Expansão e adipogênese Indução de progenitores de adipócitos do tecido adiposo perivascular isolado pela classificação de células ativadas magnéticas

Resumo

Aqui, relatamos um método para o isolamento das populações de células progênitentes de adipócitos (APC) do tecido de tecido adiposo perivascular (PVAT) usando a classificação celular celular ativada por magnética (MCS). Este método permite um maior isolamento de APC por grama de tecido adiposo quando comparado à Classificação de células ativadas por fluorescência (FACS).

Resumo

A expansão do Texo Adiposo Perivascular (PVAT), um importante regulador da função vascular através da sinalização paracrina, está diretamente relacionada ao desenvolvimento da hipertensão durante a obesidade. A extensão da hipertrofia e hiperplasia depende da localização do depósito, do sexo e do tipo de fenótipos da célula progenitora de adipócitos (APC) presente. As técnicas utilizadas para APC e isolamento de pré-adipitos nos últimos 10 anos melhoraram drasticamente a precisão em que as células individuais podem ser identificadas com base em marcadores de superfície celular específicos. No entanto, o isolamento de APC e adipócitos pode ser um desafio devido à fragilidade da célula, especialmente se a célula intacta deve ser retida para aplicações de cultura de células.

A Classificação Celular ativada por magnética ( MCS) fornece um método para isolar um maior número de APC viável por unidade de peso de tecido adiposo. O APC colhido pelo MCS pode ser usado para protocolos in vitro para expandir a preaOs dipócitos e diferenciá-los em adipócitos através do uso de coquetéis de fatores de crescimento, permitindo a análise do potencial prolífico e adipogênico retido pelas células. Este experimento centrou-se nos depósitos de PVAT aórtica e mesentérica, que desempenham papéis fundamentais no desenvolvimento de doenças cardiovasculares durante a expansão. Esses protocolos descrevem métodos para isolar, expandir e diferenciar uma população definida de APC. Este protocolo MCS permite que o isolamento seja usado em qualquer experiência onde a classificação celular seja necessária com equipamento ou treinamento mínimo. Essas técnicas podem auxiliar experimentos adicionais para determinar a funcionalidade de populações de células específicas com base na presença de marcadores de superfície celular.

Introdução

O Texo Adiposo Perivascular (PVAT), devido à sua proximidade com os vasos sanguíneos, é um importante componente de sinalização paracrina na função vascular ¹ . A expansão deste tecido adiposo é dependente do fenótipo das células progenitoras de adipócitos (APC) presentes ^{2 , 3} . O isolamento de células de tecidos adiposos é difícil, pois os adipócitos primários são frágeis, flutuantes e variam em tamanho. Certas técnicas de isolamento também podem alterar o fenótipo e a morfologia celular aumentando a síntese de proteínas inflamatórias e reduzindo a expressão genética adipogênica ⁴ , enfatizando a importância de um protocolo que mantenha a integridade das células.

A cultura de células primárias e subpopulações específicas de pré-adipócitos dá uma abordagem reducionista ao crescimento in vivo e mantém uma composição genética celular equivalente ⁵ , embora funcioneEu com estas células é limitado devido a deterioração com o envelhecimento, ou senescência ⁶ . Os pré-adipócitos de vários depósitos adiposos, incluindo depósitos subcutâneos e omental, também demonstram diferenças na proliferação ⁷ , o que enfatiza a importância de coletar células de locais anatômicos específicos. As células precursoras de depósitos adiposos brancos não PVAT foram caracterizadas em estudos anteriores ^{7 , 8 , 9} , mas menos conhece-se sobre os fenótipos de PVAT APC.

As técnicas aqui descritas permitem a análise de populações de APC específicas e definidas com impacto mínimo na morfologia, viabilidade e potencial de proliferação e diferenciação. A classificação de células ativadas por magnética (MCS) é passível de aplicações a jusante, como a cultura, à medida que as contas se dissolvem sem alterar a célula. MCS também é econômico, e uma vez que o anticorpoAs centralizações foram padronizadas, a necessidade de ensaios de citometria de fluxo é mínima. Estudos in vitro com precursores de PVAT também podem dar um vislumbre do potencial que essas células primárias podem ter.

