Artigo de método

Método de Implementação de Retroviral Bidirecional e Metodologia de PCR e Análise Quantitativa de Dados Workflow

DOI:

10.3791/55812

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14 de junho de 2017

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1UCLA AIDS Institute, University of California at Los Angeles (UCLA), 2Department of Microbiology, Immunology, & Molecular Genetics, University of California at Los Angeles (UCLA), 3Departments of Biomathematics and Mathematics, University of California at Los Angeles (UCLA), 4Personalized Genomic Medicine Research Center, Division of Strategic Research Groups, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, 5Department of Medicine, University of California at Los Angeles (UCLA), 6Department of Veterinary Biosciences, College of Veterinary Medicine, The Ohio State University (OSU)

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este manuscrito descreve o procedimento experimental e análise de software para um ensaio de site de integração bidirecional que pode simultaneamente analisar DNA de junção vetor-hospedeiro a montante e a jusante. Os produtos de PCR bidirecionais podem ser usados ​​para qualquer plataforma de seqüência a jusante. Os dados resultantes são úteis para uma comparação quantitativa de alto rendimento de alvos de DNA integrados.

Resumo

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Os ensaios do Site de Integração (IS) são um componente crítico do estudo dos sites de integração retroviral e sua importância biológica. Nos recentes estudos de terapia de genes retrovirais, os ensaios de IS, em combinação com a sequenciação da próxima geração, foram utilizados como ferramenta de rastreamento celular para caracterizar as populações de células-tronco clonais que compartilham o mesmo IS. Para a comparação precisa de repetir os clones de células-tronco dentro e entre diferentes amostras, a sensibilidade de detecção, a reprodutibilidade dos dados e a capacidade de alto rendimento do ensaio estão entre as qualidades de ensaio mais importantes. Este trabalho fornece um fluxo de trabalho detalhado de análise de dados e dados para a análise IS bidirecional. O ensaio bidirecional pode simultaneamente seqüenciar junções vetor-host a montante e a jusante. Comparado com as abordagens convencionais de seqüenciamento IS unidirecional, a abordagem bidirecional melhora significativamente as taxas de detecção de IS e a caracterização de eventos de integração em ambas as extremidades de tEle alvo DNA. O encanamento de análise de dados descrito aqui identifica e enumera com precisão as seqüências IS idênticas através de várias etapas de comparação que mapeiam as seqüências IS no genoma de referência e determinam erros de seqüenciamento. Usando um procedimento de ensaio otimizado, publicamos recentemente os padrões de repovoamento detalhados de milhares de clones de células estaminais hematopoiéticas (HSC) após transplante em macacos rhesus, demonstrando pela primeira vez o ponto de tempo preciso do repovoamento de HSC e a heterogeneidade funcional de HSCs no Sistema de primatas. O protocolo a seguir descreve o procedimento experimental passo a passo e fluxo de trabalho de análise de dados que identifica e quantifica precisamente as seqüências IS idênticas.

Introdução

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Retroviruses inserem seu DNA genômico no genoma do hospedeiro em vários locais. Esta propriedade única, que pode contribuir para o desenvolvimento de cânceres e outras formas de patogênese viral, tem o benefício irônico de tornar esses vírus altamente acessíveis à engenharia celular para terapia genética e pesquisa de biologia básica. O site de integração viral (IS) - a localização no genoma do hospedeiro onde um DNA estrangeiro (vírus) está integrado - tem implicações importantes para o destino dos vírus integrados e das células hospedeiras. Os ensaios IS foram utilizados em várias configurações de pesquisa biológica e clínica para estudar a seleção do site de integração retroviral e patogênese, desenvolvimento do câncer, biologia das células-tronco e biologia do desenvolvimento 1 , 2 , 3 , 4 . Baixa sensibilidade de detecção, baixa reprodutibilidade de dados e freqüente contaminação cruzada estão entreOs principais fatores que limitam as aplicações dos ensaios IS aos estudos atuais e planejados.

