Summary
La capacidad para detectar con precisión las transcripciones o las proteínas en los tejidos de la Drosophila es fundamental para el estudio de su abundancia y localización relacionada con el proceso de desarrollo. Aquí está la descripción de un sencillo procedimiento para disecar alas pupas. Estas alas pueden utilizarse como muestras en diversas técnicas (análisis de PCR, immunohistochemistry, etc.).
Abstract
Desarrollo del ala de Drosophila melanogaster es un modelo ideal para el estudio de morfogénesis a nivel de tejido. Estos Apéndices se convierten de un grupo de células llamado discos imaginal de ala formados durante el desarrollo embrionario. En las etapas larvales los discos imaginales crecen, aumentando su número de células y la formación de estructuras epiteliales monolayered. Dentro de la envoltura pupal, los discos imaginales bud hacia fuera y doblan en bicapas a lo largo de una línea que se convierte en el futuro margen de la ala. Durante este proceso, las venas longitudinales primodia originan células de vena sobre las posibles superficies dorsales y ventrales del ala. Durante la etapa de pupa las rayas de las células de la vena de cada superficie de comunican para generar tubos apretados; al mismo tiempo, las venas Cruz comienzan su formación.
Con la ayuda de marcadores moleculares adecuados, es posible identificar los elementos principales que componen el ala durante su desarrollo. Por esta razón, la capacidad para detectar con precisión las transcripciones o las proteínas en esta estructura es fundamental para el estudio de su abundancia y localización relacionada con el proceso de desarrollo del ala.
El procedimiento descrito aquí se centra en manipular alas pupas, proporcionando instrucciones detalladas sobre cómo diseccionar el ala durante la etapa pupal. La disección de tejidos pupal es más difícil de realizar que sus contrapartes en larvas de tercer estadio. Por esta razón este enfoque fue desarrollado, para obtener muestras de alta calidad rápida y eficiente. Detalles de cómo immunostain y Monte estas muestras de ala, para permitir la visualización de proteínas o componentes de la célula, se encuentran en el protocolo. Con experiencia es posible recoger alas pupal de 8-10 alta calidad en un corto período de tiempo.
Introduction
Las alas de Drosophila se desarrollan desde los discos imaginal de ala. Primordial de estos discos de ala se ponen a un lado durante el desarrollo embrionario como pequeños grupos de 20-30 células imaginales que invaginate del epitelio embrionario. Mientras que la larva crece en la tercera etapa del estadio, mitosis se produce en las células imaginales en momentos característicos específicos elevando su número (aproximadamente 50000 células) y formando el ala disco1,2,3, 4. Como las células proliferan, forme un epitelio tubular, resultando en un espiral compacto auto plegable. Durante la pupación, el epitelio del disco telescopios a ala forma dos capas y las venas longitudinales comienzan como lagunas entre ellas, que ocurre dos veces durante ala del desarrollo5,6.
El arreglo de venas siempre tiene un patrón idéntico; la habilidad de identificar fácilmente cada alteración en la formación de las venas hace mutaciones muy visibles (por ejemplo, falta o extra venas, cambios en las posiciones de vena, etcetera.). Curiosamente, las variaciones de fenotipo son generalmente la evidencia de mutaciones en los componentes conocidos o nuevos de vías que son relevantes para el desarrollo del ala de señalización. Uno de los caminos que juega un papel en determinar la posición y mantener la vena y territorios intervein es la vía de Hedgehog (Hh)6,7,8.
Dada la importancia del ala pupa como un modelo de sistema, será importante obtener muestras de buena calidad para trabajar con. En el pasado, los científicos que han publicado protocolos para diseccionar las alas de Drosophila no han dado una guía apropiada para lograr muestras viables. Sin la dirección de un investigador uno no puede visualizar claramente el proceso. En estos enfoques alternativos de disección la pupa es dividida en dos, separando el ala del tejido circundante y lavada varias veces para eliminar los desechos. Este tipo de enfoque pretende dejar la puerta libre de contaminantes, pero debido a la experiencia previa en el proceso es más lento y existe una mayor probabilidad de comprometer la estructura de las frágiles alas9.
El procedimiento descrito aquí fue desarrollado por la demanda para encontrar un método rápido y eficiente para obtener muestras de ala pupa adecuadas detectar proteínas específicas o las transcripciones mediante inmunodetección de protocolos o ensayos de reacción en cadena (PCR) polimerasa. Para ilustrar esto, la expresión y localización de Patched (Ptc o receptor de la canónico de la vía de Hh) se detecta en muestras ala pupa, proporcionando un protocolo que incluye detalles relevantes con éxito para llevar a cabo la completa procedimiento.
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Protocol
Día 1
1. colección y cultivo pupas.
