Artigo de método

Quimio-enzimático síntese de N- os glicanos para desenvolvimento de matriz e anticorpos de HIV de criação de perfil

DOI:

10.3791/55855

⸱

5 de fevereiro de 2018

 ,  ,  , 
1Genomics Research Center, Academia Sinica

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uma abordagem modular para a síntese de N- os glicanos para fixação a um vidro revestido de óxido de alumínio slide (slide ACG) como desenvolveu um microarray glicano e demonstrou-se seu uso para a criação de perfil de um HIV amplamente neutralizando anticorpos.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Apresentamos uma maneira altamente eficiente para a preparação rápida de uma vasta gama de N-ligadas a oligossacarídeos (estima-se que para exceder 20.000 estruturas) que são comumente encontrados em glicoproteínas humanas. Para alcançar a desejada diversidade estrutural, a estratégia começou com a síntese enzimática de quimioterapia de três tipos de módulos de fluoreto de oligosaccharyl, seguidos por sua gradual glycosylations α-seletiva para o 3-Ó e 6-O posiciona do resíduo de manose do trissacarídeo núcleo comum, tendo uma ligação crucial β-mannoside. Ainda mais, nós unimos os N- glicanos à superfície de uma lâmina de vidro revestido de óxido de alumínio (ACG) para criar uma matriz covalente mista para a análise da interação de hetero-ligante com um anticorpo de HIV. Em particular, o comportamento de vinculação de um recém isolados VIH-1 amplamente neutralizante anticorpo (bNAb), PG9, a mistura de espaçadas homem5GlcNAc2 (homem5) e 2,6-di-sialylated bi-antennary complexo tipo N- glicano (SCT ) em uma matriz ACG, abre uma nova avenida para guiar o projeto immunogen eficaz para o desenvolvimento de vacina contra HIV. Além disso, nossa matriz ACG encarna uma poderosa ferramenta para estudar outros anticorpos de HIV para o comportamento de vinculação de hetero-ligante.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os N- glicanos em glicoproteínas estão covalentemente ligados à asparagina (Asn) resíduo de sequon de Asn-Xxx-Ser/Thr o consenso, que afetam vários processos biológicos, tais como reconhecimento de conformação, antigenicidade, solubilidade e lectina de proteína 1 , 2. a síntese química de N-oligossacarídeos vinculados representa um desafio sintético significativo devido à sua enorme heterogeneidade micro estrutural e arquitetura altamente ramificada. A seleção cuidadosa de proteger grupos de sintonizar a reatividade dos blocos de construção, alcançar a seletividade em centros anomérico e uso correto de promotor / activator(s) são elementos-chave na síntese de oligossacarídeos complexos. Para resolver este problema da complexidade, uma grande quantidade de trabalho para avançar N- glicano síntese foi relatada recentemente3,4. Apesar dessas abordagens robustas, encontrar um método eficaz para a preparação de uma vasta gama de N- os glicanos (~ 20.000) permanece um grande desafio.

A taxa de mutação rápida do HIV-1 para atingir a extensa diversidade genética e sua capacidade de escapar de neutralizar a resposta imunitária, está entre os maiores desafios para desenvolver uma vacina segura e profilática contra HIV-15,6 , 7. uma tática eficaz que o HIV usa para evitar a resposta imune do hospedeiro é a glicosilação pós-traducional de gp120 de glicoproteína do envelope com um diverso N-ligados os glicanos derivados do anfitrião glycosylation máquinas8, 9. Um relatório recente sobre a análise precisa de recombinação monomérico HIV-1 gp120 glicosilação de células de rim humano embrionário (HEK) 293T sugere a ocorrência de microheterogeneity estrutural com um padrão característico de célula específico10 , 11 , 12. portanto, a compreensão das especificidades de glicano do HIV-1 bNAbs requer gp120 bem caracterizadas relacionados N- glicano estruturas em quantidade suficiente para análise.

A descoberta da tecnologia microarray de glicano fornecido alta exploração baseada na taxa de transferência de especificidades de uma diversa gama de proteínas carboidratos, adesinas vírus/bactérias, toxinas, anticorpos e lectines13,14 . O arranjo os glicanos sistemática em um formato de matriz baseada no chip poderia determinar interações do proteína-glicano problemático baixa afinidade a apresentação multivalentes15,16,17,18. Este arranjo de chip baseada glicano convenientemente aparece efetivamente imitar interfaces de celular. Para enriquecer a tecnologia e a superar a questão desigual associada com formatos de matriz convencional, nosso grupo desenvolveu recentemente um glicano matriz sobre uma lâmina de vidro revestido de óxido de alumínio (ACG) usando os glicanos de terminou de ácido fosfônico para aumentar a intensidade do sinal, homogeneidade e sensibilidade19,20.

