Ensaio de Competição Oligopeptídica para Determinação de Sítio de Fosforilação

Resumo

Os ensaios de competição de péptidos são amplamente utilizados numa variedade de experiências moleculares e imunológicas. Este artigo descreve um método detalhado para um ensaio de quinase competitiva com oligopéptido in vitro e os procedimentos de validação associados, que podem ser úteis para encontrar locais de fosforilação específicos.

Resumo

A fosforilação de proteínas em locais específicos determina sua conformação e interação com outras moléculas. Assim, a fosforila�o proteica afecta as fun�es biol�icas e as caracter�ticas da c�ula. Atualmente, o método mais comum para descobrir sítios de fosforilação é a análise por cromatografia líquida / espectrometria de massa (LC / MS), um método rápido e sensível. Contudo, as porções de fosfato relativamente lábeis são frequentemente libertadas dos fosfopéptidos durante o passo de fragmentação, o que muitas vezes produz sinais falso-negativos. Nesses casos, um ensaio de quinase in vitro tradicional utilizando mutantes dirigidos ao local seria mais preciso, mas este método é laborioso e demorado. Por conseguinte, pode ser vantajoso um método alternativo utilizando a competição de péptidos. O motivo de reconhecimento de consenso da quinase de proteína activada por monofosfato de adenosina 5 '(AMPK) foi estabelecido ¹ e foi validado utilizando um colo de biblioteca de peptídeo de localização de varrimentoAy ² . Assim, os locais de fosforila�o de AMPK para um novo substrato poderiam ser previstos e confirmados pelos ensaios de competi�o de p�tidos. Neste relatório, descrevemos os passos e procedimentos detalhados para o ensaio de quinase competitiva de oligopéptido in vitro ilustrando a fosforilação do fator 2 do factor nuclear 2 mediado por AMPK (Nrf2). Para autenticar o local de fosforila�o, realizou-se um ensaio sequencial in vitro de quinase utilizando um mutante espec�ico do local. Em geral, o ensaio de competição de péptidos proporciona um método para pesquisar múltiplos locais de fosforilação potenciais e para identificar locais para validação pelos mutantes de sítio de fosforilação.

Introdução

A fosforilação de proteínas num resíduo específico desempenha um papel significativo numa vasta gama de processos celulares. Assim, a compreensão das redes de sinalização requer a identificação de locais específicos de fosforilação. Além disso, o local de fosforilação determina o efeito na função da proteína porque os domínios individuais dentro de uma proteína possuem estruturas e funções diferentes. A atividade do fator nuclear 2 relacionado ao eritróide 2 (Nrf2), um importante fator de transcrição antioxidante, é regulada bidirecionalmente através da fosforilação em diferentes locais. Nossos estudos têm se concentrado nas quinases que catalisam a fosforilação de Nrf2. A resposta ao estresse de Nrf2 contra o desafio oxidativo ocorre rapidamente, principalmente através da fosforilação na serina 40 e mediada pela proteína quinase C (PKC) -δ, que ativa Nrf2 ^{3 , 4} . Por outro lado, Fyn catalisa a fosforilação inibitória de Nrf2 na tirosina 568 para controlo rigoroso da actividade ⁵ .

O método mais comum utilizado para descobrir locais de fosforilação é a cromatografia líquida / espectrometria de massa (LC / MS). Dados de mapeamento de sítios de fosforilação rápidos e altamente sensíveis podem ser gerados deste modo; No entanto, tem várias limitações técnicas, muitas vezes gerando sinais falsos negativos. Frequentemente ocorre uma fraca cobertura de sequências na análise de LC / MS. Para identificar locais de fosforila�o, �necess�ia informa�o sobre a cobertura m�ima de amino�idos de uma prote�a ⁶ . A proteólise da proteína de interesse com várias proteases durante o passo de digestão pode ser de ajuda na melhoria da cobertura da sequência. Outro obstáculo para a identificação de resíduos de fosforilação é a fácil perda de ácido fosfórico que é frequentemente observada para os péptidos fosforilados com serina e treonina 6,7. As porções fosfato labílicas são frequentementeLibertado dos fosfopéptidos durante o processo de fragmentação ⁷ . A segunda opção quando se procura locais de fosforila�o �utilizar um m�odo de microarrays de p�tidos. É possível pesquisar os locais alvo de cinase utilizando um chip de microarray contendo fragmentos peptídicos derivados de uma proteína de interesse. No entanto, devido ao requisito de equipamento para a produção e detecção de um chip de microarray, o método de microarray de péptido é considerado demorado e dispendioso.

