Summary
Die Fähigkeit, präzise Abschriften oder Proteine in Drosophila Gewebe erkennen ist entscheidend für die Untersuchung ihrer Fülle und Lokalisierung, die im Zusammenhang mit den Entwicklungsprozess. Hier ist die Beschreibung eines einfachen Verfahrens pupal Flügel zu sezieren. Diese Flügel können als Muster in verschiedenen Techniken (PCR-Assay, Immunohistochemistry, etc.) verwendet werden.
Abstract
Flügel-Entwicklung in Drosophila Melanogaster ist ein ideales Modell für das Studium Morphogenese Gewebe Ebene. Diese Anhängsel entwickeln sich aus einer Gruppe von Zellen benannt Flügel imaginalen Scheiben gebildet während der Embryonalentwicklung. In die Larvenstadien wachsen die imaginalen Scheiben, Erhöhung der Anzahl der Zellen und monolayered epitheliale Strukturen bilden. Im Inneren der pupal Fall die imaginalen Scheiben Knospe heraus und Falten in Bilayer entlang einer Linie, die die künftige Marge des Flügels wird. Während dieses Prozesses stammen die longitudinale Primodia Venen Vene Zellen auf den zukünftigen dorsalen und ventralen Flächen des Flügels. Während das Puppenstadium kommunizieren die Streifen der Vene Zellen jeder Fläche um die enge Röhren zu generieren; zum gleichen Zeitpunkt beginnen die Kreuz-Venen ihrer Entstehung.
Mit Hilfe von entsprechenden molekularen Markern ist es möglich, die wichtigsten Elemente des Flügels während seiner Entwicklung zu komponieren zu identifizieren. Aus diesem Grund ist die Fähigkeit, präzise Abschriften oder Proteine in dieser Struktur erkennen kritischer für die Untersuchung ihrer Fülle und Lokalisierung, die im Zusammenhang mit den Entwicklungsprozess des Flügels.
Die Vorgehensweise hier konzentriert sich auf Manipulation pupal Flügel, eine ausführliche Anleitung zum Umgang mit den Flügel während das Puppenstadium zu sezieren. Die Zerlegung des pupal Gewebe ist schwieriger durchzuführen als ihre Gegenstücke in Dritte Instar Larven. Deshalb ist dieser Ansatz entwickelt wurde, um schnell und effizient hochwertige Proben zu erhalten. Details wie Immunostain und montieren diese Flügel Proben ermöglichen die Visualisierung von Proteinen oder Zellbestandteile, im Protokoll zur Verfügung gestellt werden. Mit wenig Erfahrung ist es möglich, 8-10 hochwertige pupal Flügel in kurzer Zeit zu sammeln.
Introduction
Drosophila Flügel werden aus den Flügel imaginalen Scheiben entwickelt. Das ursprüngliche dieser Flügel Discs während der Embryonalentwicklung als kleine Gruppen von 20-30 imaginalen Zellen, die aus embryonalen Epithel Biomembran beiseite. Während die Larve in die dritte Stufe der Instar wächst, tritt Mitose in die imaginalen Zellen zu bestimmten charakteristischen Zeiten heben seine Zahlen (ca. 50000 Zellen) und bilden die Flügel1,2,3Disc, 4. Da die Zellen sich vermehren, Mode sie eine röhrenförmige Epithel, was zu einer selbst faltbare kompakte Spirale. Während der Verpuppung die Scheibe Epithel Teleskope Form der zweischichtigen Flügel und die longitudinalen Venen beginnen als Lücken zwischen ihnen, dem tritt zweimal während Flügel Entwicklungsstörungen5,6.
Die Anordnung der Adern immer hat eine identische Muster; die Möglichkeit auf einfache Weise jede Veränderung innerhalb der Venen-Formation macht Mutationen extrem sichtbar (z.B. fehlende oder zusätzliche Adern, Änderungen in der Vene Positionen, etc..). Interessanterweise sind die Phänotyp-Variationen in der Regel der Nachweis von Mutationen in bekannten oder neuen Komponenten der Signalwege, die für Flügel Entwicklung relevant sind. Die Wege, die eine Rolle bei der Bestimmung der Position und Pflege Vene und intervein Gebiete gehört der Igel (Hh) Weg6,7,8.
