 2, 330-339 compreendendo Ser335 e # 3, 553-562 compreendendo Ser558) e utilizados como concorrentes no Vitro . A fosforila�o de Nrf2 por AMP.......
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Discussão
Como uma maneira simples e conveniente para avaliar a autenticidade dos locais de fosforilação previstos mediados por AMPK, aqui descrevemos um ensaio de quinase in vitro que pode ser utilizado para descobrir um local de fosforilação específico utilizando péptidos competitivos e para verificar isto utilizando um mutante específico do local . Os dados representativos obtidos a partir do ensaio de actividade de AMPK competitivo in vitro combinaram os resultados de um ensaio utilizando uma proteí.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Pesquisa da Coréia subvenção financiada pelo governo coreano (MSIP) (nº 2015R1A2A1A10052663 e nº 2014M1A3A3A02034698).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| HEPES | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 15630 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 208337 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E3889 | |
| DTT | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | D9779 | |
| β-glicerofosfato | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G9422 | |
| Na3VO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 450243 | |
| Coquetel de inibidores de protease | Calbiochem, Nottingham, Reino Unido | 539134 | |
| ATP | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A2383 | |
| AMP | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1752 | |
| AMPK | Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY | 14-840 | |
| Nrf2 (WT) | Abnova, cidade de Taipei, Taiwan | H00004780-P01 | |
| [γ-32< / sup>P] -ATP | PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA | NEG502A | |
| Reagente de coloração EZblue | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G1041 | |
| Pfu turbo DNA polimerase | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 600250 | |
| dNTP mix | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 200415-51 | Evite múltiplos ciclos de descongelamento e congelamento |
| DpnI | New England Biolabs, Ipswich, MA | R0176S | |
| LB caldo | Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Holanda | L1704 | |
| Ampicilina | Affymetrix, Santa Clara, CA | 11259 | |
| Agarose LE | iNtRON Biotechnology, Sungnam, Coreia do Sul | 32034 | |
| HiYield Plus Gel/PCR DNA Mini Kit | Real Biotech Corporation, Taipei, Taiwan | QDF100 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 161-0400 | |
| Albumina de soro bovino | Bovogen Biologicals, Victoria, Austrália | BSA100 | |
| Glutationa Sepharose 4B | GE Healthcare, Marlborough, MA | 17-0756-01 | |
| Ácido Acético glacial | Duksan pure chemicals, Ansan, Coreia | ||
| Álcool metílico | Daejung Chemicals & Metais, Siheung, Coreia do Sul | 5558-4410 | |
| [header] | |||
| Typhoon FLA 7000 | GE Healthcare, Marlborough, MA | 28-9558-09 | |
| Kit SDS-PAGE | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 1658001FC | |
| Bomba de vácuo | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 165-178 | |
| Secador de gel | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 165-1746 | |
| Agitador de dança | FINEPCR, Seul, Coréia | CR300 | A máquina é necessária para a máquina de PCR de etapa de lavagem |
| Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | T100 | ||
| Incubadora/agitadores | N-BIOTEK, GyeongGi-Do, Coréia | NB-205L | |
| Microcentrífugas | LABOGENE, Seul, Coréia | 1730R | |
| Colunas | de cromatografiaLaboratórios Bio-Rad, Hércules, CA | 732-1010 |
Referências
- Hardie, D. G., Schaffer, B. E., Brunet, A. AMPK: An energy-sensing pathway with multiple inputs and outputs. Trends Cell Biol. 26, 190-201 (2016).
- Gwinn, D. M., et al. AMPK phosphorylation of raptor mediates a metabolic checkpoint. Mol Cell. 30, 214-....
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Reimpressões e permissões