Muitas tecnologias de análise IS foram desenvolvidas. Os ensaios de locais de integração baseados em enzimas de restrição, incluindo a Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) 5 , a PCR inversa 6 e o PCR 7 da Medição Lineada por Amplificação (LAM), são os mais amplamente utilizados. O uso de enzimas de restrição específicas do site, no entanto, gera um viés durante a recuperação do IS, permitindo apenas um subconjunto de integromes (um DNA estrangeiro integrado no genoma do hospedeiro) na proximidade do site de restrição a ser recuperado 4 . As tecnologias de ensaio que avaliam mais detalhadamente o vetor IS também foram introduzidas nos últimos anos. Esses ensaios empregam várias estratégias, incluindo o PCR 8 mediado por Transposon, não restritivo (nr) -LAM PCR 9 , enzima de restrição do tipo II-mDigestão editada 10 , cisalhamento mecânico 11 e PCR aleatória baseada em hexâmero (Re-free PCR) 12 , para fragmentar DNAs genômicos e amplificar IS. As tecnologias atuais têm níveis variáveis ​​de sensibilidade de detecção, cobertura de genoma, especificidade de alvo, capacidade de alto rendimento, complexidade de procedimentos de teste e vies na detecção de frequências relativas de sites alvo. Dadas as diferentes qualidades dos ensaios existentes e a variedade de propósitos para os quais eles podem ser usados, a abordagem de ensaio ideal deve ser cuidadosamente selecionada.

Este trabalho fornece procedimentos experimentais detalhados e um fluxo de trabalho de análise de dados computacionais para um ensaio bidirecional que melhora significativamente as taxas de detecção e a precisão da quantificação da seqüência ao analisar simultaneamente o IS a montante e a jusante do DNA alvo integrado (ver Figura 1 para uma visão esquemática dos procedimentos de ensaio ). Esta abordagem também forneceS os meios para caracterizar o processo de integração retroviral (por exemplo, a fidelidade da duplicação do site alvo e as variações nas seqüências genômicas das inserções a montante e a jusante). Outros métodos bidirecionais foram utilizados principalmente para clonagem e seqüenciamento de ambas as extremidades do DNA alvo 11 , 13 , 14 . Este ensaio é amplamente otimizado para a quantificação de alto rendimento e reproduzível de clones marcados por vetores, utilizando o método de LM-PCR bem estabelecido e o mapeamento de análise computacional e para quantificar as junções a montante e a jusante. A análise bidirecional com a enzima TaqαI provou ser útil para quantificação clonal de alto rendimento em estudos pré-clínicos de terapia de células-tronco 2 , 15 . Este artigo descreve um método modificado usando um cortador mais freqüente (RsaI / CviQI - motivo: GTAC) que dobra tAs chances de detectar integromes em comparação com um teste baseado em TaqαI . Procedimentos detalhados de análise experimental e de dados que utilizam as enzimas do motivo GTAC para o lentiviral (NL4.3 e suas derivadas) e as análises do vector IS da gama-retroviral (vetores pMX) são descritas. Os oligonucleótidos utilizados no ensaio estão listados na Tabela 1 . Um script de programação interno para análise de seqüência IS é fornecido no documento suplementar.

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Protocolo

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1. Gerando Bibliotecas de Seqüência de Junção (esquerda) e a jusante (direita)