Para melhorar o entendimento atual sobre glicano epitopos de HIV-1 recém isoladas amplamente neutralizando anticorpos (bNAbs), temos desenvolvido uma estratégia modular altamente eficiente para a preparação de um vasto leque de N-ligados os glicanos21 ,22 para serem impressos em um ACG deslize (ver Figura 1). Especificidade de estudos de perfil de bNAbs de HIV-1 em uma matriz ACG ofereceram a detecção incomum de comportamento de vinculação de hetero-glicano de bNAb altamente potente PG9 que foi isolado do HIV infectados indivíduos23,24,25.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. preparação de D1/D2 braço módulos22

  1. Preparação de intermediário 2
    1. Pesar a partir de material 1 (mostrado na Figura 2, p-methoxyphenyl-O-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside (100 mg, 0.204 mmol)) em um tubo de 15 mL e dissolver em Tris tampão (25 mM, pH 7,5) contendo dicloreto de manganês (MnCl2, 10mm) para obter uma concentração final de glicano de 5 mM.
    2. Adicione 2 equivalentes de galactose de difosfato de uridina (UDP-Gal).
    3. Adicionar 150 unidades de enzima β-1, 4 galactosyl transferases do leite bovino e incubar a mistura a 37 oC por 15 h.
    4. Depois de 15 h, realizar a cromatografia de camada fina (TLC) para indicar o consumo total de material começar manchando a mistura de reação em uma placa de TLC, desenvolvendo com n-butanol/ácido acético ácido/água (H2O) em 1:1:1 relação e coloração por um solução de molibdato de amónio de cério 0,25 M seguido de aquecimento. Em seguida, saciar a reação por aquecimento a 90 oC por 5 min.
    5. Centrifugue a mistura de reação a uma velocidade de 2.737 x g, durante 3 min e carregar o sobrenadante na parte superior da coluna de gel de poliacrilamida (ver Tabela de materiais). Eluir a coluna usando água destilada deionizada e recolher o produto com frações de 1 a 2 mL.
    6. Monitorar as fracções recolhidas por TLC26, desenvolvendo com n-butanol: H2o: ácido acético em um 1:1:1 ratio e a mancha com uma solução de molibdato de amónio cério, seguido de aquecimento. Lyophilize27 o produto contendo frações para obter 2 intermediário (115 mg, 86%) como pó branco. Caracteriza o produto por NMR28 e espectroscopia de massa29 (consulte o arquivo de dados suplementares).
  2. Preparação de 3 intermediário
    1. Pesar a partir de material 2 (mostrado na Figura 2, p-methoxyphenyl-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside (80mg, 0.122 mmol)) em um tubo de 15 mL e dissolvê-lo em Tris tampão (25 mM, pH 7,5) contendo MnCl2 (10 mM) para preparar uma concentração final de glicano de 5 mM.
    2. Adicione 2 equivalentes de sal dissódico de 5'-diphospho-β-L-fucose de guanosina (PIB-Fuc).
    3. Adicionar 150 unidades da enzima α-1, 3 sub-celular transferases de Helicobacter pylori (Hp1-3FTΔ26695) e incubar a mistura a 37 oC por 15 h.
    4. Siga o passo 1.1.4.
    5. Siga o passo 1.1.5.
    6. Siga o passo 1.1.6 para obter intermediário 3 (82 mg, 84%) como pó branco. Caracteriza o produto por NMR e espectroscopia de massa (ver arquivo de dados suplementares).
  3. Preparação dos módulos 4 e 5
    1. Pesar o composto 2,-methoxyphenyl-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside de de p(g 0,230, 0,360 mmol) ou composto 3, p- methoxyphenyl-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-[α-L-fucopyranosyl-(1→3)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-α-D-mannopyranoside (0,100 g, 0.125 mmol) em um balão de fundo redondo de single-pescoço de 25 mL e seco sob vácuo durante 30 min.
    2. Retirar o frasco do vácuo, preenchê-lo com gás nitrogênio, adicionar uma barra de agitação magnética, tampá-lo com um septo de borracha e anexar um balão de nitrogênio.
    3. Injete 7 mL de piridina seca e 3 mL de anidrido acético (Ac2O) o balão colocado em um banho de gelo a 0 oC. Stir a reação resultante para 12 h à temperatura ambiente utilizando um agitador magnético a 600-700 rpm. Evaporar os solventes usando uma giratória evaporador a uma pressão de vácuo de 0 - 10 mbar em 50 oC.
    4. Dilua a mistura crua com 30 mL de diclorometano (DCM) e extrair com hidrogenocarbonato de sódio aquosa saturada (NaHCO3) (2 x 20 mL) em um funil de separação de 50ml.