Angesichts der Bedeutung der pupal Flügel als Modellsystem, wird es wichtig, gute Qualitätsproben mit arbeiten zu erhalten sein. In der Vergangenheit haben Wissenschaftler, die Protokolle, um Drosophila Flügel sezieren veröffentlicht haben einen passenden Guide, praktikable Proben zu erreichen nicht gegeben. Ohne die Führung eines Forschers kann nicht eindeutig den Prozess zu visualisieren. In dieser alternativen sezierenden Ansätze ist Puppe aufgeteilt in zwei, trennt die Flügel aus den umliegenden Gewebe und wiederholt gewaschen, um die Ablagerungen zu entfernen. Diese Art von Ansatz Ansprüche lassen die Flügel frei von Verunreinigungen, aber aufgrund der bisherigen Erfahrungen ist des Prozess langsamer und gibt es eine höhere Wahrscheinlichkeit einer Beeinträchtigung der Struktur der zerbrechlichen Flügeln9.
Die hier beschriebene Vorgehensweise wurde von der Nachfrage, eine schnelle und effiziente Methode pupal Flügel Proben geeignet, um bestimmte Proteine oder Abschriften mit Immunodetection Protokolle oder Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Assays erkennen erhalten finden entwickelt. Zur Veranschaulichung, der Ausdruck und die Lokalisierung von flickte (Ptc oder den kanonischen Rezeptor des Hh-Signalwegs) in pupal Flügel Proben, Bereitstellung eines Protokolls, die relevanten Details erfolgreich durchzuführen die komplette enthält erkannt wird Verfahren.
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Protocol
Tag1
1. Erhebung und Kultivierung Puppen.
- 0 h nach Puppenkammer Bildung (APF) oder Prepupae mit einem nassen Pinsel aus kultivierten Fläschchen entfernen und legen Sie sie in neue Fläschchen die Entwicklungszeit fast abgeschlossen (siehe 2.1 und 2.2).
Hinweis: Eine gesunde Population von Fliegen mit Kultivierung Standardprotokolle aufzubewahren. Nach drei oder vier Tagen die Eiablage, können die Erwachsenen Fläschchen erlauben eine optimale Entwicklung der Individuen entnommen werden. Sie sind bei einer konstanten Temperatur beibehalten, bis die dritte Instar Larven Verpuppung initiieren. Die Larven/pupal Übergang zeichnet sich durch die Bildung von der Prepupa als 0 h APF. Die Prepupa ist eine immobile weiße Larve, die eine längliche, runde Form mit vorspringenden vorderen Luftlöcher hat.
Tag2
2. Übertragung, Dissektion und Fixierung.
- Übertragen Sie die Puppen (2 Stunden bevor die Entwicklungszeit ist abschließen) mit einem Pinsel zu den Mikroskop-Objektträger mit doppelseitigem Klebeband befolgt es. Positionieren Sie die Puppen in Form eine Reihe mit dorsalen Seiten auf und cephalic endet mit Blick auf die gleiche Richtung.
- Objektträger auf konstante Temperatur zurück und lassen Sie die Puppen um Entwicklungsstörungen rechtzeitig (d.h. 24-30 h APF) abzuschließen.
Hinweis: Die Mikroskop-Objektträger mit doppelseitigem Klebeband werden eine vorübergehende Dissektion Plattform pupal Fall (siehe unten) zu entfernen. Zeitraffer auf dem Objektträger (außerhalb der Durchstechflasche) hilft den pupal Fall macht es mit einer Pinzette leicht zerbrechlich zu trocknen. - Entfernen Sie die Kiemendeckel aus der pupal Fall mit Pinzette.
- Brechen den Fall mit der Pinzette (wie im Video gezeigt) machen eine Linie entlang der Seite der Puppe an der kaudalen Ende. Mit der entsprechenden Beleuchtung ist es möglich, die interne Form der Puppe macht einen Raum oberhalb des Scharniers pupal Flügel deutlich zu erkennen. Dieser Raum dient als Leitfaden für die Öffnung durchführen ohne Beschädigung der Puppe.
- Teile der Fall ist, durch die geöffnete Grenze abholen und sie auf die gegenüberliegende Seite, wo sie doppelseitiges Klebeband zu halten wird, zu entfernen. Am Ende der Dissektion werden der Puppen fast "nackt", nur ein kleines Stück des Falles die hintere Spitze bedeckt wird.