  1. Preparação do linkador de DNA:
    1. Prepare uma solução de ADN de ligação de 10 μL adicionando 2 μL de oligos de LINQUER_A 100 μM (final: 20 μM), 2 μL de oligos de LINQUER_B 100 μM (final: 20 μM), 2 μL de NaCl 5 M (final: 1M) e 4 μL de água livre de nuclease num tubo de PCR. Consulte a Tabela 1 para as sequências do linker.
    2. Incube a solução de DNA do linker a 95 ° C durante 5 minutos em um instrumento de PCR, pare o programa de corrida e desligue o instrumento do PCR. Deixe a solução do linker no instrumento por 30 minutos para esfriar lentamente o DNA do linker. A solução de DNA do linker pode ser armazenada a 4 ° C.
  2. Extensão de iniciador de biotina específica para LTR:
    1. Use um espectrofotômetro UV-Vis para determinar a concentração de DNA e os valores de 260/280 nm do DNA genômico de in vivoOu experiências in vitro . Diluir 1-2 μg de DNA genômico da amostra para um volume final de 170 μL de solução de DNA genômico usando água livre de nuclease.
    2. Prepare uma reação de PCR de 200 μl misturando 2,5 μL de cada 10 μM de iniciadores de biotina específicos de HIV-1 (L-BPs e R-BPs na Tabela 1 : total de 10 μL para quatro iniciadores específicos de lentivírus), 20 μL de termostato 10X Tampão de DNA-polimerase, 4 μL de dNTPs 10 mM (final: 200 μM de cada dNTP), 3 μL de 2,5 U / μL de polimerase de ADN termostável e 163 μL de DNA genômico.
      NOTA: Para os vetores de gammaretroviral (vetores pMX), use 5 μL de cada um dos dois iniciadores de biotina específicos de pMX 10 μM (L-BP e R-BP: total de 10 μL) em vez dos quatro iniciadores de biotina específicos de HIV-1 acima.
    3. Divida a solução em quatro tubos de PCR (cada 50 μL) e realize um único ciclo de extensão sob a seguinte condição: 94 ° C durante 5 min, 56 ° C durante 3 min, 72 ° C por 5Min, e 4 ° C para armazenamento.
    4. Junte todas as quatro reações de PCR em um tubo de microcentrífuga de 2 mL e siga o procedimento de purificação por PCR do kit de purificação por PCR. Eluir com 50 μL de tampão de eluição (tampão de eluição diluído em água 5 vezes fornecido no kit). Proceda imediatamente com o passo 1.3.1 ou armazene o DNA eluído a -20 ° C.
  3. Digestão RsaI e CviQI
    1. Prepare uma reação de digestão de 100 μL adicionando 50 μL de DNA (a partir do passo 1.2.4), 10 μL de 10x de tampão A e 2 μL (20 U) de enzima RsaI. Incubar a 37 ° C por 1 h em um instrumento de PCR.
    2. Adicionar 1 μL (10 U) de enzima CviQI à reação e incubar a 25 ° C durante 30 min em um instrumento de PCR. Proceda imediatamente com o passo 1.4.1
  4. Término complicado:
    1. Prepare uma mistura de 4,5 μL contendo 2,5 μL de fragmento grande de DNA Polymerase I (klenow) e 2 μL de DNTPs 10 mM. Transferência 181; L da mistura para a amostra de DNA da etapa 1.3.2. O volume total será de 102 μL. Misture bem com vortex e incube a 25 ° C durante 1 h em um instrumento de PCR. Proceda imediatamente com o passo 1.6.1.
  5. Preparação de esferas de estreptavidina:
    1. Responda brevemente a solução de pérolas de estreptavidina e transfira 50 μL para um novo tubo de microcentrífuga de 2 mL. Remova o sobrenadante usando o suporte magnético e lave as contas com 200 μL de solução de ligação.
    2. Ressuspender as contas em 100 μL de solução de ligação e colocar o tubo longe do suporte magnético. Proceda imediatamente com o passo 1.6.1.
  6. Ligação de grânulos de estreptavidina:
    1. Transfira 100 μL de amostra de DNA (passo 1.4.1) para a solução de grânulos re-suspenso de 100 μl (passo 1.5.2) e misture cuidadosamente por pipetagem para evitar qualquer formação de espuma da solução. Incubar o tubo à temperatura ambiente durante 3 h em uma roda rotativa ou rolo.
    2. Use o suporte magnético para capturar as contas e descarte o sobrenadante. Lavar as contas duas vezes em 400 μL de solução de lavagem e duas vezes em 400 μL de tampão de ligase de DNA 1x T4 (diluído a partir de solução 10X usando água isenta de nuclease).
    3. Ressuspender as contas em 200 μL de 1x T4 DNA ligase tampão (diluído a partir de solução 10X com água livre de nuclease) e colocá-lo longe do suporte magnético. Proceda imediatamente com o passo 1.7.1.
  7. Ligação ligante:
    1. Prepare uma solução de reação de ligadura de 400 μL em um tubo de microcentrífuga de 2 mL, misturando 0,5 μL do agente de ligação de DNA (etapa 1.1.2), 10 μL de tampão de ADN-ligase T4 de 10x, 20 μL de tampão de ADN-ligase T4 5X (contendo 25% de polietileno Glicol), 5 μL de T4 DNA ligase, 164,5 μL de água isenta de nuclease e 200 μL das esferas re-suspensas (etapa 1.6.3). Coloque o tubo de reação na roda rotativa e incube à temperatura ambiente (22 ° C) durante 3 h (ou 16 ° CO / N).