- Saque 0 h después de la formación del pupario (APF) o prepupas con un pincel mojado de cultivados frascos y colocarlos en frascos nuevos para casi completar el período de desarrollo (ver 2.1 y 2.2).
Nota: Debe mantenerse una sana población de moscas utilizando protocolos estándar de cultivo. Después de tres o cuatro días en los que se colocan los huevos, los adultos pueden extraerse viales para permitir un desarrollo óptimo de los individuos. Ellos se mantienen a una temperatura constante hasta que las larvas de tercer estadio inician la pupación. La transición de larvas/pupas se caracteriza por la formación de la prepupa considerada el 0 h APF. La prepupa es una larva blanca inmóvil que tiene un oblongo, con salientes espiráculos anteriores la forma redonda.
Día 2
2. transferencia, disección y fijación.
- Transferencia a las pupas (2 h antes de que el tiempo de desarrollo es completa) con un pincel, el portaobjetos con cinta de doble cara se adhirieron a él. Colocar las pupas para formar que una fila con los lados dorsales cefálicas y hasta termina en la misma dirección.
- Volver el portaobjetos a temperatura constante y permitir que las pupas completar el tiempo de desarrollo apropiado (es decir, 24-30 h APF).
Nota: El portaobjetos con la cinta de doble cara será una plataforma de disección transitorio para eliminar la envoltura pupal (véase abajo). El lapso de tiempo de la diapositiva del microscopio (fuera del frasco) ayuda a secar la envoltura pupal lo que es fácilmente rompible con fórceps. - Quitar el opérculo de la envoltura pupal con unas pinzas.
- El caso de la rotura con pinzas (como se muestra en el video) haciendo una línea a lo largo de la parte de la pupa al extremo caudal de la misma. Con la iluminación adecuada es posible detectar la forma interior de la pupa evidenciar un espacio justo encima de la bisagra del ala pupa. Este espacio sirve como guía para realizar la apertura sin dañar la pupa.
- Saque porciones del caso, recogiendo por la frontera abierta y llevarlos hacia el lado opuesto donde les mantendrá la cinta de doble cara. Al final de la disección las pupas será casi "desnudas", que solamente un pedazo pequeño de la caja va cubriendo la extremidad posterior.
Nota: El propósito de dejar una pequeña cantidad de casos en el extremo superior de la caudal es para una versión suave de la caja portaobjetos con cinta de doble cara. Razonamiento detrás de esta acción es porque si eliminas mucho del caso usted mucho riesgo de dañar la pupa. Por otro lado si quita muy poco, la pupa no fácilmente vendrá libre del caso. - Empuje hacia abajo (con pinzas) el resto de la caja. Este movimiento provocará el extremo anterior de la pupa, permitiendo que la cabeza y el tórax en una posición preferencial a adherirse y a transferirse en el paso posterior.
- Tomar una nueva diapositiva con cinta de doble cara e invertir en la pupa o fila de pupas. Se recomienda realizar este planteamiento mediante la observación de los movimientos con la ayuda del estereomicroscopio para evitar la rotura de las pupas.
- Presione ligeramente para que las pupas se adhieren a la cinta y deslice suavemente el portaobjetos para eliminar las pupas del resto de los casos. Invertir el portaobjetos: las pupas se pegan en el lado dorsal a la altura de la cabeza / área de tórax.
- Cubra todas las pupas desnudas con paraformaldehído al 4% y esperar 10 minutos. En nuestra experiencia, este lapso de tiempo con el fijador ayuda a cambiar la consistencia de la cutícula lo que firme, menos pegajoso y fácil de manejar.
Nota: Para realizar la extracción de ácido ribonucleico (ARN), paraformaldehido sustituto para solución salina tamponada con fosfato (PBS) con Rnasa agua libre y quitar las alas pupas haciendo un corte (con la ayuda de tijeras) cerca del punto de bisagra de cada apéndice. Usando pinzas transfiera el ala pupa a un tubo de microcentrífuga con 1 mL de reactivo de fenol y tiocianato de guanidinio. Después de recoger un total de 50-80 alas, almacene el tubo de microcentrífuga a-80 ° C hasta realizar la extracción de RNA10,11. - Hacer una pequeña incisión en la región de la bisagra del ala o cerca de él. Permitir que el fijador alcanzar el epitelio del ala. Con una pipeta (p200) ras fijador sobre el ala. Cuando cambie de lavado la contaminada para fijar nuevas. Después del lavado, mantener ala fijador durante 5 minutos.
Nota: Aunque esta maniobra ayuda a eliminar la mayoría de los tejidos contaminantes, algunos hemocitos y gotitas de grasa pueden permanecer atrapadas entre las capas epiteliales dorsales y ventrales del ala (véase figura 1A). - Tear con el fórceps de las fronteras de la cutícula (como se muestra en el video) ampliando el orificio y permitiendo la liberación del epitelio del ala del saco de la cutícula. Una vez que se libera el tejido del ala, dejar en la solución de paraformaldehído al completar 30 minutos de fijación.