Protocolo

Todos os procedimentos descritos neste artigo seguem as diretrizes estabelecidas pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso Animal (IACUC) da Michigan State University. Todos os buffers e mídias devem ser protegidos da luz.

1. Preparação de Buffers, Mídia e Instrumentos

1. Preparar a solução tampão bicarbonato de Krebs Ringer (KRBB): cloreto de sódio 135 mM, cloreto de potássio 5 mM, sulfato de magnésio 1 mM, dibásico de fosfato de potássio 0,4 mM, glicose 5,5 mM, antibiótico / antimicótico a 1% (10 000 unidades / mL de penicilina, 10 000 μg / Ml de estreptomicina, 25 μg / mL de anfotericina B) e 10 mM de HEPES (pH = 7,4). Esta solução é estável durante 3 semanas quando mantida estéril e a 4 ° C.
2. Preparar solução de colagenase tipo 1: 1 mg / mL em KRBB com 4% de albumina de soro bovino (BSA). Esta solução deve ser mantida a 37 ° C e é estável durante 4 h.
3. Preparar solução tampão de lise de eritrócitos: cloreto de amônio 154 mM, bicarbonato de potássio 10 mME EDTA 0,1 mM. Mantenha-se a 4 ° C por até um mês.
4. Preparar o tampão de bloqueio MCS: Base de mídia DMEM / F12, 10% de soro bovino fetal (FBS), 5% de soro normal de burro, 40 μL / mL de F (ab) Fragmento de Igreja anti-rato de burro. Mantenha-se a 4 ° C por até um mês.
5. Preparar Solução tampão MCS: solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH = 7,5), BSA a 0,5% e EDTA 2 mM. Mantenha-se a 4 ° C por até um mês. De-gas solução por aquecimento a 37 ° C em um recipiente de vidro e, em seguida, aplicando um vácuo durante 15 s. Deixe selado selado sem uso.
6. Preparar a média basal da fração vascular estromal (SVF): Meio de Eagles Modificado por Dulbecco (DMEM): F12, 15% de soro fetal de vitela (FCS), 1% de antibiótico / antimicótico (10 000 unidades / mL de penicilina, 10 000 μg / mL de estreptomicina, 25 μg / Ml de anfotericina B), bicarbonato de sódio a 44,05 mM, ácido ascórbico 100 uM, biotina 33 μM, pantotenato 17 μM, L-glutamina 2 mM e HEPES 20 mM. Mantenha estéril e a 4 ° C por até 2 semanas.
7. Prepare APC &# 160; Mídia: meio basal com fatores de crescimento adicionais incluindo fator de crescimento epidérmico de 10 ng / mL), fator inibidor de leucemia (10 ng / mL), factor de crescimento derivado de plaquetas BB (10 ng / mL) e fator básico de crescimento de fibroblasto ( 5 ng / mL). Mantenha estéril e a 4 ° C por até 2 semanas.
8. Preparar o meio de indução de APC: meio de APC com FBS a 10%, insulina de 2,5 μg / mL, 2-isobutil-1-metilaxantina 0,5 mM (IBMX), dexametasona 1 μM e T3 de 200 pM (hormônio da tiróide de triiodotironina). Mantenha estéril e a 4 ° C por até 2 semanas.

