Summary
In questo metodo, usiamo fotopolimerizzazione e tecniche di chimica clicca per creare modelli di proteina o peptide sulla superficie di idrogeli di polietilenglicole (PEG), fornendo immobilizzata bioattivi segnali per lo studio delle risposte cellulari in vitro .
Abstract
Ci sono molti stimoli biologici che possono influenzare la differenziazione delle cellule staminali e comportamento delle cellule. Cellulari generali cultura approcci si basano su fattori solubili all'interno del mezzo per controllare il comportamento delle cellule. Tuttavia, aggiunte solubile non possono simulare alcuni motivi, come fattori di crescita associati a matrice di segnalazione, segnalazione della cellula-cellula e spaziale segnali biochimici, che sono comuni influenze sulle cellule. Inoltre, le proprietà biofisiche della matrice, come ad esempio la rigidità del substrato, svolgono i ruoli importanti nel destino della cellula, che non è facilmente manipolata utilizzando pratiche di coltura convenzionale della cella. In questo metodo, descriviamo un protocollo semplice per fornire proteine bioattive modellati su idrogel sintetico in polietilene glicole (spina) utilizzando fotochimica. Questa piattaforma permette il controllo indipendente della rigidità del substrato e spaziale segnali biochimici. Questi idrogeli possono realizzare una vasta gamma di valori di rigidità fisiologicamente rilevanti. Inoltre, le superfici di questi idrogeli possono essere photopatterned con peptidi bioattivi o proteine via tiolo-ene clicca chimica reazioni. Questi metodi sono stati ottimizzati per conservare la funzione della proteina dopo immobilizzazione superficiale. Si tratta di un protocollo versatile che può essere applicato a qualsiasi proteina o peptide di interesse per creare una varietà di modelli. Infine, cellule seminate sulle superfici di questi idrogeli bioattivi possono essere monitorate nel tempo come rispondono ai segnali nello spazio specifici.
Introduction
Ci sono molti stimoli che influenzano il comportamento delle cellule. In generale, tecniche di coltura tipica cellula si basano su fattori solubili di suscitare risposte cellulari; Tuttavia, ci sono limitazioni di questo approccio. Questi metodi sono in grado di visualizzare con precisione tutti i motivi di segnalazione comunemente trovati in vivo. Tali meccanismi di segnalazione includono sequestrati fattori di crescita, segnalazione della cellula-cellula e spazialmente specifici segnali biochimici. Inoltre, rigidità del substrato può giocare un ruolo importante nel differenziamento delle cellule staminali e comportamento cellulare e non è facilmente manipolata utilizzando comuni pratiche coltura cellulare1,2. Biomateriale approcci offrono una nuova piattaforma per cominciare ad esplorare questi meccanismi di segnalazione. In particolare, idrogeli sono candidati eccellenti per ottimizzazione substrato rigidità3,4, immobilizzante proteine e peptidi5,6e la creazione di modelli spazialmente specifici7, 8.
Idrogeli sono comunemente usati come impalcature in ingegneria tissutale a causa loro commonalities biofisica e biochimica con la matrice extracellulare (ECM)9,10. Polimeri naturali sono scelte comuni per ponteggi, in quanto sono biocompatibili e si trovano in molti tessuti del corpo. La limitazione dell'utilizzo di polimeri naturali come substrati è che mancano moiety chimica facilmente manipolabile per bioconjugation. D'altra parte, idrogel sintetico, in quanto tale come PEG, sono eccellenti piattaforme per prodotti chimici mirati per11,12. Inoltre, idrogeli PEG non suscitare una risposta cellulare e pertanto vengono utilizzati come backbone di inerte per la creazione di strutture bioattive.
Per creare idrogeli bioattivi, fotopolimerizzazione sia del tiolo-ene scegliere chimica reazioni sono impiegate. Questi FOTOREAZIONI richiedono un fotoiniziatore e una sorgente di luce UV. Quando fotoiniziatori vengono introdotti ai raggi UV, obbligazioni rompono per formare i radicali. Tesi i radicali sono necessari per avviare la reazione ma possono influire negativamente sulle proteine bioattività12,13. Di conseguenza, è fondamentale ottimizzare fotoiniziatore e tempi di esposizione UV per mantenere la bioattività di proteina.