Para ultrapassar estes desafios, pode ser utilizado um ensaio de quinase concorrente de oligopéptido in vitro para uma proteína quinase com motivos de reconhecimento conhecidos. Se o motivo de reconhecimento de consenso de uma quinase for estabelecido, os sítios de fosforilação putativos de um substrato candidato podem ser previstos e a autenticidade dos sítios pode ser validada. O método mais convincente para este procedimento é mostrar a anulação da fosforilação numa proteína mutante na qual o predicteD é substituído por um aminoácido não fosforilável ( isto é, serina ou treonina em alanina, tirosina em fenilalanina). No entanto, a produção e isolamento de proteínas mutantes é demorada. Como uma alternativa na fase inicial da pesquisa, o ensaio de peptídeo quinase competitivo é simples e conveniente. Aqui, descrevemos um protocolo para um ensaio de competição de péptidos in vitro e para a validação do local de fosforilação.

Protocolo

1. Segurança

ATENÇÃO: Este protocolo utiliza [γ- ³² P] -ATP para avaliar a actividade da AMPK. Fósforo-32 é um isótopo radioativo, em grande parte emitindo radiação beta. Uma vez que o tamanho de uma partícula beta é extremamente pequeno, ele pode facilmente penetrar roupas e pele. Tanto a exposição externa quanto a interna à radiação beta podem ser prejudiciais para a saúde humana, inclusive causando queimaduras na pele e danos nos tecidos.

1. Realizar todas as etapas que exigem a utilização de [γ- ³² P] -ATP usando proteção adequada, como a blindagem acrílica.
2. Assegurar que todo o pessoal esteja equipado com dosímetros eletrônicos pessoais (EPD) para monitorar a extensão da exposição a radiação nociva durante todos os procedimentos.
3. Manuseie radiação de fonte aberta somente após treinamento apropriado e aprovação regulamentar.
   NOTA: Aqui, todas as experiências foram conduzidas após a conclusão do treinamento sobre o uso de radiação de fonte aberta na Universidade Nacional de SeulE a aprovação do governo coreano (nssc.go.kr/nssc/en).
4. Eliminar os resíduos radioactivos de acordo com as regulamentações locais.
   NOTA: Aqui, as diretrizes do Instituto de Proteção Ambiental e Segurança da Universidade Nacional de Seul foram seguidas. Os seguintes são uma lista de reguladores nos Estados Unidos e países europeus: Os Estados Unidos da América, Estados Unidos Nuclear Regulatory Commission (http://www.nrc.gov/); Reino Unido, Executivo de Saúde e Segurança (HSE) (http://www.hse.gov.uk); França, Autorité de sûreté nucléaire (https://www.asn.fr/); E Alemanha, Ministério Federal do Ambiente, Conservação da Natureza, Construção e Segurança Nuclear (BMU) (http://www.bmu.de).