2. Isolamento de progenitores de adipócitos

1. Anestesiar o rato de acordo com as diretrizes institucionais. Coloque o rato na decúbito dorsal. Confirme a profundidade da anestesia através de uma pitada de dedo do pé e a perda de resposta reflexa a este estímulo doloroso.
   NOTA: Este protocolo usa ratos Sprague Dawley de 10 semanas e 70 mg / kg de pentobarbital administrado por meio de uma injeção intraperitoneal.
2. Faça uma incisão da linha média vertical wCom tesoura ao longo do esterno na área torácica e na área perineal. Acesse a cavidade abdominal e expõe a artéria mesentérica superior, os vasos de resistência mesentérica pequena (mPVAT) e a aorta torácica (aPVAT).
   1. Segure todas as conexões com o mesentério e a aorta e remova os vasos do animal. Isolar PVAT usando um microscópio de dissecação e placa de Petri preenchida com KRBB para ver os vasos e isolar PVAT.
   2. Neste experimento, colete gonadal (GON) adiposo para representar um depósito adiposo não-PVAT. Coloque almofadas de gordura isoladas no gelo em KRBB com HEPES 10 mM (pH = 7,4).
   3. Em um capô de biossegurança, transfira cerca de 50 mg de tecido para um tubo de 1,7 mL com 1 mL de solução de colagenase tipo I e mole com tesoura de tecido (peças de 1 a 3 mm).
3. Digerir as amostras incubando a 37 ° C em uma incubadora de rotisserie (ou incubadora com um agitador orbital) durante 1 h. Em uma capa de segurança de biossegurança, filtra o material digerido sequencialmente através de 100 e 40 Μm células em um tubo de 50 mL. Centrifugar o filtrado resultante a 4 ° C durante 10 min a 300 × g.
   NOTA: Todas as etapas no protocolo a partir daqui para a frente devem ser realizadas em um capô de biossegurança para manter as células estéreis.
4. Verter o sobrenadante e ressuspender os grânulos contendo as células SVF em 1 mL de solução de tampão de lise de eritrócitos 1X e transferir para um tubo de microcentrífuga de 1,7 mL. Incubar células durante 5 min à RT protegido da luz e centrifugar a 4 ° C durante 5 min a 300 x g.
5. Despeje o sobrenadante e ressuspenda o sedimento celular restante em SVF Basal Media. Coletar uma sub-amostra de 20 μL para contar células vivas com solução Trypan Blue.
   NOTA: O número de células SVF que podem ser isoladas variará de acordo com o site. Os números médios de SVF colhidos por mg de tecido são: aPVAT = 5,0 ± 2,0x10 ³ , mPVAT = 1,04 ± 0,62x10 ⁴ , GON = 2,4 ± 1,2x10 ⁵ .

3. Classificação de células activadas por magnéticas

_content "> NOTA: isole APC de SVF com base em marcadores de superfície de células CD34 e PDGFRα executando todos os passos a 4 ° C.

1. Células de rotação durante 5 min a 300 x g. Verter o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular no tampão de bloqueio MCS a 1 x 10 ⁶ células / mL e incubar durante 20 min.
   NOTA: As suspensões de células de 1 x 10 ⁶ - 2 x 10 ⁸ células / mL podem ser separadas de forma eficaz.
2. Incubar células com 5 μL de FITC-conjugated Mouse anti-CD34 (1 μg / 1 x 10 ⁶ células) durante 30 minutos a 4 ° C. Células de rotação durante 5 min a 300 xg e 4 ° C.
   1. Incube com 4 μL de microbejas anti-FITC e 96 μL de tampão MCS (volume total de 100 μL) durante 5 min a 4 ° C no escuro para separar células CD34 ⁺ e CD34.
3. Anexe o separador magnético ao suporte e coloque a coluna MultiSort (MS), com as asas da coluna para a frente, no separador. Coloque um 5 mLTubo de recolhimento sob a coluna MS no suporte do tubo superior.
4. Prepare a coluna MS por enxágüe com a solução tampão MCS. Aplique 500 μL de MCS Buffer em cima da coluna e deixe o buffer passar. Descarte o efluente e mude o tubo de recolha.
5. Carregue a suspensão celular marcada com anticorpo na coluna de MS preparada. Recolher fluxo através de células não marcadas.
6. Lavar a coluna MS com 500 μL de tampão MCS desgaseificado 3x. Recolher células não marcadas que passam e combinam com o fluxo através do passo anterior.
7. Remova MS Column do separador magnético e coloque-o sobre um novo tubo de coleta. Pipetar 1 mL de tampão MCS na coluna MS. Inflame imediatamente a fração com as células marcadas magnéticamente com firmeza, mas lentamente, aplicando o êmbolo fornecido com a coluna para não permitir o excesso de gás na coluna.
   NOTA: números de células isolados variam de acordo com o site. Números médios de CD34 ⁺ APC isolados da população SVF porMg de tecido são: aPVAT = 2,6 ± 0,43x10 ² , mPVAT = 9,6 ± 1,4x10 ² , GON = 1,3 ± 0,22x10 ³ .
8. Células de rotação durante 5 min a 300 × g e 4 ° C. Incubar a fração CD34 ⁺ coletada em 10 μL de uma solução 1: 200/1 x 10 ⁶ células Coelho anti-PDGFRa durante 30 min a 4 ° C.
   1. Centrifugue as células novamente durante 5 min a 300 xg e 4 ° C. Incubar células marcadas com 4 μL de microbipas IgG anti-coelho e 96 μL de tampão MCS repetindo os passos 3.3 a 3.7 para isolar.
      NOTA: números de células isolados variam de acordo com o site. Os números médios de PDGFRα ⁺ APC isolados da população CD34 ⁺ por mg de tecido são: aPVAT = 2,4 ± 0,64, mPVAT = 8,4 ± 2,4, GON = 10,4 ± 1,9, o que é de 0,5 a 10% da população previamente isolada.

