Avaliação da remoção de reserva e intracelular do cálcio diastólica cálcio sarcoplasmático em Cardiomyocytes Ventricular isolado

Resumo

Reciclagem de cálcio intracelular desempenha um papel crítico na regulação da função sistólica e diastólica em cardiomyocytes. Aqui, descrevemos um protocolo para avaliar sarcoplasmático Ca^{2 +} reserva e função de remoção de cálcio diastólica em cardiomyocytes por um sistema de imagem de cálcio.

Resumo

Reciclagem de cálcio intracelular desempenha um papel crítico na regulação da função sistólica e diastólica em cardiomyocytes. Retículo sarcoplasmático cardíaco (SR) serve como um reservatório de Ca^{2 +} para a contração, que reuptakes intracelular Ca^{2 +} durante o relaxamento. A SR Ca^{2 +} reserva disponível para batidas é determinante para contractibility cardíaca, e a remoção de intracelular Ca^{2 +} é crítica para a função cardíaca diastólica. Sob algumas condições fisiopatológicas, tais como diabetes e insuficiência cardíaca, liberação de cálcio prejudicada e SR Ca^{2 +} loja em cardiomyocytes podem estar envolvidos no progresso da disfunção cardíaca. Aqui, descrevemos um protocolo para avaliar SRCa^{2 +} reserva e diastólica Ca^{2 +} remoção. Brevemente, um único casos estava enzimaticamente isolado, e a intracelular Ca^{2 +} fluorescência indicada pelo Fura-2 foi gravada por um sistema de imageamento de cálcio. Para empregar a cafeína para indução total SR Ca^{2 +} lançamento, nós um programa de interruptor automático perfusão pré-estabelecido pela interligação do sistema de estimulação e sistema de perfusão. Em seguida, o encaixe de curva mono-exponencial foi usado para a análise de constantes de tempo de decaimento de pulsos de cálcio induzida por cafeína e transientes de cálcio. Nesse sentido, a contribuição do SR Ca^{2 +}-ATPase (SERCA) e at⁺-Ca^{2 +} trocador (NCX) para remoção de cálcio diastólica foi avaliada.

Introdução

Cálcio intracelular ([Ca^{2 +}]_eu) reciclagem desempenha um papel crítico na regulação da função sistólica e diastólica em cardiomyocytes¹. Como sabemos, induzida por cálcio Ca^{2 +} versão inicia o acoplamento, excitação-contração que traduzir o sinal elétrico para a contração. Despolarização da membrana ativa mecanismos L-tipo Ca^{2 +} canais, que induzem Ca^{2 +} lançamento do SR para o citoplasma via receptores ryanodine 2 (RyR2). Os transientes elevados citoplasmática Ca^{2 +} inicia a contração das miofibrilas. Durante a diástole, citoplasmática Ca^{2 +} é reuptaken para o SR medi....

Protocolo

todas as experiências em animais foram realizadas em conformidade com os protocolos aprovados pelo Comité de uso no centro de pesquisa Experimental, China Academy de chinês ciências médicas e Universidade de Zhejiang e institucional Cuidado Animal.

1. preparação da solução

1. preparar todas as soluções, conforme descrito na tabela 1.

2. isolamento de esquerda Ventricular (LV) Cardiomyocytes

Nota: LV cardiomyocytes são isolados enzimaticamente usando um sistema de perfusão Langendroff como descrito anteriormente, ^{7 ,} <....

Resultados

Aqui, ilustramos estreptozotocina (STZ) - induzida ratos diabéticos (DM) e idade-combinadas Sprague - Dawley (SD) ratos por exemplo. ratos machos de SD 8 semanas (200 ± 20 g) receberam uma única injeção intraperitoneal de STZ (70 mg/kg, ip) para o buffer de grupo ou citrato de DM para o grupo de controle. Uma semana após a administração de STZ, ratos com glicemia > 16.7 mmol/L foram considerados diabéticos. Depois de 8 semanas, os miócitos de LV foram enzimaticamente isolados. Após a .......

Discussão

Fluxo de cálcio libertado o SR é a principal fonte de Ca^{2 +} para sístole no coração. Em certa medida, a amplitude do SR Ca^{2 +} conteúdo e o fracionário Ca^{2 +} libertado o SR refletir SR Ca^{2 +} reserva disponível para a contração cardíaca. Por outro lado, a Ca^{2 +} reserva de SR depende da capacidade de recaptação de SR Ca^{2 +} , Ca^{2 +} vazamento de SR e seu equilíbrio através do SR durante a diástole^12,

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
NaCl	Alfa Aesar	012314
MgCl2	Alfa Aesar	012315
KCl	Alfa Aesar	11595
HEPEs	Sigma	H3375
D-Glicose	Alfa Aesar	A16828
NaOH	Alfa Aesar	A18395
KOH	Alfa Aesar	A18854
KH2PO4	Alfa Aesar	011594
MgSO4	Alfa Aesar	3337
L-Glutâmico	Alfa Aesar	A15031
Taurina	Alfa Aesar	A12403
EGTA	Sigma	E3889
Colagenase A	Roche	10103586001
Colagenase Tipo II	Worthington	LS004177
BSA	Roche	735094
cafeína	Sigma	C0750
Fura-2 AM	Invitrogen	F1201
Microscópio	Olympus	Olympus IX 71
Sistema Langendorff	Beijing Syutime Technology Co	PlexiThermo-S-LANGC
Micromanipulador	Links		MM33
Câmara de perfusão	IonOptix	FHD
Válvula Sistema de perfusão por gravidade controlada	ALA	VC 3-8
software de comando de válvula	ALA	VC 3 1.0.1.2
Regulador de fluxo de precisão	Delta Med	3204315
Lápis de perfusão de coletor multibarril	AutoMate Scientific	04-08-[360]
Micron Ponta Removível	AutoMate Scientific	360um I.d.
Sistemas de Medição de Fluorescência e Dimensionamento de Células	IonOptix	Hyperswitch
Software de gravação	IonOptix	IonWizard 6.2.59
Estimulador	IonOptix	MyoPacer EP
Ratos Sprague-dawley	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co.	SCXK 2016-01-007436

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