2. Ensaio de Kinase Competitiva In Vitro

1. Construção de Peptídeos Competitivos
   1. Determinar o motivo consenso fosforilado por AMPK.
      NOTA: AMPK reconhece o motivo consenso, &# 934; - [X, β] -XX-Ser / Thr-XXX-Φ. Na sequência de consenso, Φ representa aminoácidos hidrofóbicos ( isto é, valina [V], leucina [L], metionina [M] e isoleucina [I]) e β representa aminoácidos básicos ( ie, lisina [K], arginina [ R], e histidina [H]) ¹ .
   2. Selecionar res�uos de serina ou treonina das sequ�cias alvo de acordo com o motivo de consenso acima. Utilizar três locais putativos de Nrf2 humano (# 1, 148-157 compreendendo Ser153; # 2, 330-339 compreendendo Ser335 e # 3, 553-562 compreendendo Ser558) ⁸ .
   3. Sintetizam comercialmente peptídeos com 10 resíduos que imitam os sítios putativos. Obter o produto sintetizado como um pó liofilizado com uma pureza superior a 98% para cada péptido.
   4. Dissolver os péptidos utilizando um tampão de cinase para se obter uma concentração de 71,667 g / L. Se um péptido não é solúvel num tampão de quinase, dissolva-o em DMSO a 20%. Se permanecer insolúvel, um péptido imitando oPode ser prolongado para aumentar a solubilidade.

2. Ensaio de Cinase AMPK Competitivo In Vitro
   1. Preparar 5 x cinase tampão como se segue: 100 mM HEPES, pH 7,4; MgCl2 25 mM; EGTA 5 mM; DTT 5 mM; P-glicerofosfato 125 mM (inibidor de serina / treonina fosfatase); 5 mM de Na3VO4 (inibidor de tirosina fosfatase); 0,5% (v / v) de Conjunto de Cocktail Inibidor de Protease III, ATP frio 1 mM; E 500 μM de AMP.
      NOTA: AMP é um componente essencial do buffer de quinase para testar a atividade AMPK. O tampão pode ser utilizado para medir a actividade tanto de serina / treonina cinases como de tirosina quinases.
   2. Descongelar a seguinte proteína recombinante e peptídeos sintéticos em gelo: AMPK; Nrf2; E oligopéptidos # 1, # 2 e # 3.
   3. Preparar um tampão de reacção em gelo: 0,15 μg de AMPK, 0,4 μg de Nrf2 (~ 4 pmol), 0,43 mg de oligopéptido (~ 300 nmol) e 6 μL de tampão quinase 5 ×. UMAAjustar o volume final a 30 μL com água destilada estéril (DW).
      NOTA: A adição de [γ- ³² P] -ATP após a preparação do tampão de reacção pode reduzir o sinal radioactivo devido à autofosforilação da cinase.
3. Executando os Reagentes
   NOTA: Todos os processos abaixo devem ser realizados sob proteção com escudo acrílico, rack ou bloco, bem como equipamento de proteção pessoal apropriado.
   1. Ajustar os blocos de aquecimento a 30 ° C antes de iniciar a experiência.
   2. Adicionar 1 μL de [γ- ³² P] -ATP (1 μCi) aos tubos de reacção em gelo. Misture o tampão de reação pipetando para cima e para baixo várias vezes.
      NOTA: A radioactividade de ³² P tem uma semi-vida curta de aproximadamente 14 dias ⁹ . Ajustar o volume considerando a meia-vida ( por exemplo, após um mês da produção de [γ- ³² P] -ATP, adicionar 4 μL de [γ- ³² P]-ATP para fazer 1 μCi).
   3. Incubar a amostra no bloco de aquecimento a 30 ° C durante 15-30 min. Durante este passo, preparar geles de electroforese em gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sódio a 7,5% (SDS-PAGE). Ajustar a percentagem do gel de acordo com o tamanho da proteína alvo.
   4. Parar a reacção de quinase por adição de 3 μL de tampão de amostra 10 × SDS (glicerol a 10% (v / v), SDS a 20% (p / v), ditiotreitol a 15,42% (p / v) Tris-HCl (pH 6,8) e azul de bromofenol a 0,02% (p / v). Misture o tampão de reação pipetando para cima e para baixo várias vezes.
   5. Executar as amostras num gel SDS-PAGE a 7,5% a 70 V durante 20 min e continuamente a 140 V durante 1 h.
      NOTA: A linha azul de bromofenol na extremidade do gel contém sinais radioactivos extremamente elevados. Recomenda-se remover o gel abaixo da linha azul antes de prosseguir para a próxima etapa para reduzir os sinais de fundo.
   6. Depois de SDS-PAGE, remover suavemente o gel do rodízio. Coloque o gel em um copoPara o próximo passo.
   7. Fixar o gel com tampão de fixação durante 20 min (50% de metanol e 10% de ácido acético glacial).
   8. Mova suavemente o gel para papel de filtro e cubra-o com um invólucro transparente. Note-se que o gel pode ser facilmente rasgado nesta etapa. Secar o gel com um secador de gel de vácuo a 80 ° C durante 1 h.
4. Visualização
   1. Exponha o gel a uma tela de fósforo ou a uma película de raios-X durante a noite (geralmente durante aproximadamente 16 h).
      NOTA: Uma tela de fósforo pode ser reutilizada após a exposição à luz extra-brilhante. Quando se utiliza um filme de raios X, exponha o gel durante dois dias. Os filmes de raios-X têm menor sensibilidade do que as telas de fósforo.
   2. Digitalizar a tela de fósforo com um fósforo imager. Exporte a imagem como um arquivo TIFF ou bitmap de alta resolução.
   3. Após a visualização, mover o gel para um recipiente de vidro ou plástico para Coomassie azul brilhante (CBB) coloração.
   4. Lave o gel com DW. Descarte o DW eE gel com o reagente de coloração durante 1 h.
   5. Descartar o reagente e remover o gel com DW durante 1 h ou durante a noite. Coloque o gel entre filmes plásticos transparentes (ou o equivalente) para digitalizar com um scanner de escritório.