    5. Extrair novamente a fase aquosa com DCM (3 x 15 mL) e secar as camadas orgânicas combinadas sobre sulfato de sódio. Remover o sulfato de sódio por filtração e lave com DCM (5 mL). Evaporar o solvente usando um evaporador rotativo a 400 mbar vácuo pressão em 40 oC.
    6. Carrega a solução da mistura crua em 2 mL de DCM em cima da cama de sílica.
    7. Eluir a coluna com uma mistura contendo tolueno e acetona de 0 - 20% acetona em tolueno e coletar frações de 5-10 mL.
    8. Monitorar as fracções recolhidas por TLC (etapas 1.1.4 e 1.1.6), desenvolvendo com tolueno/acetona (7/3), e a mancha com uma solução de molibdato de amónio de cério seguido de aquecimento em uma chapa quente.
    9. Evapore o produto contendo frações usando um evaporador rotativo para obter produtos desejados como espuma branca em 72% e rendimento de 85%, respectivamente.
    10. Dissolver os produtos em 7 mL de acetonitrila: Tolueno: H2O em um 4: proporção de 2:1 em um balão de fundo redondo de 25 mL.
    11. Adicione nitrato de amônio cério (2 equivalentes) arrefecendo a 0 oC utilizando um banho de gelo. Misture a reação à temperatura ambiente por 3 h a ~ 500-800 rpm.
    12. Depois TLC indica o consumo total de material começar (TLC desenvolvendo com tolueno/acetona (7/3) e visualizando por absorbância UV para 254 nm ou pela coloração com uma solução de molibdato de amónio cério, seguido de aquecimento), diluir a mistura reacional com acetato de etila (30 mL) e o extrato com H2O (15 x 2 mL).
    13. Extrair as camadas orgânicas combinadas com 5 mL de solução saturada de cloreto de sódio (NaCl).
    14. Evaporar o solvente usando um evaporador rotativo a 240 mbar vácuo pressão em 40 oC.
    15. Carrega a solução do produto bruto em 2 mL de DCM em cima da cama de sílica. Eluir a coluna com uma mistura contendo tolueno e acetona (0 - 20% de acetona em tolueno) e coletar frações de 5-10 mL. Monitorar as fracções recolhidas por TLC, desenvolvendo com tolueno/acetona (7/3).
    16. Evapore as produto contendo frações usando um evaporador rotativo em 77 vácuo mbar e 40 oC para obter produtos desejados como espumas brancas.
    17. Dissolver os respectivos álcoois em 10 mL de DCM em um balão de fundo redondo de single-pescoço de 25 mL e frio de-30 oC.
    18. Adicione o trifluoreto de diethylaminosulfur (DAST, 2 equivalentes). Agite a mistura de reação no-30 oC por 2 h.
    19. Depois TLC indica o consumo de material começar (TLC desenvolvendo com tolueno/acetona (4/1) e visualizando por absorbância UV para 254 nm ou pela coloração com uma solução de molibdato de amónio cério, seguido de aquecimento), diluir a mistura reacional com DCM (30 mL) , e saturada de lavagem com NaHCO3 (15 x 2 mL).
    20. Extrair a camada orgânica combinada com 5 mL de solução saturada de NaCl, secá-lo com a adição de sulfato de magnésio anidro, filtrar a mistura após uma lavagem com DCM (5 mL) e recolhê-la para um balão de fundo redondo de single-pescoço de 100 mL.
    21. Evaporar o solvente usando um evaporador rotativo a 400 mbar vácuo pressão em 40 oC.
    22. Carrega a solução do produto bruto em 2 mL de DCM em cima da cama de sílica. Eluir a coluna com uma mistura de tolueno e acetona (0-20% de acetona em tolueno) e coletamos frações de 5-10 mL.
    23. Monitorar as fracções recolhidas por TLC, desenvolvendo com tolueno/acetona (7/3).
    24. Evaporar o produto contendo frações usando um evaporador rotativo para obter produtos desejados 4, [2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2--deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-3,4,6- O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl flúor (54% ao longo de 2 etapas) e 5, [2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[2,3,4-O-triacetyl-α-L--fucopyranosyl-(1→3)-3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)- Fluoreto de 3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl (67% a mais de 2 passos) como sólidos brancos.
    25. Caracteriza o produto por NMR e espectroscopia de massa (ver arquivo de dados suplementares).

