Medindo a endocitose da vesícula sináptica nos neurônios Hippocampal culturas

Resumo

Endocitose da vesícula sináptica é detectada pela microscopia de luz de pHluorin fundido com proteínas de vesículas sinápticas e por microscopia eletrônica de absorção da vesícula.

Resumo

Durante a endocitose, fundidas vesículas sinápticas são recuperadas em terminais nervosos, permitindo a reciclagem de vesículas e, portanto, a manutenção da transmissão sináptica durante o disparo repetitivo do nervo. Endocitose prejudicada em condições patológicas leva a diminuições em funções sinápticas de força e cérebro. Aqui, descrevemos os métodos utilizados para medir a endocitose da vesícula sináptica na sinapse hippocampal mamífera na cultura neuronal. Temos monitorado endocitose de proteínas de vesícula sináptica pela fusão de uma proteína de membrana vesicular sináptica, incluindo Sinaptofisina e VAMP2/synaptobrevin da, o lado lumenal vesicular, com pHluorin, uma proteína fluorescente verde sensíveis ao pH que aumenta sua intensidade de fluorescência como o pH aumenta. Durante a exocitose, pH do lúmen vesicular aumenta, Considerando que durante o lúmen vesicular endocitose pH é re-acidificado. Assim, um aumento da intensidade de fluorescência pHluorin indica fusão, enquanto uma diminuição indica endocitose da proteína rotulados vesícula sináptica. Além de usar o pHluorin método de imagem para gravar endocitose, temos monitorado endocitose da membrana vesicular por microscopia de elétron (EM) medições de absorção de Horseradish peroxidase (HRP) por vesículas. Finalmente, temos monitorado a formação dos poços de membrana terminal do nervo em vários momentos após a despolarização induzida por potássio alto. O tempo de curso de formação de poço de captação e membrana HRP indica o tempo de curso de endocitose.

Introdução

Os neurotransmissores são armazenados em vesículas sinápticas e liberados por exocitose. A membrana da vesícula sináptica e a proteína são então internalizadas por endocitose e reutilizadas na próxima rodada de exocitose. Endocitose das vesículas sinápticas é importante para a manutenção de piscinas de vesícula sináptica e remove salientes vesículas de membrana plasmática. O pHluorin sensíveis ao pH proteína verde fluorescente, que é saciada em circunstâncias ácidas e dequenched em pH neutro, tem sido usado para medir tempo de endocitose cursos em vivem células^1,2,3. A proteí....

Protocolo

Nota: O seguinte protocolo descreve os métodos de imagem pHluorin e métodos EM neurônios hippocampal culta. pHluorin monitores vesícula sináptica proteína absorção em células vivas e EM detecta a absorção da vesícula sináptica e as alterações ultra-estruturais.

cuidados com animais e procedimento seguiu as diretrizes do NIH e foram aprovados pelo Comitê de uso e cuidados do Animal NIH.

1. pHluorin Imaging

1. cultura neurônio Hippocampal
   1. preparar hipocampo Buffer (HB) combinando NaHCO ₃ de 4 mM e 5 mM HEPES e ajustar o pH 7.3 com 5 M de NaOH. Fazer o meio de cultura mi....

Resultados

Usando o método de transportadora de lipídios, SpH foi expressa em neurônios hippocampal, permitindo a identificação de boutons (Figura 1a). Estimulação elétrica das células induzidas por exocitose e um correspondente aumento na intensidade de fluorescência. O aumento na fluorescência (ΔF) foi interrompido por encerrar o estímulo (Figura 1b). O aumento da fluorescência foi seguido por uma diminuição lenta, devido a endocitose. No.......