3. Ensaio de Quinase In Vitro Utilizando um Mutante Site-specific

1. Mutagénese dirigida ao local de pGEX-Nrf2
   1. Mutagenic Primer Design
      NOTA: A concepção de iniciadores mutagénicos adequados é fundamental para o sucesso da mutagénese. Seguem-se algumas considerações para a concepção de iniciadores mutagénicos. Criar um primer composto de 25 a 45 bases, com a mutação desejada no meio do primer. O iniciador deve ter 40-60% de teor de GC e terminar com uma ou mais bases G ou C. Certifique-se de que a Tm do primer é igual a 78 ° C ou superior de acordo com a fórmula [T _m = 81,5 + 0,41 (% GC) - (675 / comprimento das bases) -% de discordância].
      NOTA: Purifique oPorque a sua pureza é importante para a eficiência da mutação. Existem vários sites para a concepção mutagênicos primers.
      1. Abra o programa do projeto do primer para "projetar primers para a mutagénese dirigida" (http://www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp).
      2. Colar a seqüência de DNA Nrf2 humano (Nº de acesso NM_006164.4) e selecionar o botão "upload traduzido".
      3. Seleccione o resíduo de serina 558 da sequência de aminoácidos traduzida para ser alterado para alanina. Utilizando o iniciador mutagénico, substitua o codão pela serina de agc a gcc, por alanina.
      4. Considere o comprimento do primer, T _m , eo teor de GC.
         NOTA: O iniciador mutagénico é finalmente concebido como 5'-ctactgaaaaaacaactc gcc accttatatctcgaag-3 '.
   2. Reacção para síntese de cadeia mutante utilizando reacção em cadeia de polimerase (PCR)
      1. Preparar a mistura de reacção de PCR sobre gelo: tampão de reacção 10x, 50 ng dePGEX-GST-Nrf2, 125 ng de iniciador directo, 125 ng de iniciador inverso, 1 μL de mistura de dNTP (10 mM cada), ADN polimerase Pfu de 2,5 U e DW estéril para 50 μL.
      2. Executar a PCR para a síntese da cadeia mutante pGEX-GST-Nrf2 com o seguinte programa de ciclos: 1 ciclo a 95 ° C durante 30 s; 18 ciclos a 95 ° C durante 30 s, a 55 ° C durante 1 min e a 68 ° C durante 90 s; E 1 ciclo a 68 ° C durante 5 min.
         NOTA: Dependendo do comprimento do plasmídeo, os parâmetros de ciclagem podem ser alterados.
      3. Colocá-lo em gelo durante 2 min para arrefecer os reagentes para a próxima etapa. Alternativamente, guarde-os a 4 ° C durante a noite.
   3. Digestão de Dpn I e Selecção de um Plasmídeo Mutante
      1. Adicionar 1 μl de enzima de restrição Dpn I (10 U / μL) a cada um dos reagentes após arrefecimento. Misturar cuidadosamente e suavemente por pipetagem e centrifugar durante 1 min.
      2. Incubar a 37 ° C durante 2 h para digerir parental pGEX-GST-Nrf2 dupla-Trançado.
      3. Descongelar suavemente DH5 α células supercompetentes em gelo.
      4. Adicionar 50 μL do reagente a 150 μL de células supercompetentes DH5 α pré-arrefecidas e incubar em gelo durante pelo menos 30 min.
      5. Transfira os tubos para um bloco de aquecimento pré-aquecido a 42 ° C e deixe-os por 90 s. Colocá-los em gelo por 2 min.