Hinweis: Das verlassen eine kleine Menge des Falles auf das obere kaudalen Ende dient dazu eine glatte Version aus dem Gehäuse auf der Folie mit doppelseitigem Klebeband. Beweggründe für diese Aktion ist, denn wenn Sie zu viel entfernen der Fall riskieren Sie stark beschädigen die Puppe. Auf der anderen Seite wenn Sie zu wenig entfernen, wird die Puppe nicht leicht der Fall zum Nulltarif. - Drücken Sie (mit Pinzette) den Rest des Gehäuses. Diese Bewegung löst die vordere Ende die Puppe, so dass der Kopf und die Brust wieder in eine privilegierte Stellung zu halten und im nächsten Schritt übertragen werden.
- Nehmen Sie eine neue Folie mit doppelseitigem Klebeband und auf die Puppe oder Puppen Zeile zu invertieren. Wir empfehlen die Durchführung dieser Ansatz durch die Beobachtung der Bewegungen mit Hilfe des Stereomikroskops, Bruch der Puppen zu verhindern.
- Drücken Sie leicht um zu machen die Puppen auf dem Klebeband kleben und sanft gleiten die Folie um die Puppen aus dem Rest der Fälle zu entfernen. Invertieren der Mikroskop-Objektträger: die Puppen werden an der dorsalen Seite auf der Ebene des Kopfes stecken / Thorax-Bereich.
- Die nackten Puppen mit 4 % Paraformaldehyd abdecken und 10 min warten. Nach unserer Erfahrung hilft dieser Zeitspanne mit dem Fixativ, ändern Sie die Konsistenz der Nagelhaut, so dass es fest, weniger klebrig und leicht zu handhaben.
Hinweis: Zum Ausführen der Ribonukleinsäure (RNA) Extraktion Ersatz Paraformaldehyd für Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), die mit RNase freies Wasser und entfernen Sie die pupal Flügel machen einen Schnitt (mit Hilfe der Schere) in der Nähe der Anschlusspunkt der einzelnen Anhängsel. Mit Pinzette, übertragen Sie die pupal Flügel zu einem Microcentrifuge Schlauch mit 1 mL Guanidinium-Thiocyanat und Phenol-Reagenz. Nach dem Sammeln einer Gesamtmenge von 50-80-Flügel, Lagern Sie den Microcentrifuge Schlauch bei-80 ° C bis zur Durchführung der RNA-Extraktion10,11. - Machen Sie einen kleinen Schnitt an der Hinge-Region des Flügels oder in seiner Nähe. Lassen Sie das Fixiermittel, das Flügel-Epithel zu erreichen. Mit Hilfe einer Pipette (p200) bündig Fixativ über dem Flügel. Beim ersetzen spülen fixieren die kontaminierten mit neuem. Denken Sie nach dem Spülen, Flügel Fixiermittel für 5 Minuten.
Hinweis: Obwohl dieses Manöver hilft, den Großteil der kontaminierenden Gewebe wegzuräumen, einige Hemocytes und Fett-Tröpfchen können bleiben gefangen zwischen den dorsalen und ventralen epithelialen Schichten des Flügels (siehe Abbildung 1A). - Reißen mit Zangen von der Kutikula Grenze (wie im Video gezeigt) das Loch erweitert und ermöglicht die Freisetzung von Flügel Epithel aus der Kutikula Sac. Sobald das Flügel-Gewebe freigegeben wird, lassen Sie es in die Paraformaldehyd-Lösung um 30 min Zinsbindung abzuschließen.
- Übertragen Sie die Flächenflieger auf einer 4 quoll Plastikschale mit PBST gefüllt (Triton x-100 0,05 %). Laden über Nacht bei 4 ° C.
Tag3
(3) Primärantikörper Inkubation.
- Permeabilize das Gewebe die pupal Flügel in PBST Inkubation (Triton x-100 0,2 %) für 15 min mit einem rockigen Plattform, um eine sanfte flüssige Mitte Bewegung zu erleichtern.
Hinweis: Bis Montage der Proben, sollten die Schritte mit einem rockigen Plattform durchgeführt werden. - Die Proben unter Verwendung PBSTA zu blockieren (BSA 3 % Triton x-100 0,1 %) für 1 h.