2. preparação de glicano 10

  1. Preparação do intermidiate 7
    1. Pesar a prata trifluormetanosulfonato (AgOTf) (0,039 g, 0.155 mmol), bis(cyclopentadienyl)hafnium(IV) dicloreto (Cp2HfCl2) (0,041 g, 0.108 mmol) para um balão de fundo redondo de single-pescoço de 25 mL, secá-lo sob vácuo de schlenk linha por 30 min, removê-lo do a vácuo e preenchê-lo com gás nitrogênio.
    2. Transferir as recém secas 4 Å peneiras moleculares (0,2 g) para o frasco contendo o AgOTf e Cp2HfCl2, adicionar uma barra de agitação magnética, tampa com o septo imediatamente e adicionar um balão de nitrogênio.
    3. Transferi 3 mL de tolueno seco para o balão com uma seringa de vidro seco. Agitar a mistura de reação por 1h à temperatura ambiente e em seguida, refresque a 0 oC.
    4. Injetar uma solução de doador 4 (Figura 2, g 0,043, 0.046 mmol) e aceitador 6, 5-Azidopentyl-O-2-O-acetyl-4,6-O-benzylidine-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy) carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranoside (Figura 3, 0,045 g, 0,031 mmol) em 3 mL de tolueno a aferido através do septo, utilizando uma seringa de 10 mL em 0 o C. Agite a mistura de reação em temperatura ambiente por 3 h.
    5. Depois TLC indica o consumo de matérias-primas (TLC, desenvolvendo com DCM/acetona (8,5/1.5) e visualizando por absorbância UV para 254 nm ou pela coloração com uma solução de molibdato de amónio cério, seguido de aquecimento), saciar a reação por injectar 10 equivalentes de trietila amina.
    6. Filtrar as peneiras moleculares através de uma cama de celite para um balão de fundo redondo de 50 mL e ainda mais lavar com 10 mL de acetato de etilo. Extrair as camadas orgânicas combinadas com uma solução saturada de aquosa NaHCO3 (2 x 20 mL) em um funil de separação de 50ml. Extraia a fase aquosa com acetato de etila (3 x 15 mL).
    7. Extrair as camadas orgânicas combinadas com solução saturada de NaCl (5 mL), seque-o com o uso de sulfato de magnésio anidro, filtre a mistura para remover o sulfato de magnésio, lavar com acetato de etila (3 x 15 mL) e recolher o filtrado em um balão de fundo redondo de 100 mL.
    8. Evaporar o solvente usando um evaporador rotativo a 240 mbar vácuo pressão em 40 oC.
    9. Carrega a solução do produto bruto em DCM em cima da coluna de cama de sílica. Eluir a coluna com uma mistura contendo DCM e acetona (0-10% de acetona em DCM) e coletar frações de 5-10 mL.
    10. Monitore as fracções recolhidas por TLC, desenvolvendo com DCM/acetona (8,5/1.5). Evaporar as frações contendo o produto usando um evaporador rotativo para obter intermidiate 7, 5-Azidopentyl-O-{[2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-[ 3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl]}-(1→3)-[2-O-acetyl-4,6-O-benzylidine-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-( 2, 2,2-trichloroethoxy) carbonylamino-β-D-glucopiranósido (0,052 g, 70%), como a espuma branca.
    11. Caracteriza o produto por NMR e espectroscopia de massa (ver arquivo de dados suplementares).
  2. Preparação do intermidiate 8
    1. Um balão de fundo redondo de single-pescoço de 25 mL, pesar hexasaccharide 7 (Figura 3, 0,040 g, 0,016 mmol), secá-lo sob vácuo por 1h, removê-lo do vácuo, preenchê-lo com gás nitrogênio, adicionar uma barra de agitação magnética e tampá-lo com um septo de borracha.
    2. Transferi 3 mL de acetonitrile:methanol (MeOH) (proporção de 2:1) para o balão.
    3. Adicionar p-tolueno sulfônico mono-hidratado (0,001 g, 0,008 mmol) no balão de reacção e agitar a reação a 800 rpm por 5h.
    4. Depois TLC indica o consumo de material começar (TLC, desenvolvendo com DCM/acetona (8,5/1.5) e visualizando por absorbância UV para 254 nm ou pela coloração com uma solução de molibdato de amónio cério, seguido de aquecimento), saciar a reação por injectar 10 equivalentes de trietila amina.
    5. Evaporar o solvente usando um evaporador rotativo a 337 mbar vácuo pressão em 40 oC.
    6. Dissolver a mistura crua com cerca de 2 mL de DCM e carregá-lo em cima da cama de sílica.
    7. Eluir a coluna com uma mistura de DCM e acetona (0 - 10% de acetona em DCM) e coletamos frações de 5-10 mL. Monitore as fracções recolhidas por TLC, desenvolvendo com DCM/acetona (8,5/1.5). Evaporar o solvente com o evaporador rotativo 400 mbar aspirador e 40 oC.