      6. Adicionar caldo de lisogenia pré-aquecido (LB) às células α DH5 transformadas e incubar a 37 ° C durante 1 h com agitação a 180 rpm.
      7. Espalhar as células transformadas em placas de agar LB-ampicilina e incubar durante a noite a 37 ° C.
         NOTA: A ampicilina é utilizada para selecção uma vez que o plasmídeo GEX-GST-Nrf2 tem o marcador de resistência à ampicilina. Utilizar antibióticos apropriados, dependendo do marcador de resistência do plasmídeo mutagenizado.
      8. Escolher uma única colônia da placa, transferi-la para 5 mL de LB-ampicilina e incubar durante a noite a 37 ° C com agitação a 180 rpm.Para a verificação da sequência mutagénica, avaliar pelo menos três colónias.
      9. Extrair ADN utilizando um kit de miniprep de ADN para análise de sequência de ADN; Siga o protocolo do fabricante.
      10. Verificar as sequências de ADN mutagénicas utilizando um analisador automático de sequência de ADN de acordo com o protocolo do fabricante. Utilizar pelo menos 200 ng da construção de ADN para a verificação de sequências mutantes.
2. Purificação da Proteína Recombinante GST-Nrf2
   1. Expressão da proteína de fusão GST-Nrf2 mutagénica em Escherichia coli
      1. Transformar o plasm�eo mutag�ico pGEX-GST-Nrf2 em c�ulas BL21 . Inocular uma única colónia em 25 mL de caldo LB contendo ampicilina (100 μg / mL) e incubar a 37 ° C num rotador de um dia para o outro.
      2. Inocular as células cultivadas em 100 mL de caldo LB contendo ampicilina (100 μg / mL) a uma razão de diluição de 1: 100.
      3. Incubar a 37 ° C sobre uma rotaçãoOu até a absorvância a 600 nm atingir cerca de 0,4-0,8 (aproximadamente 4 h).
      4. Adicionar 100 μL de IPTG 1 M a 100 mL de células cultivadas para preparar uma concentração final de IPTG 1 mM.
      5. Incubar as células a 30 ° C num rotador durante 6 h ou durante a noite para a expressão da proteína.
      6. Centrifugar as células a 5000 xg durante 20 min e ressuspender os sedimentos celulares com 1 mL de tampão de lise bacteriana (HEPES 25 mM, EDTA 5 mM, DTT 2 mM, CHAPS a 0,1%, pepstatina a 1 ug / ml, leupeptina 0,5 ug / mL, E PMSF 1 mM) em gelo.
      7. Lixar os grânulos de células utilizando um homogeneizador ultra-sónico com intervalos de 2 s durante 2 min a 50% da potência máxima produzida.
      8. Centrifugar as células a 12.000 × g durante 15 min a 4 ° C e recolher o sobrenadante.
   2. Purificação da Proteína GST-Nrf2 Recombinante
      1. Preparar 200 μL de esferas de glutationa-agarose a 50% (v / v) e lavar com 1 mL de PBS (pH 7,3; NaCl 140 mM, KCl 2,7 mM, Na2 10 mM HPO ₄ , e 1,8 mM KH ₂ PO ₄ ). Recolher as esferas por centrifugação a 500 xg durante 1 min. Repita o passo de lavagem três vezes.
      2. Adicionar o lisado celular aos 200 μL preparados de esferas de glutationa-agarose a 50% (v / v) e incubar a 4 ° C num rotador de extremidade sobre extremidade durante 2 h.