Discussão

Aqui demonstramos dois métodos para monitorar a endocitose da vesícula sináptica. O primeiro método, temos monitorado pHluorin fundiu-se com uma proteína de vesícula sináptica nos neurônios transfectadas e posteriormente eletricamente estimulado. Em segundo lugar, usamos EM imagem latente de captação HRP como induzida por KCl. Usamos diferentes estímulos por duas razões. Primeiro, aplicação elevada de potássio induz a despolarização dos neurônios todos na cultura. Isso facilita o exame EM, dado que a nossa metodologia EM.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Lipofectamina LTX com Plus	Thermo Fisher	15338-100	Transfecção de DNA plasmidial incluindo sinaptofisina ou VAMP2-pHluorin
meio neurobasal	Thermo Fisher	21103-049	Meio de crescimento para neurônio, Aqueça até 37° C antes do uso
B27	Thermo Fisher	17504-044	Gradiente para diferenciação neuronal
Glutamax	Thermo Fisher	35050-061	Gradiente para cultura neuronal
lamínula revestida com poli-D-lisina	Neuvitro	GG-25-pdl	Substrato para crescimento neuronal e imagem de pHluorina
Tripsina XI do pâncreas bovino	Sigma	T1005	Neuronal tecidos hipocampais digeridos por cultura
Desoxirribonuclease I do pâncreas bovino	Sigma	D5025	suspensão de células viscosas
inibição	A-M modelo	2100	Aplicar estimulação elétrica
Banho com fenda com estimulação de campo	Warner Instruments	RC-21BRFS
	de isolamento de estímulo de estimulação elétricaWarner Instruments	SIU102	Aplique
lubrificante	Dow corning	111	pHluorin imaging-seal com lamínula e câmara de imagem, evite vazamento da câmara
AP5	Tocris	3693	Gradiente para solução salina normal, antagonista seletivo do receptor NMDA, inibe a atividade pós-sináptica que tem potencial para atividade recorrente
CNQX	Tocris	190	Gradiente para solução salina normal, antagonista competitivo do receptor AMPA/cainato, inibe a atividade pós-sináptica que tem potencial para atividade recorrente
Iluminador	Nikon	C-HGFI	Fonte de luz de iodetos metálicos para câmera pHluorin
EMCCD	Andor	iXon3	imagens de pHluorin, detecção de intensidade de fluorescência pHluorin
Microscopia invertida	Nikon	Ti-E	Imagiologia para sinaptofisina ou células transfectadas com pHluorina VAMP2
NIS-Elements AR	Nikon	NIS-Elements Software de pesquisa avançada	para aquisição e análise de imagens
Igor Pro	WaveMetrics	Igor pro	Software para análise de imagens e apresentação de dados
câmara de imagem	Warner Instruments	RC21B	pHluorin imaging, aplicar estimulação de campo em células vivas
poli-l-lisina	Sigma	P4832	Microscopia eletrônica, substrato para crescimento neuronal, aplicar em placa multipoços por 1 h à temperatura ambiente e depois lavar com água esterilizada 3 vezes
Peroxidase de rábano (HRP)	Sigma	P6782	Microscopia eletrônica, marcação de vesículas sinápticas endocitadas catalisando DAB na presença de peróxido de hidrogênio, concentração final é de 5 mg / mL em solução salina normal, fazer fresco antes do uso
Cacodilato	de NaMicroscopia eletrônica Sciences	12300	Microscopia eletrônica, tampão para fixadores e lavagem, concentração final é 0,1 N
3,3′-Diaminobenzidina(DAB)	Sigma	D8001	Microscopia eletrônica, marcação de vesículas sinápticas endocitadas, substrato para HRP, concentração final é de 0,5 mg/mL em DDW e filtrada, fazer fresco antes
do uso Solução de peróxido de hidrogênio	Sigma	H1009	Microscopia eletrônica, marcação de vesículas sinápticas endocitadas induzindo a reação HRP-DAB, a concentração final é de 0,3% em DDW, faça fresco antes
de usar glutaraldeído	Microscopia Eletrônica Ciências	16365	Microscopia eletrônica, fixadores, concentração final é de 4% em tampão Na-cacodilato, faça fresco antes de usar, agite bem antes de usar
TEM	JEOL	200CX	Microscopia eletrônica, imagem de vesículas endocitadas e alterações ultraestruturais
Câmera digital CCD	AMT	XR-100	Microscopia eletrônica, captura de imagens
Citrato de chumbo	Leica microssistemas	16707235	Microscopia eletrônica, coloração de grade

Estimulador de pulso de com de cultura neuronal Aplicar unidade de estimulação elétrica