    8. Secar o resíduo sob pressão reduzida para dar intermediário 8, 5-Azidopentyl-O-(2-O-acetyl-3,4,6-tri-O-benzyl-ced pressure to give →3)-2-O-acetil-4, 6-O-benzylidine-β - D - mannopyranosyl-(1→4) - O-(3,6- di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6 - di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-nzyl-2-deoxy-2-phth. (Figura 3, 0,022 g, 57%) como um sólido branco. Caracteriza o produto por NMR e espectroscopia de massa (ver arquivo de dados suplementares).
  3. Preparação do intermidiate 9
    1. Preparação do intermidiate 9 (Figura 3) foi realizada utilizando o doador 5 (0,015 g, 13.2 µmol) e aceitador 8 (Figura 3, 0,020 g, 8,80 µmol).
    2. AgOTf (0,011 g, 44,1 µmol) e Cp2HfCl2 (0,012 g, 30,8 µmol) foram usados como promotores de uma.
    3. Execute as etapas 2.1.1 a 2.1.10 para obter o intermediário 9, 5-Azidopentyl - O-{[2.3.4.6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-[3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl]} -(1→3)-{2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[2,3,4-O-triacetyl-α-LS160fucopyranosyl-(1→3)-3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl}-(1→6)-[2- O-acetyl-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-D-glucopyra (0.010 g, 34%), as espuma branca.
  4. Global desproteção do intermidiate
    1. Pesar o composto 9 (0,010 g, 2,9 µmol) para um balão de fundo redondo de single-pescoço de 25 mL, adicionar uma barra de agitação magnética, tampa com um septo de borracha e anexar um balão de nitrogênio.
    2. Transferência de 2 mL de 1, 4 dioxano: H2O (4:1) para o balão. Adicione o hidróxido de lítio (LiOH) (0,005 g, 50% por peso) para o balão. Agitar a mistura de reação em 90-100 oC por 12h e deixe-a esfriar no RT
    3. Evaporar os solventes usando um evaporador rotativo e secar o balão sob vácuo por 1h, preenchê-lo com nitrogênio, remova-o do tubo de vácuo e tampá-lo com um septo de borracha.
    4. Injetar o balão através do septo, usando uma seringa de 10 mL em 0 oC. agitar a mistura de reação para 12h em RT 4 mL de piridina seca e 2 mL de anidrido acético
    5. Evaporar os solventes usando um evaporador rotativo, a pressão de vácuo 0-10 mbar em 50 oC.
    6. Dissolver a mistura crua com 30 mL de DCM e extrair a solução saturada aquosa NaHCO3 (2 x 20 mL) em um funil de separação de 50ml.
    7. Extrair novamente a fase aquosa com DCM (3 x 15 mL). Evapore o solvente usando um evaporador rotativo.
    8. Carrega uma solução do produto em cerca de 2 mL de DCM em cima da cama de sílica C18. Eluir a coluna com uma mistura de água e metanol (0 - 100% de metanol em água) e coletar frações de 5-10 mL.
    9. Recolher as frações de produto e evaporar sob pressão reduzida para obter o produto desejado como espuma branca.
    10. Dissolver o produto em 5 mL de metanol seco em um 25 mL redonda balão de fundo e tampá-lo com um septo de borracha.
    11. Transferir 0,1 mL de metóxido de sódio (Almeida) em metanol e cool para 0 oC utilizando um banho de gelo e agitar a mistura por 12 h.
    12. Remover o solvente usando um evaporador rotativo e secagem do produto sob alto vácuo.
    13. Dissolver os produtos brutos em 5 mL de metanol: H2o: acético (6:3:1).
    14. Adicionar hidróxido de paládio (Pd(OH)2) (50% em peso) e agitar a reação sob atmosfera de hidrogênio usando um balão de hidrogênio para 15 h.
    15. A reação através de uma cama de celite do filtro e lave com 2 mL de metanol seguido de 2 mL de água de dd.
    16. Evapore os solventes usando um evaporador rotativo.
    17. Dissolver a mistura crua com aproximadamente 1 mL de água e carregá-lo em cima da cama de gel de poliacrilamida (ver Tabela de materiais). Eluir o produto com água e coletar frações de 1 a 2 mL.
    18. Monitorar as fracções recolhidas por TLC, desenvolver com n-butanol: H2o: acético (1:1:1).
    19. Recolher as frações de produto e lyophilize para obter o produto desejado 10, 5-Aminopentyl-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranosyl]-(1→3),-[β-D-galactopyranosyl-(1→4)-( α-L-fucopyranosyl-(1→3)-2-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-(1→2)-α-D-mannopyranosyl]-(1→6)-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside (0.002 g, 36%), as a pó branco.
    20. Caracteriza o produto por NMR e espectroscopia de massa (ver arquivo de dados suplementares).