      3. Recolher as esferas de glutationa-agarose combinadas com a proteína GST-Nrf2 por centrifugação a 500 xg durante 1 min. Remover o sobrenadante usando uma seringa de 1 mL com uma agulha de 31 G.
      4. Lavar as esferas com 1 mL de PBS (pH 7,3), como no passo 1.
      5. Adicionar 500 μL de tampão de eluição (Tris-HCl 50 mM e glutationa reduzida 10 mM, pH 8,0) às esferas de glutationa-agarose combinadas com GST-Nrf2. Incubar a 4 ° C em um rotador de ponta-final durante 30 min.
      6. Centrifugar a 500 xg durante 1 min e recolher o sobrenadante.
      7. Adicionar novamente 300 μL de tampão de eluição às contas e repita os passos 3.2.2.5-3.2.2.6 duas vezes.
   3. Confirmação da Proteína GST-Nrf2 Purificada
      1. Preparar 5 μL da amostra para visualização da quantidade de proteína com 0,5 μg de proteína BSA padrão.
      2. Executar as amostras num gel SDS-PAGE a 7,5% a 70 V durante 20 min e depois a 140 V durante 60 min.
      3. Mancha o gel com 0,1% de solução de coloração CBB (0,1 g de CBB R250, 40 mL de metanol a 99%, 10 mL de ácido acético glacial e 50 mL de H2O destilado) durante 2 h e destain (30 mL de metanol, 10 mL de ácido acético glacial e 60 mL de H2O destilada) até que as faixas sejam claramente mostradas.
      4. Coloque o gel desprotegido no papel de filtro e cubra com um invólucro transparente. Secar o gel com um secador de gel de vácuo a 80 ° C durante 1 h.
      5. Determinar a quantidade de proteína GST-Nrf2 mutante com densitometria para o ensaio in vitro de quinase de AMPK.
3. Ensaio de actividade de AMPK in vitro com um mutante espec�ico do local
   NÃOE: O ensaio de AMPK quinase in vitro é realizado de acordo com os passos 2.2-2.4, utilizando 0,4 μg de GST-Nrf2 de tipo selvagem purificado ou o mutante GST-Nrf2-S558A sem inibidores peptídicos. Siga todas as diretrizes de segurança radiológica descritas na etapa 1.
   1. Preparar um tampão de reacção em gelo com 0,15 μg de AMPK, 0,4 μg de GST-Nrf2 mutante ou de tipo selvagem e 6 μL de tampão quinase. Encha até 30 μL com DW estéril.
   2. Adicionar 1 μL de [γ- ³² P] -ATP (1 μCi / μL) aos tubos de reacção em gelo. Misturar o tampão de reação pipetando para cima e para baixo várias vezes e centrifugar.
   3. Incubar as amostras num bloco de aquecimento a 30 ° C durante 30 min.
   4. Parar a reacção de quinase adicionando 3 μL de tampão de amostra SDS 10x.
   5. Executar num gel SDS-PAGE a 7,5% a 70 V durante 20 min e depois a 140 V durante 1 h.
   6. Fixar o gel com o tampão de fixação durante 20 min, movê-lo sobre o papel de filtro e cobrir o gel com umaEnv.
   7. Secar o gel com o secador de gel de vácuo a 80 ° C durante 1 h e depois expô-lo durante a noite para uma tela de fósforo ou uma película de raios X.
   8. Digitalizar a tela de fósforo com um marcador de fósforo e mover o gel para um tubo de vidro para coloração CBB após a visualização de acordo com o passo 2.4.