- Transferencia de las alas fijas a un plato plástico 4 estaba llena con SAFT (Triton X-100 0.05%). Tienda durante la noche a 4 ° C.
Día 3
3. incubación del anticuerpo primario.
- Permeabilizar el tejido incubando las alas pupas en SAFT (Triton X-100 0,2%) durante 15 minutos usando una plataforma oscilante para facilitar un suave movimiento de medio líquido.
Nota: Hasta el montaje de las muestras, los pasos deben realizarse utilizando una plataforma oscilante. - Bloquear las muestras usando PBSTA (BSA 3% Tritón X-100 0.1%) durante 1 hora.
- Utilice el mismo buffer para diluir el anticuerpo primario (ratón anti-Ptc, 1: 100) e incubar las alas pupas durante la noche a 4 ° C.
Día 4
4 incubación del anticuerpo secundario.
- Lavado de muestras 4 x 10 min cada uno con SAFT (Triton X-100 0.05%)
- Incubar con el anticuerpo secundario (p. ej., anti-ratón conjugado con fluorocromo) diluido a la concentración adecuada en PBSTA (BSA 3% Tritón X-100 0,1%) a temperatura ambiente en la oscuridad, por 2 h.
Nota: Si es apropiado, utilice 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) o phalloidin para contratinción el tejido. Añadir estas puntas de prueba con el anticuerpo secundario teniendo en cuenta la longitud de onda de emisión de los fluorocromos para evitar la superposición de señales. - Lavado de muestras 4 x 10 min cada uno con SAFT (Triton X-100 0.05%)
5. montaje
- Preparar una diapositiva muestra colocando 4 puntitos de esmalte de uñas transparente en el portaobjetos como si fueran los vértices de un cuadrado.
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Representative Results
El protocolo ofrece un método sencillo para la obtención de muestras ala pupa que conservan la morfología familiar del ala. De estas preparaciones es posible obtener montones de imágenes que podrían proyectarse como 2-D o 3-d, para investigar la distribución y el enriquecimiento de proteínas durante la diferenciación del ala. Un protocolo similar (véase la nota de 2,9) puede utilizarse para recolectar la muestra ala pupa grande (con 50-80 pupa alas) necesaria para sintetizar ácido desoxirribonucleico complementario (cDNA), la plantilla utilizada en reacciones de PCR.
Figura 1 : Gen de vía de hedgehog en Drosophila alas pupas
Parches, (A) , el receptor canónico de vía de Hedgehog, se visualizó a las 24-30 h APF usando ratón anti - Ptc. núcleos fueron contratinción con DAPI que filamentos de actina son visualizados usando un phalloidin verde fluorescente. Distribución de actina ayuda para localizar venas de las alas y su relación con la expresión parcheado . Al mismo tiempo, phalloidin tinción revela la presencia de hemocitos y gotitas de grasa (círculos grandes) como contaminar el tejido. 20 aumentos, anterior es a. Escala de la barra, 100 μm (B) amplicones de actina (carril 1, 280 bp) y ptc (carril 2, 236 bp) fueron obtenidos usando el cDNA sintetizado a partir de ARN mensajero (ARNm) ala muestra generada por un protocolo de disección similar. MW: peso molecular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El método de disección se describe en este vídeo puede utilizarse para preparar muestras de alta calidad de alas pupas de Drosophila de diversas etapas del desarrollo de muchos tipos de técnicas (por ejemplo, la inmunofluorescencia, la síntesis de cDNA para análisis PCR, in vitro desarrollo del ala). En este método el científico involucrados han utilizado 24-30 h APF. Sin embargo debe haber ningún obstáculo dentro de los pasos esenciales en la disección de pupa más joven o más viejo. Cambios pueden tener que acomodar más pupa de etapa.
El protocolo podría realizarse para disecar una pupa o pupas varios al mismo tiempo. Esto ayuda a acelerar el procedimiento, haciéndolo más fácil llegar a un gran número de alas disecado. En este caso existe la opción de eliminar una fila de 4-5 pupas al mismo tiempo. Se puede eliminar las pupas juntos o si no es posible, continuar eliminar individualmente en la misma diapositiva (véase la sección III del video: "Disección de pupas múltiples"). Para quitar la pupa desnuda de caso abierto, es importante que la extremidad posterior es suficientemente pequeña. Es posible quitar el caso Aunque sería la transferencia más rápido, la eliminación de todo el caso es difícil y existe un mayor riesgo de dañar la pupa.