3. preparação dos glicanos com cauda ácido fosfônico19,22

  1. Pesar o respectivo glicano (2-5 µmol) num balão de fundo redondo de 5 mL, adicionar uma barra de agitação magnética e tampá-lo com um septo de borracha.
  2. Transferência de 400 µ l de dimetilformamida recém seca.
  3. Adicionar [2 (2 (2 (bis (benzyloxy) fosforilo) etoxietoxi) carbonato de etila (2, 5-dioxopyrrolidin1-yl)] (10-25 µmol, preparado em casa) para a solução de glicano. Agite a mistura a 800 rpm por 5h.
  4. Evaporar os solventes usando um evaporador rotativo a 5-10 mbar vácuo pressão em 40 oC.
  5. Dissolver a mistura reacional em 0,5 mL de água e de carga na parte superior da cama gel de poliacrilamida (ver Tabela de materiais). Eluir o produto usando água e coletar frações de 1 a 2 mL.
  6. Monitore as fracções recolhidas por TLC26. Manchar a mistura de reação em uma placa de TLC e adicionar solução de mancha de molibdato de amónio de cério 0,25 M; Siga por aquecimento usando uma chapa quente. Recolher o produto contendo frações e lyophilize para obter o produto desejado como um pó branco.
  7. Dissolver o produto em 2 mL de água e adicionar o Pd (OH)2 (50% em peso). Misture a reação a 800 rpm sob atmosfera de hidrogênio usando um balão de hidrogênio para 15 h.
  8. A reação através de uma cama de fluxo-calcinado do filtro e lave com 2 mL de metanol seguido de 2 mL de água destilada deionizada. Evaporar os solventes usando um evaporador rotativo a 300 mbar vácuo pressão em 40 oC.
  9. Dissolver a mistura crua com aproximadamente 1 mL de água e carregá-lo em cima da cama de gel de poliacrilamida (ver Tabela de materiais).
  10. Eluir o produto com água e coletar frações de 1 a 2 mL. Monitore as fracções recolhidas por TLC26. Lyophilize as frações (congelar o produto usando nitrogênio líquido, em seguida, coloque em Liofilizador de vácuo) para obter o produto desejado como um pó branco. Caracteriza os produtos por NMR e espectroscopia de massa (ver arquivo de dados suplementares) usando D2O como solvente.