In questo metodo, idrogeli sono sintetizzati attraverso acrilato-acrilato catena crescita fotopolimerizzazione. PEG-Diacrilato (PEGDA) monomeri reagiscono con a vicenda per formare reti di polimero ramificato responsabile della struttura dell'idrogel. La concentrazione dei monomeri PEGDA all'interno della soluzione di precursore di gel controllerà la rigidità del substrato. Dovuto la piccola dimensione dell'idrogel dei pori, proteine ECM come fibronectina possono essere facilmente incorporate all'interno di idrogel ai fini del collegamento delle cellule. Infine, questi idrogeli possono essere a superficie-fantasia con peptidi bioattivi o proteine via tiolo-ene clicca chimica reazioni. Qui, acrilati non reagiti gratuiti all'interno del sistema di idrogel reagirà con tioli gratuiti situati sulla proteina o peptide quando esposto a luce UV. Dopo le proteine o peptidi sono immobilizzati sulla superficie dell'idrogelo, l'idrogel possono essere memorizzati a 4 ° C per diverse settimane senza perdere la bioattività. Questo offre convenienza, flessibile pianificazione sperimentale e la possibilità di collaborazione tra i laboratori. Nel complesso, questa piattaforma permette di controllo biochimico biomeccanico e spaziale, indipendente uno da altro, per l'opportunità di influenzare il comportamento cellulare.
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Protocol
1. preparazione dei materiali per la sintesi dell'idrogelo
- preparare soluzioni di riserva di PEGDA, litio fenil-2, 4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) e fibronectina in condizioni sterili e basato su calcoli (tabella 1A).
- Pesare e sciogliere composti in tampone fosfato salino (PBS). In genere, mantenere PEGDA lavorando le concentrazioni di soluzione tra 50 e 200 mg/mL (5-20% peso/volume). Dispensare la soluzione PEGDA attraverso un filtro da 0,22 µm a siringa per la sterilizzazione.
Nota: Mantenere le soluzioni PEGDA coperte con un foglio di avvolgimento per proteggerli dalla luce. Preparare una soluzione fresca di PEGDA (consigliato) per ogni esperimento.
Polvere di - ricostituire fibronectina proteina basata sul produttore ' s raccomandazione. Mantenere la soluzione di riserva di fibronectina a 1 mg/mL, aliquotare e in aliquote di 60 a 100 µ l e conservarli a-20 ° C fino all'utilizzo. Scongelare le aliquote a 4 ° C per diverse ore o durante la notte prima dell'uso. Se Stock in proteine non viene già fornita in condizioni sterili, utilizzare un filtro per siringa da 0,22 µm per la sterilizzazione.
Nota: Fibronectina è utilizzata per il collegamento delle cellule. Altre proteine ECM possono essere sostituito con. - Pesare LAP per la soluzione di riserva e dissolverlo in PBS; una tipica concentrazione stock è 25 mg/mL. Sonicare se c'è qualche problema con dissoluzione. Filtrare la soluzione attraverso un filtro di 0,22 µm per la sterilizzazione. Percorrere il giro con un involucro di stagnola e conservarlo a 4 ° C per fino a parecchi mesi.
Nota: LAP è il fotoiniziatore utilizzato per la fotochimica.
- Pesare e sciogliere composti in tampone fosfato salino (PBS). In genere, mantenere PEGDA lavorando le concentrazioni di soluzione tra 50 e 200 mg/mL (5-20% peso/volume). Dispensare la soluzione PEGDA attraverso un filtro da 0,22 µm a siringa per la sterilizzazione.
- Preparare stampi diapositiva vetro sterile per formazione di idrogel.
- Autoclave un poliestere foglio; uno è necessario per ogni stampo di gel. Immergere due lastre di vetro e tre distanziali in plastica (0,5 mm di spessore) per ogni stampo di gel in etanolo al 70% per almeno 2 ore, ma generalmente di lasciarli in ammollo durante la notte. Ammollo cinque clip legante per ogni stampo di gel in etanolo al 70% per 10 minuti prima dell'uso.
- Posizionare i vetrini, distanziali e raccoglitore Clip su un piccolo foglio sterilizzato nell'autoclave della cappa di cultura cellulare per consentire loro di aria secca per diverse ore.
- Preparazione stampi di idrogel inserendo distanziali in plastica intorno al bordo del vetrino. Posizionare la seconda diapositiva di vetro sulla parte superiore. Fissare i distanziali strettamente uno accanto a altro con clip legante, due su ogni lato lungo e quello in alto.
Nota: Se questo non è montato correttamente, la soluzione di gel colerà. - Superficie-sterilizzare lo stampo con coltura cellulare cappa luce UV per 30 min prima dell'uso. A metà strada attraverso, capovolgere lo stampo per esporre entrambe le superfici.
2. Modificare le proteine con un tiolo gratis
- preparare soluzioni di riserva utilizzando calcoli dal foglio di calcolo per la conversione dell'ammina in tiolo sulle proteine (tabella 1A).
- a fare il tampone di reazione, regolare il PBS a pH 8 e aggiungere 5 mM EDTA. Tampone di reazione della pipetta in un filtro per siringa da 0,22 µm per la sterilizzazione.