    2. Lave as contas duas vezes com a solução de lavagem e duas vezes com tampão de DNA polimerase termostável 1X (diluído a partir de solução 10x usando água livre de nuclease) usando o suporte magnético.
    3. Ressuspender as contas em 50 μL de 1x tampão de PCR termostático de DNA polimerase e mantê-la afastada do suporte magnético. Proceda imediatamente com o passo 1.8.1 ou armazene a 4 ° C por até um dia.
  8. Pré-amplificação do DNA da junção esquerda e direita:
    1. Preparar uma reação de PCR de 200 μL adicionando 10 μL de iniciador 1L 10 μM, 10 μL de iniciador 1R 10 μM, 20 μL de Primer 1 de 10 μM (Tabela 1), 10 μL de tampão de DNA-polimerização termostável 10X, 4 μL de DNTPs 10 mM (final: 200 μM de cada dNTP), 8 μL (20 U) de polimerase de ADN termostável e 88 μL de água livre de nuclease para as pérolas ressurcidas (50 μL) do passo 1.7.3.
    2. Alíquota a mistura de reação em 4 tubos de PCR (cada 501; L) e realizar PCR com a seguinte condição: 94 ° C de incubação durante 2 min; 25 ciclos de 94 ° C durante 20 s, 56 ° C durante 25 s e 72 ° C durante 2 min; E uma extensão final a 72 ° C durante 5 min.
    3. Junte todas as 4 reações de PCR em um tubo de microcentrífuga de 2 mL e siga o procedimento de purificação por PCR do kit de purificação por PCR. Eluir com 50 μL de tampão de eluição.
    4. Determine a concentração de DNA e os valores de 260/280 nm usando um espectrofotômetro UV-Vis; O DNA pode ser armazenado a -20 ° C até estar pronto para o próximo passo. Prossiga com as etapas 1.9.1 / 1.10.1 (opcional) ou diretamente com as etapas 1.11.1 / 1.12.1.
  9. Removendo o amplicão de DNA interno do lado esquerdo (opcional):
    1. Transfira até 100 ng de produto de PCR DNA do passo 1.8.4 para um tubo de microcentrífuga de 2 mL e ajuste o volume para 10 μL usando água livre de nuclease.
    2. Prepare uma reação enzimática de restrição direcionada especificamente ao lado interno do lado interno DNA amplicon.
      NOTA: A condição da reação pode variar dependendo da escolha da enzima. Por exemplo, ao remover o DNA interno do lado esquerdo de vetores lentivirais baseados em NL4.3, adicione 1 μL de pvuII , 2 μL de tampão B e 7 μL de água livre de nuclease. Incubar a 37 ° C por 1 h em um instrumento de PCR. Proceda imediatamente com o passo 1.11.1 ou armazene a -20 ° C.
  10. Removendo o amplicão de DNA interno do lado direito (opcional):
    1. Proceda da mesma forma que no passo 1.9.1.
    2. Prepare uma reação enzimática de restrição direcionada especificamente ao amplicão de DNA interno do lado direito.
      NOTA: Por exemplo, ao remover o DNA interno do lado direito dos vetores lentivirais baseados em NL4.3, adicione 1 μL de sfoI , 2 μL de tampão B e 7 μL de água livre de nuclease. Incubar a 37 ° C por 1 h em um instrumento de PCR. Proceda imediatamente com o passo 1.12.1 ou armazene a -20 ° C.
  11. EsquerdaAmplificação específica da função:
    1. Preparar uma reação de PCR de 50 μL misturando 5 μL de DNA a partir do passo 1.8.4 (ou do passo opcional 1.9.2), 5 μL de iniciador 2L 10 μM (final: 1 μM), 5 μL de Primer μ μ μ 1 (Final: 1 μM), 5 μL de 10x tampão de ADN polimerase termostável, 1 μL de dNTP 10 mM (final: 200 μM de cada dNTP), 2 μL (5 U) de polimerase de ADN termoestável e 27 μL de isento de nuclease agua.
    2. Realize o PCR com a seguinte condição: incubação a 94 ° C durante 3 min; 8-15 ciclos de 94 ° C durante 20 s, 56 ° C durante 25 s e 72 ° C durante 2 min; E uma extensão final a 72 ° C durante 5 min.
      NOTA: O DNA amplificado pode ser armazenado a -20 ° C. * Sugestão de otimização do número de ciclos.
    3. Siga o procedimento de purificação por PCR do kit de purificação por PCR. Eluir com 50 μL de tampão de eluição. Determine a concentração de DNA e os valores de 260/280 nm.
  12. Amplificação específica da junção direta:
    1. Todos os procedimentos são idênticos à "Amplificação específica da junção esquerda" (passos 1.11.1-1.11.3), exceto pelo uso de diferentes iniciadores; Use o iniciador específico da junção direita (2R-primer, veja a Tabela 1 ) nesta etapa.
  13. Teste de variação do comprimento do amplicão PCR:
    1. Analise as variações do comprimento do amplicão de PCR realizando eletroforese em gel de agarose a 2% ou eletroforese capilar ( Figura 2 ).
      NOTA: Este é um passo essencial para confirmar a conclusão dos procedimentos de ensaio e para fazer uma avaliação aproximada dos padrões IS com base nos padrões de banda de PCR. O amplicão de PCR purificado das etapas 1.11.3 e 1.12.3 pode ser usado para várias plataformas de seqüenciamento de DNA. Proceda com os procedimentos adequados de preparação da amostra para o seqüenciamento clássico da terminação da cadeia (Sanger) ou seqüenciamento da próxima geração. O DNA pode ser armazenado a -20 °C;