4. glicano matriz

  1. Preparação de alumínio revestido de lâminas de vidro (slide ACG) 19 , 20 , 22
    Nota: A fabricação dos slides vidro revestido de alumínio foi feita na divisão de tecnologia de película fina, centro de pesquisa de tecnologia de instrumento e nacional aplicada Research Laboratories, Hsinchu Science Park, Taiwan.
    1. Embalar corrediças revestidas, vácuo-seal-los para evitar a formação de NAO e manter fechado até a reação eletroquímica de superfície-anodização.
  2. Superfície anodização de alumínio revestido de lâminas de vidro 19 , 20 , 22
    1. Definir a incubadora com temperatura controlada a 4 ° C. Preparar a solução aquosa de ácido oxálico de 0,3 M e mantê-lo em um banho de gelo. Pegue o copo de 500 mL, adicionar uma barra de agitador magnético.
    2. Transferir o ácido oxálico 0,3 M para o copo de 500 mL e em seguida, coloque uma haste 10cm longo platina como um cátodo na solução. Continue mexendo (com 300 rpm), o ácido oxálico durante todo o processo de anodização.
    3. Gire sobre o software de rastreamento de laboratório, clique sobre o botão "configurar" depois "função tensão de varredura escolha." Definir o início e parar de tensão para 25,8 V, número de pontos para 100, conformidade a 1 e varrer o atraso para 1.200 ms e clique em "okey".
    4. Grampo do vidro revestido de alumínio lado voltado para o cátodo. Clica no botão "executar teste". Observe a medição de corrente (mA ~ 8-10).
    5. Após anodização de superfície, lavar o deslize cuidadosamente com água bidestilada, purgar seco com gás nitrogênio e em seguida, armazenar em uma câmara de umidade relativa de 30% até nova utilização.
  3. Fabricação de ACG glicano microarray 22
    1. Prepare-se 100 µ l de todos os glicanos monovalentes (I-XI) em etileno glicol na concentração de 10 mM individualmente.
    2. Dilua o glicano acima com buffer de impressão (80% etilenoglicol e 20% água deionizada) para fazer a concentração de 100 µM.
    3. Para estudo de hetero-ligante, preparar 5 µ l de cada XI os glicanos e a cada um, adicione 5 µ l do homem5GlcNAc2 (proporção de 1:1).
    4. Microarrays impressão por robótico pin (ver Tabela de materiais) pela deposição de 0,6 nL dos glicanos previamente preparados para ACG slides31.
    5. Armazene os slides impressos em uma caixa seca umidade controlada antes do ensaio.
  4. Mapeamento de glicano epitopos de HIV-1 anticorpos neutralizantes amplamente PG9 22
    1. Prepare-se 1 mL BSA contido tampão PBST, 3% w/v.
    2. Preparar a 70 µ l de PG9 (50 µ g/mL) em tampão PBST (BSA contido tampão PBST, 3% p/v).
    3. Prepare-se 120 µ l de anticorpo secundário fluorescente marca burro IgG anti-humano (Alexa Fluor 647 conjugados) 50 µ g/mL de tampão PBST (BSA contido tampão PBST, 3% p/v) no escuro.
    4. Misture o anticorpo primário (PG9) e anticorpo secundário etiqueta fluorescente na proporção de 1:1 (60 µ l cada). Incube pré-misturado anticorpos durante 30 min a 4 ° C.
    5. Carrega o slide ACG na câmara de incubação de slide que é dividida em 16 poços. Transferir 100 µ l de anticorpos pré-misturados à matriz glicano e incubar a 4 ° C, durante 16 h.
    6. Pipetar para anticorpos pré-misturados. Remova a câmara de incubação do slide.
    7. Primeiro, lave o slide em tampão PBST (PBS e 0,05% Tween-20), seguido por água deionizada e rotação seca a 2.000 x g.
    8. Abra o software de análise de imagem de microarray (ver Tabela de materiais). Inserir um slide com as características de matriz virado para baixo.
    9. Clique no menu "configurações", definir a resolução de imagem de 5 µm por pixel e o comprimento de onda de 635 nm com PMT450 e poder de 100%.
    10. Clique sobre o botão "scan" para iniciar o slide de imagem.
    11. Clique no ícone de "arquivo" para salvar a imagem de varredura em formato tif.
    12. Realizar análise de imagem, seguindo guia32 do utilizador do software.
    13. Calcular a intensidade total da fluorescência e ilustram usando software33 de processamento de imagem (consulte a Tabela de materiais).
      Nota: Aqui, a percentagem média de erro para todos os pontos de dados é apresentado por barras de erro.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uma estratégia modular de quimio-enzimático para a síntese de um vasto leque de N-os glicanos é apresentada na Figura 1. A estratégia é baseado no fato de que a diversidade pode ser criada no início por quimioterapia-enzimático síntese dos três módulos importantes, seguido pelo mannosylation α-específicos para o 3-O e/ou 6-Ó posição do resíduo manose do comum núcleo trissacarídeo de N- os glicanos. Considerando a diversidad...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uma classe de bNAbs de HIV-1, incluindo PG9 e PG16 PGTs 128, 141-145 foram relatados para ser altamente potente para neutralizar a 70-80% de isolados de HIV-1 em circulação. Os epítopos destes bNAbs são altamente conservados entre as variantes de todo o grupo HIV-1 M, portanto eles podem guiar o projeto de immunogen eficaz para uma vacina contra o HIV eliciar neutralizando anticorpos23,24,25 . Como parte dos nossos esforços em c...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores graças a divisão de tecnologia de película fina, centro de pesquisa de tecnologia de instrumento (ITRC) e nacional aplicada Research Laboratories, Hsinchu Science Park, Taiwan. Este trabalho foi financiado pelo Conselho Nacional de ciência (conceder n. A maioria dos 105-0210-01-13-01) e Academia Sinica.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Ácido acéticoSigma Aldrich64197
AcetonitrilaSigma Aldrich75058
Anidrido acéticoSigma Aldrich108247
Sulfato de magnésio anidroSigma Aldrich7487889
Trifluoreto de boro etéreo etílicoSigma Aldrich109637
Albumina de soro bovinoSigma Aldrich9048468
Bio-Gel P2 poliacrilamidaBio-Rad1504118
Dicloreto de bis(ciclopentadienil)háfnio(IV)Sigma Aldrich12116664
β-1, 4 Galactosyl transferases de leite bovinoTecnologia Sigma Aldrich48279
BioDot Cartesion com pino robótico SMP3 (Stealth Micro Spotting Pins)Arrayit
Molibdato de cério e amônioTCIC1794
Nitrato de cério e amônioSigma Aldrich16774213
Lâmina de vidro limpa Schott 
Ácido citidina-5-monofosfo-N-acetilneuramínicoSigma Aldrich3063716
Clorofórmio deuteradoSigma Aldrich865496
burro anti-humano IgG (Alexa Fluor647 conjugadoJackson Immuno Research, EUA709605098
DiclorometanoSigma Aldrich75092
Trifluoreto de dietilaminoenxofreSigma Aldrich38078090
DimetilformamidaSigma Aldrich68122
Acetato de etilaSigma Aldrich141786
EtilenoglicolAcros Câmaras de
Sigma Aldrich
Guanosine 5'- sal dissódico de difosfo-b-L-fucose;Software Sigma Aldrich15839700
Lab tracer 2.0Seção 4 do Protocolo
GenePix Pro 4300A leitor (análise de imagem de microarray)dispositivos moleculareswww.moleculardevices.com
GraphPad Prism Software (processamento de imagem)GraphPad Software, Inchttp://www.graphpad.com/guides/prism/6/user-guide/
hidróxido de lítioSigma Aldrich1310652
cloreto de manganêsSigma Aldrich7773015
MetanolSigma Aldrich67561
N-butanolSigma Aldrich71363
Ácido oxálicoAcros Orgânico144627
Hidróxido de paládioSigma Aldrich12135227
Phosphate Buffered SalineThermo Fisher Scientific 
PiridinaSigma Aldrich110861
Ácido sulfônico P-tolueno monohidratadoSigma Aldrich773476
Triflato de prataSigma Aldrich2923286
Bicarbonato de sódioSigma Aldrich144558
Cloreto de sódioSigma Aldrich7647145
Sódio carbonato de hidrogênioSigma Aldrich144558
Metóxido de sódio Sigma Aldrich124414
Sulfato de sódioSigma Aldrich7757826
Tolueno Sigma Aldrich108883
Tris buffer AmrescoN/AGrau ultrapuro
Tween-20Amresco9005645
Uridina difosfato galactose (UDP-galactose)Sigma Aldrich137868521
incubação de slides de quadro FAST de 107211 orgânica10010023