4. Cultura celular e adipogênese Indução

1. Cultura do SVFE APC em placas de cultura de tecidos de 6 poços em meio basal com substituição a cada 2 dias. Após 3 passagens em série, placa em placas de cultura de tecido preta de 96 poços a 1x10 ² células / poço para ensaios de proliferação, que são avaliados a 8, 24, 48 e 96 h, e a 50 000 células / poço em placas de 24 poços ou 10 000 células / poço em placas de cultura de tecidos de 48 poços para ensaios de adipogênese, que são qualitativos e quantitativos.
2. Suplementar a mídia basal APC por 48 h pós-confluência e antes da indução com a proteína morfogênica óssea 4 (3,3 nmol / L) conforme indicado ¹⁰ para a diferenciação. Induzir células após 48 h de confluência 100% (dia 0) usando o meio de indução APC para incubar as células.
3. Após 48 h, mude de mídia para manter as células na mídia de indução APC sem IBMX e dexametasona, durante 14 dias com mudanças de mídia a cada 48 h.
4. Isolamento MCS validado pela FACS.
   1. Pegue uma sub-amostra de 50 μL (50.000 células) de separação magnéticaCélulas e lavar com solução FACS.
   2. Centrifugar as células e ressuspender em 100 μL de uma solução 1: 1000 de IgG Dylight 405 anti-coelho de burro para marcar as células PDGFRα ⁺ . Incubar durante 30 minutos protegido da luz e a 4 ° C.
   3. Lavar as células e ressuspender em 200 μL de solução de formaldeído a 2% até o tempo para análise usando filtros de 488 nm (FITC) e 405 nm (Dylight 405) em um citómetro de fluxo.
      NOTA: A acumulação de lipídios por células cultivadas é avaliada quantitativamente usando um ensaio de fluorescência de adipogênese lipofílica em um leitor de microplacas que mede a fluorescência e usando pré-adipócitos como calibradores para o acúmulo de lipídios. O acúmulo de lípidos também é medido qualitativamente pela coloração e imagem de corante lipídico realizada em um microscópio invertido equipado com uma câmera, tornando a percentagem de células totais que contêm ou não contêm lipídios observáveis. Qualquer leitor de placas capaz de medir a fluorescência com excitação a 485 nm e a emissão em 572Nm é adequado para análise, bem como qualquer microscópio com uma câmera capaz de capturar imagens digitais.

Resultados

A capacidade proliferativa de pré-adipócitos eo potencial adipogênico de precursores de adipócitos são características que são mantidas in vitro ¹¹ . A proliferação in vitro de SVF isolada e APC de aPVAT, mPVAT e GON de ratos machos foi avaliada em 8, 24, 48 e 96 h após o revestimento usando um ensaio quantitativo de DNA. Não foram observadas diferenças de local na taxa de expansão de SVF em qualquer ponto do tempo, exceto para o APC de ...