2. Análise de Seqüência de Computação IS

  1. Preparação de arquivos de dados:
    1. Prepare três arquivos de dados de entrada: um arquivo de dados de seqüência de formato fasta (Test_data.fa em dados suplementares), um arquivo tsv para os motivos de pesquisa para seqüências de vetores e conectores (Demultiplexing_Trimming_blunt_GTAC.tsv em dados suplementares) e um arquivo tsv para informações de enzimas de restrição (Enzyme.tsv em dados suplementares).
      NOTA: Estes arquivos são necessários para demultiplexação, corte de sequências de vetores e de vinculadores e remoção de seqüências vetoriais internas ( Figura 3A ). Instruções detalhadas passo a passo para implementar o fluxo de trabalho computacional são fornecidas no arquivo README.txt nos dados suplementares.
  2. Análise computacional:
    1. Execute demultiplexação e corte de scripts.
      NOTA: A seqüência em bruto será processada para demultiplexação e para o trimminG das sequências de vetor, linker e primer (veja STEP-1 no arquivo README.txt suplementar).
    2. Execute o comando de mapeamento (veja STEP-2 no arquivo README.txt) para mapear as seqüências processadas para o genoma de referência usando uma ferramenta de alinhamento semelhante a BLAST (BLAT; www.genome.ucsc.edu).
    3. Execute o script de análise IS quantitativo (consulte o STEP-3 no arquivo README.txt).
      NOTA: Dois arquivos de saída (Initial_count_without_homopolymer_correction.txt e Final_count.txt) serão gerados. Mais detalhes sobre mapeamento e estratégias de enumeração de seqüência podem ser encontrados no "arquivo README.txt nos dados suplementares e nas publicações anteriores 2 , 15 .