Experiencia dicta que una maniobra importante para considerar es dejar (el último 2 h para completar el tiempo de desarrollo estipulado) la pupa conectado al portaobjetos dentro de la incubadora, pero fuera del frasco. Este lapso de tiempo ayuda a secar el caso lo que es más fácil de romper. Otro paso crítico durante la disección para inmunohistoquímica, es despegarse de la cutícula que cubre el epitelio del ala, tal modo conceder el acceso del anticuerpo a la superficie toda ala. Este paso debe hacerse después de fijar durante varios minutos (menos de 5 min después de hacer la incisión en el punto bisagra) ya que el fijador estabiliza los tejidos y cambia la consistencia de la cutícula, haciéndolo más fácil de pelar.
Al realizar todos los pasos de immunohistochemistry, asegúrese de que las alas estén en constante movimiento (plataforma oscilante). El movimiento ayuda a mejorar el intercambio y la penetración de las soluciones durante el lavado y las incubaciones. Sin embargo, es importante hacerlo suavemente, evitando la aparición de distorsiones no deseadas en la morfología de esta frágil estructura (es decir, es suficiente que las oscilaciones de la plataforma desplazará ligeramente el medio líquido que contiene las muestras).
Este procedimiento proporciona un acercamiento alternativo y complementario a los métodos ya publicados para la disección ala pupa.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer a CSIC por el apoyo financiero dado este proyecto, Mariana Di Doménico para su asistencia técnica con microscopia confocal; a José Leonardo Báez para sus correcciones del manuscrito; a Luciano Correa por su dedicación a la creación del vídeo; a Natalia Rosano por prestar su voz para el vídeo y el Bloomington Drosophila Stock Center para proporcionar los recursos utilizados en este estudio. El Apa1 monoclonal anti-Ptc desarrollado por Isabel Guerrero fue obtenido de banco de hibridoma estudios del desarrollo (DSHB) bajo los auspicios de la NICHD y mantenido por departamento de ciencias biológicas, la Universidad de Iowa, Iowa City, IA 52242.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope with cool light illumination | Nikon | SMZ1000 | |
| Rocking platform | Biometra (WT 16) | 042-500 | |
| Microscope slides | StarFrost | 8037/1 | |
| Cover glasses (24 x 32 mm) | Deltalab | D102432 | |
| Forceps | F.S.T | 11252-00 | |
| Scissors | Lawton | 63-1400 | |
| Multi-well plastic dish | Thermo Scientific | 144444 | |
| p100 or p200 pipette | Finnpipette (Labsystems) | 9400130 | |
| 1X PBS (Dulbecco) | Gibco | 21600-010 | |
| 4% paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| BSA | Bio Basic INC. | 9048-46-8 | |
| Glycerol | Mallinckrodt | 5092 | |
| Tris | Amresco | 497 | |
| TRIzol Reagent | Ambion | 15596026 | |
| DEPC treated water | MO.BIO | 17011-200 | |
| Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG (H+L), 2 mg/mL (working dilution 1/800) |
Invitrogen | A11030 | |
| Monoclonal anti-Ptc (Apa-1) 54 μg/mL (working dilution 1/100) |
Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | By Isabel Gerrero from DSHB under the auspices of the NICHD and maintained by The University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, IA 52242. | |
| DAPI, 1 mg/mL (working dilution 1/5000) |
Invitrogen | 62248 | |
| Phalloidin conjugated to Alexa 488, 300 U/1.5 mL methanol (1/600 working dilution) |
Invitrogen | A12379 | |
| Canton S (fly stock) | Bloomington Drosophila Stock Center |
References
- Serrano, N., O'Farrell, P. H. Limb morphogenesis: connections between patterning and growth. Curr Biol. 7 (3), R186-R195 (1997).
- Blair, S. S. Compartments and appendage development in Drosophila. Bioessays. 17 (4), 299-309 (1995).
- Klein, T. Wing disc development in the fly: the early stages. Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 470-475 (2001).
- Beira, J. V., Paro, R. The legacy of Drosophila imaginal discs. Chromosoma. 125 (4), 573-592 (2016).
- De Celis, J. F., Diaz-Benjumea, F. J. Developmental basis for vein pattern variations in insect wings. Int J Dev Biol. 47 (7-8), 653-663 (2003).
- Blair, S. S. Wing vein patterning in Drosophila and the analysis of intercellular signaling. Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 293-319 (2007).
- Bier, E. Drawing lines in the Drosophila wing: initiation of wing vein development. Curr Opin Genet Dev. 10 (4), 393-398 (2000).
- De Celis, J. F. Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins. Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).
- Classen, A. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis. Methods Mol Biol. 420, 265-275 (2008).
- Bolatto, C., et al. Spatial and temporal distribution of Patched-related protein in the Drosophila embryo. Gene Expr Patterns. 19 (1-2), 120-128 (2015).
- Zuniga, A., et al. Genes encoding novel secreted and transmembrane proteins are temporally and spatially regulated during Drosophila melanogaster embryogenesis. BMC Biol. 7, 61 (2009).