Discussão

O foco central do presente experimento é o isolamento, expansão e adição adipogênica de APC de depósitos de PVAT. Aqui apresentamos um protocolo para o isolamento de APC com base na identificação de células que expressam os marcadores de superfície CD34 e PDGFRα. Estas proteínas de superfície foram previamente identificadas em APC com altas taxas de proliferação e o potencial para se diferenciar em adipócitos brancos ou marrons em vários depósitos adiposos ^{14 , 15}

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Dissecação de Tecido
Petri	Pyrex		7740 Vidro
Elastômero de Silicone	Dow Corning	Sylgard 170	Kit
Sutura de Seda	Trançada Aparelho Harvard	51-7615	SP104
Estereomicroscópio MZ6	Leica		10447254
Microscópio Stereomaster Fonte de luz de fibra óptica	Fisher Scientific	12562-36
Vannas Tesoura	George Tiemann & Pinça de	160-150
	George Tiemann & Co	160-55
Tesoura de Tecido	George Tiemann & Co	105-400
KRBB Solution
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	7647-14-5
Cloreto de Potássio	Sigma-Aldrich	7447-40-7
Sulfato de Magnésio	Sigma-Aldrich	7487-88-9
Fosfato de Potássio Dibásico	Sigma-Aldrich	7758-114
Glicose	Sigma-Aldrich	50-99-7
Antibiótico / Antimicótico	Corning	30-004-CI
HEPES	Corning	25-060-CI
forte>Digestão de Tecidos
Colagenase Tipo 1	Worthington Bioquímica	LS004196
Soro Bovino Albumina (BSA)	Fisher Scientific	9048-46-8
Tampão de Lise de Células Sanguíneas Vermelhas	BioLegend	420301	1X Solução de Trabalho
Banho de Água	Thermo-Fisher Scientific	2876	Banho de Agitação Recíproca
Gabinete de Biossegurança	Thermo-Fisher Scientific	1385
Incubadora de Rotisserie	Daigger	EF4894C
100 & Micro; Filtro de Células M	Thermo-Fisher Scientific	22-363-549	Amarelo
40 µ Filtro de Células M	Thermo-Fisher Scientific	22-363-547
Hemocitômetro	Cole-Parmer	UX-79001-00
Trypan Blue	Sigma-Aldrich	93595
Cell Isolation
OctoMACS Kit	Miltenyi Biotech	130-042-108
(DMEM):F12 Medium	Corning	90-090	Soro Fetal Bovino de Base Média
(FBS)	Corning	35016CV	USA Origins
Normal Donkey Serum	AbCam	AB7475
Anti-CD34	Santa Cruz	SC-7324
Anti-PDGFR&alpha	Thermo-Fisher Scientific	PA5-17623
IgG Anti-Coelho para Burros	Jackson ImmunoResearch	712-007-003
Fosfato Bufferizado (PBS) 1X	Corning	46-013-CM	1X Solução de Trabalho
EDTA	Fisher Scientific	15575020
Cell Culture
CO Incubadora de Células 2	Thermo-Fisher Scientific	51030285	Heracell 160i
Placas de 6 poços	Corning	3516	Placas de
48 poços	Corning	3548	tratadas com TC
, parede preta	Corning	353376
Bicarbonato de sódio	Sigma-Aldrich	144-55-8
Soro de bezerro fetal tratado com TC (FCS)	Corning	35011CV	EUA Origens
Ácido ascórbico	Sigma-Aldrich	50-81-7
Biotina	Sigma-Aldrich	58-85-5
Pantotenato	Sigma-Aldrich	137-08-6
L-Glutamina	Corning	61-030
Proteína Morfogênica Óssea 4 (BMP4)	Prospec Bio	CYT-081
Fator de Crescimento Epidérmico (EGF)	PeproTech	400-25
Fator Inibidor de Leucemia	PeproTech	250-02
Fator de Crescimento Derivado de Plaquetas BB	Prospec Bio	CYT-740
Fator Básico de Crescimento de Fibroblastos (bFGF)	PeproTech	450-33
Insulina	Corning	25-800-CR	Solução ITS
IBMX	Sigma-Aldrich	28822-58-4
Dexametasona	Sigma-Aldrich	50-02-2
T3 (Triiodotironina)	Sigma-Aldrich	6893-023
< strong > Análise Celular< / strong > Ensaio de
Proliferação CyQUANT	Thermo-Fisher Scientific	C7026
Reagente de Ensaio de Fluorescência	AdipoRed Lonza	PT-7009
Óleo Red O Reagente de Corante Lipídico	Sigma-Aldrich	O1391	Em Solução
M1000 Leitor de Microplacas	Tecan
Eclipse Microscópio Invertido	Nikon
Digital Sight DS-Qil Câmera	Nikon