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Resultados

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O ensaio IS bidirecional gerou diferentes tamanhos de amplicões de PCR para as junções de hospedeiros vetoriais a montante (esquerda) e a jusante (direita) ( Figura 2 ). O tamanho de um amplicon de PCR depende da localização do motivo GTAC mais próximo a montante e a jusante de um integrome. O ensaio também produziu amplicões internos de PCR de DNA: seqüências retrovirais perto do trato de polipurina e o local de ligação do iniciador foram amplificados conco...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O ensaio bidirecional permite a análise simultânea de ambas as sequências de junção de DNA do vetor do vetor a montante (esquerda) e a jusante (direita) e é útil em uma série de aplicações de terapia genética, células-tronco e pesquisa de câncer. O uso de enzimas com motivo GTAC (RsaI e CviQI) e a abordagem de PCR bidirecional melhora significativamente as chances de detectar um integrome (ou uma população clonal) quando comparado aos ensaios baseados em enzimas de TCGA-padrão ( TaqαI ) 2

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O financiamento foi fornecido pelos Institutos Nacionais de Subsídios de Saúde R00-HL116234, U19 AI117941 e R56 HL126544; O National Science Foundation Grant DMS-1516675; Fundação Nacional de Pesquisa da Coréia (NRF-2011-0030049, NRF-2014M3C9A3064552); E o programa de iniciativa KRIBB.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Mistura termoestável da solução do tampão da polimerase do ADN600424PicoMaxx da polimerase
Agilent600424PicoMaxx Mistura da solução do tampão da polimerase do PicoMaxx
deoxynucleotide (dNTP)da mistura da solução de New England BiolabsN0447LdNTP (10 mM cada)
Tubos do PCRVWR International53509-304indivíduo Tampas anexadas
Tubo de microcentrífuga de 2 mLMolecular Bioproducts3453tubos de microcentrífuga
Kit de purificação PCRQiagen28106
RsaI Enzima de restrição New England BiolabsR0167L
CviQIEnzima de restriçãoEngland BiolabsR0639L
Tampão ANew England BiolabsB7204SNEB CutSmart tampão
DNA Polimerase I grande (klenow) fragmento New England BiolabsM0210LSolução de
esferas de estreptavidinaembotada Invitrogen 60101Dynabeads kilobaseBINDER kit
Solução de EncadernaçãoInvitrogen 60101Dynabeads kilobaseBINDER kit
Solução de LavagemInvitrogen Kit de ligação de ligação Dynabeads60101
magnéticoThermoFisher12321DDynaMag™-2 Ímã
T4 DNA ligaseNew England BiolabsM0202LT4 DNA ligase
10X T4 DNA ligase tampãoNew England BiolabsB0202ST4 DNA ligase reação tampão
5X T4 DNA ligase tampãoInvitrogen 46300-018tampão da ligase do ADN T4 com
o espectrofotômetro do Uv-VisFisher ScientificS06497Nanodrop 2000
pvuIInew England BiolabsR0151Lenzima
da limitação sfoInew England BiolabsR0606L
tampãonew England BiolabsB7203SNEB buffer 3,1
Água livre de nucleaseTecnologias integradas de DNA11-05-01-14
Eletroforese capilarQiagen9001941QIAxcel eletroforese capilar
Veriti Termociclador rápido de 96 poçosThermo Fisher Scientific4375305PCR
Instrument Roda rotativa (ou rolo)EppendorfM10534004Cell Culture Roller Drums
DNA size marcadorQiagen929559marcador de tamanho QX (100 - 2.500 bp)
Marcador de tamanho de DNAQiagen929554marcador de tamanho QX (50 - 1.500 bp)
Marcadores de alinhamento de DNAQiagen929524QX Marcador
de alinhamento de DNA genomc DNAnão disponívelNão disponívelAmostra de DNA genomc de experimentos in vivo ou in vitro
da solução do com New Suporte do glicol-8000 do polietileno B

Referências

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