Nota: EDTA è importante, in quanto protegge i tioli da formando legami bisolfurico. Gruppi tiolici devono rimanere nella loro forma ridotta per la reazione avvenga. - Pesare 2-Iminotiolano (Traut ' s reagente) e dissolverlo in tampone di reazione per una concentrazione di soluzione stock di 2 mg/mL (14 mM). Filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,22 µm a siringa per la sterilizzazione. Conservare la soluzione di riserva a 4 ° C per fino a parecchi mesi.
Nota: 2-Iminotiolano è la molecola che reagisce con le ammine gratis esposte al solvente sulle proteine e li converte in tioli liberi. - Ricostituire la proteina nel tampone di reazione ad una concentrazione compresa tra 0,1 e 1 mg/mL. A meno che precedentemente sterile, pipettare questa soluzione attraverso un filtro da 0,22 µm a siringa per la sterilizzazione.
Nota: Questa proteina è il segnale biochimico che verrà essere modellato sulla superficie di idrogel. Inoltre, mentre le concentrazioni di proteina possono variare, concentrazioni più elevate sono ideali per più forte pattern proteico.
- a fare il tampone di reazione, regolare il PBS a pH 8 e aggiungere 5 mM EDTA. Tampone di reazione della pipetta in un filtro per siringa da 0,22 µm per la sterilizzazione.
- Reagire la proteina con 2-Iminotiolano mescolando insieme entrambe le soluzioni stock; utilizzare tabella 1B per calcolare il rapporto di volume corretto. In genere, utilizza un rapporto molare di 8:1 2-Iminotiolano alla proteina.
Nota: Per i più grandi proteine o più diluire le concentrazioni, utilizzare un rapporto molare superiore di 2-Iminotiolano. Consultare il produttore ' s protocollo 15. - Incubare la reazione per 1 h a temperatura ambiente. Utilizzare una dissalazione spin micro-colonna per rimuovere il prodotto della proteina chitosani da reagenti restanti, seguendo il produttore ' s protocollo 16.
Nota: Il limite di esclusione di questa resina è 5 KDa. - Uso Ellman ' s saggio misurare quantitativamente il numero dei tioli liberi per proteina. Seguire il produttore ' protocollo di s per il dosaggio 17.
3. Formazione di idrogel
- Crea la soluzione del precursore di gel basata su valori calcolati da tabella 1. Mescolare insieme la PEGDA, fibronectina e volumi LAP. Dispensare la soluzione vigorosamente per garantire una soluzione omogenea, ma evitare la creazione di bolle. Mantenere la soluzione al riparo dalla luce.
- Dispensare la soluzione di gel precursore attentamente tra i due vetrini dello stampo gel. In genere, aggiungere un volume tra 800 e 1.000 µ l allo stampo. Esporre la soluzione di gel nello stampo a luce UV (lunghezza d'onda: 365 nm, potenza: 3-4 mW/cm 2) per 1-2 min formare l'idrogel.
Nota: Non esporre l'idrogel a luce UV prolungata, come si limiterà la proteina di superficie patterning funzionalità. - Togliere la clip legante e rimuovere delicatamente il vetrino superiore applicando pressione di fronte ai distanziali due lato.
- Utilizzare un pugno di dimensioni appropriate biopsia per tagliare fuori i campioni di idrogel. Punch out più idrogeli dal rettangolo di gel per servire come repliche e campioni di controllo.
4. Misure di rigidezza di idrogel
punch di biopsia- Punch out idrogel con un 8 mm di diametro per un reometro di piatti paralleli di 8 mm. Caricare un idrogel campione in reometro (Vedi la Tabella materiali).
- Inferiore la geometria di piatti paralleli che è 8 mm di diametro fino a fare contatto con la superficie del gel. Mantenere una distanza di 0,5 mm per un campione di 0,5 mm di spessore idrogel.
- Spazza tempo eseguire per 5 min a sforzo di 0,1%, 0,1 Hz frequenza e 37 ° C. Media il G ' valori attraverso ogni passaggio di tempo. Esecuzione indipendente idrogel per repliche di ogni composizione.
Nota: Il G ' valori dovrebbero essere stabili attraverso punti di tempo; Se non sono, per cento colare e sweep di frequenza deve essere eseguita per selezionare l'appropriato i valori 14.
5. Patterning di proteina
- preparare il modello desiderato per il photomask utilizzando un programma di computer-aided design (CAD). Stampare il photomask su un foglio trasparente utilizzando una stampante ad alta risoluzione. Immergere il photomask in etanolo al 70% per 10 minuti prima dell'uso. Strato di fotoresist per aria, lasciare asciugare in una cappa di cultura cellulare prima dell'uso.