- Verwenden Sie den gleichen Puffer verdünnen Sie den primären Antikörper (Maus Anti-Ptc, 1: 100) und die pupal Flügel über Nacht bei 4 ° c inkubieren
Tag 4
(4) sekundäre Antikörper Inkubationszeit.
- Wash Proben 4 x 10 min mit PBST (Triton x-100 0,05 %)
- Inkubieren mit sekundären Antikörper (z. B.Anti-Maus zu Fluorochrom konjugiert) verdünnt, um entsprechende Konzentration im PBSTA (BSA 3 % Triton x-100 0,1 %) bei Raumtemperatur im Dunkeln für 2 h.
Hinweis: Wenn es geeignet ist, verwenden Sie, 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) und/oder Phalloidin um das Gewebe counterstain. Fügen Sie diese Sonden mit dem sekundären Antikörper unter Berücksichtigung der Emissionswellenlänge von Fluorochromes, die Überlappung der Signale zu verhindern. - Wash Proben 4 x 10 min mit PBST (Triton x-100 0,05 %)
5. Montage
- Bereiten Sie eine Beispielfolie, indem Sie 4 Punkte von transparenten Nagellack auf Objektträger, als wären sie die Ecken eines Quadrats.
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Representative Results
Das Protokoll bietet eine einfache Methode für den Erhalt der pupal Flügel-Proben, die die vertraute Morphologie des Flügels zu behalten. Von diesen Vorbereitungen ist es möglich, Stapel von Bildern zu erhalten, die als 2-D oder 3-d, zu untersuchen, Verbreitung und/oder die Anreicherung von Proteinen während der Differenzierung des Flügels projiziert werden konnte. Ein ähnliches Protokoll (siehe Anmerkung in 2,9) lässt sich die große pupal Flügel-Probe (mit 50-80 pupal Flügel) notwendige, ergänzende Desoxyribonukleinsäure (DNA), die Vorlage für die PCR-Reaktionen zu synthetisieren zu sammeln.
Abbildung 1 : Igel Weg gen in Drosophila pupal Flügel
(A) gepatcht, die kanonische Rezeptor der Hedgehog-Signalweg, wurde bei 24-30 h APF visualisiert mit Maus Anti - Ptc. Kerne wurden counterstained mit DAPI während Actinfilamente mit einem grün-fluoreszierende Phalloidin visualisiert werden. Aktin Vertrieb hilft, um Flügel Venen und seine Beziehung mit gepatcht Ausdruck zu lokalisieren. Zum gleichen Zeitpunkt zeigt Phalloidin Fleck die Anwesenheit von einigen Hemocytes und Fett-Tröpfchen (große Kreise) als Verunreinigung Gewebe. 20 X Vergrößerung, anterior liegt. Bar, 100 µm (B) skalieren Amplifikate an Aktin (Bahn 1, 280 bp) und ptc (Bahn 2, 236 bp) erhielten mit cDNA dazu Boten-RNA (mRNA) Flügel Probe durch ein ähnliches Dissektion Protokoll generiert. MW, Molekulargewicht. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Die Methode der Dissektion in diesem Video beschrieben kann zur Vorbereitung hochwertige Proben von Drosophila pupal Flügel aus verschiedenen Entwicklungsstufen für viele Arten von Techniken (z. B. Immunfluoreszenz, cDNA Synthese zu PCR-Assays, in-vitro- Flügel Entwicklung). In Bezug auf diese Methode der beteiligten Wissenschaftler nutzten 24-30 h APF. Es sollte jedoch kein Hindernis in die wesentlichen Schritte in Dissektion der jüngere oder ältere Puppe. Änderungen müssen vorgenommen werden, um kleinere Bühne Puppe unterzubringen.
Das Protokoll kann durchgeführt werden, um eine Puppe oder mehrere Puppen gleichzeitig zu sezieren. Dies trägt zur Beschleunigung des Verfahrens, erleichtert, eine große Anzahl von Flügeln seziert zu erreichen. In diesem Fall gibt es die Möglichkeit eine Reihe von 4-5 Puppen gleichzeitig entfernen. Sie können entfernen Sie die Puppen zusammen oder wenn es nicht möglich ist, weiterhin einzeln auf derselben Folie entfernen (siehe Abschnitt III des Videos: "Mehrere Puppen Dissektion"). Um die nackte Puppe aus dem geöffneten Gehäuse zu entfernen, ist es wichtig, dass die hintere Spitze klein genug ist. Es ist möglich, den Fall vollständig zu entfernen; Obwohl es die Übertragung schneller machen würde, die Entfernung des gesamten Gehäuses ist anspruchsvoll und gibt es ein größeres Risiko einer Beschädigung der Puppe.