Resultados

A Figura 1 e a Figura 2 demonstram os resultados de experiências repetidas no artigo anteriormente relatado ⁸ . Foram sintetizados três oligosséptidos de 10 resíduos diferentes imitando os locais alvo de AMPK putativos (# 1, 148-157 compreendendo Ser153; # 2, 330-339 compreendendo Ser335 e # 3, 553-562 compreendendo Ser558) e utilizados como concorrentes no Vitro . A fosforila�o de Nrf2 por AMP...

Discussão

Como uma maneira simples e conveniente para avaliar a autenticidade dos locais de fosforilação previstos mediados por AMPK, aqui descrevemos um ensaio de quinase in vitro que pode ser utilizado para descobrir um local de fosforilação específico utilizando péptidos competitivos e para verificar isto utilizando um mutante específico do local . Os dados representativos obtidos a partir do ensaio de actividade de AMPK competitivo in vitro combinaram os resultados de um ensaio utilizando uma proteí...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
HEPES	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	15630
MgCl2	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	208337
EGTA	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	E3889
DTT	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	D9779
β-glicerofosfato	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	G9422
Na3VO4	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	450243
Coquetel de inibidores de protease	Calbiochem, Nottingham, Reino Unido	539134
ATP	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	A2383
AMP	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	A1752
AMPK	Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY	14-840
Nrf2 (WT)	Abnova, cidade de Taipei, Taiwan	H00004780-P01
[γ-32< / sup>P] -ATP	PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA	NEG502A
Reagente de coloração EZblue	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	G1041
Pfu turbo DNA polimerase	Agilent Technologies, Santa Clara, CA	600250
dNTP mix	Agilent Technologies, Santa Clara, CA	200415-51	Evite múltiplos ciclos de descongelamento e congelamento
DpnI	New England Biolabs, Ipswich, MA	R0176S
LB caldo	Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Holanda	L1704
Ampicilina	Affymetrix, Santa Clara, CA	11259
Agarose LE	iNtRON Biotechnology, Sungnam, Coreia do Sul	32034
HiYield Plus Gel/PCR DNA Mini Kit	Real Biotech Corporation, Taipei, Taiwan	QDF100
Coomassie Brilliant Blue R-250	Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA	161-0400
Albumina de soro bovino	Bovogen Biologicals, Victoria, Austrália	BSA100
Glutationa Sepharose 4B	GE Healthcare, Marlborough, MA	17-0756-01
Ácido Acético glacial	Duksan pure chemicals, Ansan, Coreia
Álcool metílico	Daejung Chemicals & Metais, Siheung, Coreia do Sul	5558-4410
[header]
Typhoon FLA 7000	GE Healthcare, Marlborough, MA	28-9558-09
Kit SDS-PAGE	Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA	1658001FC
Bomba de vácuo	Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA	165-178
Secador de gel	Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA	165-1746
Agitador de dança	FINEPCR, Seul, Coréia	CR300	A máquina é necessária para a máquina de PCR de etapa de lavagem
	Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA	T100
Incubadora/agitadores	N-BIOTEK, GyeongGi-Do, Coréia	NB-205L
Microcentrífugas	LABOGENE, Seul, Coréia	1730R
Colunas	de cromatografiaLaboratórios Bio-Rad, Hércules, CA	732-1010