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kim, P. J., Lee, D. Y., Jeong, H. Centralized modularity of N-linked glycosylation pathways in mammalian cells. PloS one. 4, e7317(2009).
  2. Townsley, S., Li, Y., Kozyrev, Y., Cleveland, B., Hu, S. L. Conserved Role of an N-Linked Glycan on the Surface Antigen of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Modulating Virus Sensitivity to Broadly Neutralizing Antibodies Against the Receptor and Coreceptor Binding Sites. J.virol. 90, 829-841 (2015).
  3. Wang, Z., et al. A General Strategy for the Chemoenzymatic Synthesis of Asymmetrically Branched N-Glycans. Science. 341, 379-383 (2013).
  4. Li, L., et al. Efficient Chemoenzymatic Synthesis of an N-glycan Isomer Library. Chem Sci. 6, 5652-5661 (2015).
  5. Pritchard, L. K., Harvey, D. J., Bonomelli, C., Crispin, M., Doores, K. J. Cell- and Protein-Directed Glycosylation of Native Cleaved HIV-1 Envelope. J.Virol. 89, 8932-8944 (2015).
  6. Behrens, A. J., et al. Composition and Antigenic Effects of Individual Glycan Sites of a Trimeric HIV-1 Envelope Glycoprotein. Cell Rep. 14, 2695-2706 (2016).
  7. Barouch, D. H. Challenges in the development of an HIV-1 vaccine. Nature. 455, 613-619 (2008).
  8. Horiya, S., MacPherson, I. S., Krauss, I. J. Recent Strategies Targeting HIV Glycans in Vaccine Design. Nat Chem Bio. 10, 990-999 (2014).
  9. Wang, L. X. Synthetic carbohydrate Antigens for HIV Vaccine Design. Curr Opin Chem Biol. 17, 997-1005 (2013).
  10. Tian, J., et al. Effect of Glycosylation on an Immunodominant Region in the V1V2 Variable Domain of the HIV-1 Envelope gp120 Protein. PLoS Comput Biol. 12, e1005094(2016).
  11. Geyer, H., Holschbach, C., Hunsmann, G., Schneider, J. Carbohydrates of human Immunodeficiency Virus. Structures of Oligosaccharides Linked to the Envelope Glycoprotein 120. The J Bio Chem. 263, 11760-11767 (1988).
  12. Lee, J. H., Ozorowski, G., Ward, A. B. Cryo-EM Structure of A Native, Fully Glycosylated, Cleaved HIV-1 Envelope Trimer. Science. 351, 1043-1048 (2016).
  13. Lonardi, E., Balog, C. I., Deelder, A. M., Wuhrer, M. Natural GlycanMicroarrays. Expert Rev Proteomics. 7, 761-774 (2010).
  14. Paulson, J. C., Blixt, O., Collins, B. E. Sweet Spots in Functional Glycomics. Nat. Chem. Bio. 2, 238-248 (2006).
  15. Dotsey, E. Y., et al. A High Throughput Protein Microarray Approach to Classify HIV Monoclonal Antibodies and Variant Antigens. PLoS One. 10, e0125581(2015).
  16. Wu, C. Y., Liang, P. H., Wong, C. H. New Development of Glycan Arrays. Org Biomol Chem. 7, 2247-2254 (2009).
  17. Scurr, D. J., et al. Surface Characterization of Carbohydrate Microarrays. Langmuir. 26, 17143-17155 (2010).
  18. Blixt, O., et al. Printed Covalent Glycan Array for Ligand Profiling of Diverse Glycan Binding Proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 17033-17038 (2004).
  19. Chang, S. H., et al. Glycan Array on Aluminum Oxide-Coated Glass Slides Through Phosphonate Chemistry. J. Am. Chem. Soc. 132, 13371-13380 (2010).
  20. Tseng, S. Y., et al. Preparation of Aluminum Oxide-Coated Glass Slides for Glycan Microarrays. ACS Omega. 1, 773-783 (2016).
  21. Shivatare, S. S., et al. Efficient Convergent Synthesis of Bi-, Tri-, and Tetra-Antennary Complex Type N-Glycans and Their HIV-1 Antigenicity. J. Am. Chem. Soc. 135, 15382-15391 (2013).
  22. Shivatare, S. S., et al. Modular synthesis of N-Glycans and Arrays for the Hetero-Ligand Binding Analysis of HIV Antibodies. Nat Chem. 8, 338-346 (2016).
  23. McLellan, J. S., et al. Structure of Hiv-1 gp120 V1/V2 Domain with Broadly Neutralizing Antibody PG9. Nature. 480, 336-343 (2011).
  24. Julien, J. P., et al. Asymmetric Recognition of the HIV-1 Trimer by Broadly Neutralizing Antibody PG9. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 4351-4356 (2013).
  25. Willis, J. R., et al. Long Antibody HCDR3s from HIV-Native Donors Presented on a PG9 Neutralizing Antibody Background Mediate HIV Neutralization. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 4446-4451 (2016).
  26. JoVE Science Education Database. Essentials of Organic Chemistry. Performing 1D Thin Layer Chromatography. JoVE. , Cambridge, MA. (2017).
  27. de Castro, M. D., et al. A useful approach to the automation of analytical processes? J Automat Chem. 12, 267-279 (1990).
  28. JoVE Science Education Database. Essentials of Organic Chemistry. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy. JoVE. , Cambridge, MA. (2017).
  29. JoVE Science Education Database. Essentials of Analytical Chemistry. Introduction to Mass Spectrometry. JoVE. , Cambridge, MA. (2017).
  30. Tseng, S. Y., et al. Preparation of Aluminum Oxide-Coated Glass Slides for Glycan Microarrays. ACS Omega. 1 (5), 773-783 (2016).
  31. Blixt, O., et al. Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 17033-17038 (2004).
  32. GenePix Pro 6.0 Microarray Acquisition and Analysis Software for GenePix Microarray Scanners User’s Guide & Tutorial. , Axon Instruments/ Molecular Devices Corp. Sunnyvale, CA. (2017).
  33. GraphPad Prism version 6.01 for Windows. GraphPad Software. , La Jolla California USA. Available from: http://www.graphpad.com/guides/prism/6/user-guide/ (2017).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

N glycan ArrayGlycan MicroarrayAluminum Oxide GlassHeteroligand BindingPG9 AntibodyMass SpectrometrySurface AnodizationGlycan Synthesis

Artigos relacionados