Erleben Sie diktiert, die eine wichtige Manöver zu berücksichtigen ist (die letzten 2 h vervollständigen die Entwicklungszeit festgelegt) verlassen die Puppe an den Mikroskop-Objektträger in die Brutmaschine aber außerhalb der Durchstechflasche befestigt. Diese Zeitspanne hilft zum Trocknen des Fall, so dass es leichter zu brechen. Ein weiterer wichtiger Schritt während der Präparation für Immunohistochemistry, soll die Nagelhaut abziehen, die die Flügel Epithel, dadurch gewähren des Zugriffs des Antikörpers, die gesamte Flügeloberfläche abdeckt. Dieser Schritt getan werden muss nach der Fixierung für einige Minuten (mindestens 5 min nach dem vornehmen des Schnittes am Anschlusspunkt) weil das Fixiermittel das Gewebe stabilisiert und die Nagelhaut Konsistenz ändert, dadurch leichter zu schälen.
Während der Durchführung alle Immunohistochemistry Schritte, sicher sein, dass die Flügel in ständiger Bewegung sind (rocken Plattform). Die Bewegung hilft, um den Austausch und das Eindringen der Lösungen bei Waschungen und Inkubationen zu verbessern. Dennoch ist es wichtig, dass sie das Auftreten von unerwünschten Verzerrungen in der Morphologie dieser fragilen Struktur (d. h. es ausreicht, dass die Schwingungen der Plattform bewegen die flüssigen Mittel mit sanft zu vermeiden die Proben).
Dieses Verfahren bietet einen alternativen und komplementären Ansatz für die bereits veröffentlichten Methoden für pupal Flügel Dissektion.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir würden gerne CSIC danken für die finanzielle Unterstützung für dieses Vorhaben, Mariana Di Doménico für ihre technische Hilfe mit der konfokalen Mikroskopie; für José Leonardo Báez für sein Manuskript Korrekturen; an Luciano Correa für sein Engagement für die Erstellung des Videos; für Natalia Rosano für die Kreditvergabe ihre Stimme für das Video und die Bloomington Drosophila Stock Center für die Bereitstellung der Bestände, die in dieser Studie verwendet. Die Apa1 monoklonalen Anti-Ptc entwickelt von Isabel Guerrero war erhalten von Entwicklungsstörungen Studien Hybridoma Bank (DSHB) unter der Schirmherrschaft der NICHD und vom Department of Biological Sciences, The University of Iowa, Iowa City, IA 52242 gepflegt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope with cool light illumination | Nikon | SMZ1000 | |
| Rocking platform | Biometra (WT 16) | 042-500 | |
| Microscope slides | StarFrost | 8037/1 | |
| Cover glasses (24 x 32 mm) | Deltalab | D102432 | |
| Forceps | F.S.T | 11252-00 | |
| Scissors | Lawton | 63-1400 | |
| Multi-well plastic dish | Thermo Scientific | 144444 | |
| p100 or p200 pipette | Finnpipette (Labsystems) | 9400130 | |
| 1X PBS (Dulbecco) | Gibco | 21600-010 | |
| 4% paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| BSA | Bio Basic INC. | 9048-46-8 | |
| Glycerol | Mallinckrodt | 5092 | |
| Tris | Amresco | 497 | |
| TRIzol Reagent | Ambion | 15596026 | |
| DEPC treated water | MO.BIO | 17011-200 | |
| Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG (H+L), 2 mg/mL (working dilution 1/800) |
Invitrogen | A11030 | |
| Monoclonal anti-Ptc (Apa-1) 54 μg/mL (working dilution 1/100) |
Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | By Isabel Gerrero from DSHB under the auspices of the NICHD and maintained by The University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, IA 52242. | |
| DAPI, 1 mg/mL (working dilution 1/5000) |
Invitrogen | 62248 | |
| Phalloidin conjugated to Alexa 488, 300 U/1.5 mL methanol (1/600 working dilution) |
Invitrogen | A12379 | |
| Canton S (fly stock) | Bloomington Drosophila Stock Center |
References
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