- Aggiungere la soluzione di proteina chitosani preparata nel passaggio 2 per la superficie dell'idrogel per superficie patterning. Pipettare 1-2 µ l/cm 2 di soluzione proteica chitosani alla superficie di ogni ritaglio gel.
Nota: È importante per ridurre al minimo il volume della proteina; aggiungere solo sufficiente a coprire uniformemente tutta la superficie del campione idrogel. - Posizionare con attenzione il photomask sulla superficie dell'idrogel. Non lasciare bolle d'aria tra la fotomaschera e la superficie di idrogel. Premere delicatamente la maschera per rimuovere tutte le bolle che si formano.
- Esporre l'idrogel a un secondo turno di luce UV (lunghezza d'onda: 365 nm, potenza: 3-4 mW/cm 2) per 30-60 s.
Nota: È importante l'esposizione il pattern a abbastanza luce UV per creare un modello forte senza causare la perdita di funzione della proteina. - Lavare l'idrogel con PBS per rimuovere specie non reagito e posizionare ogni idrogel all'interno della placca ben. Fare attenzione quando si inseriscono i gel in ciascun pozzetto; Assicurarsi che la superficie modellata sia rivolto verso. Lavare il gel in PBS a 4 ° C; i gel sono stabili per almeno due settimane a 4 ° C.
6. Preparazione di idrogeli per la semina delle cellule
- Incubare i gel in sostanza basale per 5-10 min a 37 ° C prima della semina. Per cellule endoteliali di vena ombelicale umana (HUVECs), utilizzare EGM-2 medium senza fattori di crescita. Ridurre al minimo il volume del mezzo aggiunto a ciascun bene per prevenire idrogel galleggianti. Per una piastra a 48 pozzetti, utilizzare un volume di 250 µ l di terreno.
- Spin giù la piastra a 300 x g per 3 min garantire che nel caso degli idrogeli è situati nella parte inferiore del pozzo e non è galleggianti. Eseguire questa operazione immediatamente prima della semina delle cellule.
7. Seeding in idrogel di cella
- uso standard cellula di mammiferi sterile cultura procedure per la semina delle cellule e procedure sperimentali. Rimuovere HUVECs da boccette di coltura del tessuto utilizzando protocolli standard delle cellule distacco. Lavare il piatto di coltura del tessuto con PBS sterile e incubare con tripsina per 3-5 min a 37 ° C.
- Placare la sospensione delle cellule tripsinizzate con soluzione di neutralizzatore di medie o tripsina in eccesso delle cellule.
- Rotazione verso il basso la sospensione cellulare nella centrifuga a 300 x g per 5 min. con attenzione rimuovere il supernatante e tenere il pellet cellulare.
- Risospendere il pellet cellulare in basale EGM-2 senza fattori di crescita. Utilizzare un emocitometro per conta cellulare.
- Aggiungere 75.000 cellule/cm 2 per ogni idrogel superficie pipettando lentamente al centro di ogni bene per non disturbare i gel. Posizionare la piastra ben in un'incubatrice di coltura cellulare a 37 ° C. Per diversi giorni, periodicamente, rimuovere il piatto per osservazione.
8. Valutazione di bioattività
- cultura, Escherichia coli, pernottamento in sospensione in libbra di brodo in una sospensione orbitale a 37 ° C e 200 giri/min. Rotazione verso il basso la cultura di e. coli, decantare e ricostituire il pellet cellulare in volume minimo di PBS. Pesare il lisozima e ricostituire a 1 mg/mL per la soluzione di riserva.
- Pipettare un piccolo volume (25 µ l) di soluzione di riserva di lisozima in microcentrifuga. Aggiungere livelli di variazione di LAP fotoiniziatore (0-12 mM) ed esporre i campioni a 1 min di luce UV. In un gruppo separato, aggiungere la stessa quantità di LAP (2 mM) alla soluzione di lisozima ed esporre i campioni a diversi tempi di luce UV (0-4 min). Sono repliche per ogni trattamento. Soluzione di
- Aggiungi uguale volume di concentrato e. coli per ciascun campione di lisozima per una concentrazione di proteina di lisozima finale di 0,5 mg/mL. Incubare le soluzioni miste per 4 h a temperatura ambiente.
Nota: In questo modo tempo per lisozima funzionale lisare la parete cellulare batterica e rilasciare proteine nella soluzione. - Utilizzare incubato con e. coli per un controllo positivo non trattata di lisozima; considera questo una misurazione bioattivi di 100%. Utilizzare la soluzione di lisozima incubati con PBS da solo come controllo negativo.
- Spin giù i campioni per rimuovere i detriti cellulari e mantenere il supernatante. Eseguire un'analisi di Bradford per quantificare la concentrazione totale di proteina all'interno il surnatante per misurare la quantità di lisato batterico.
- Eseguire un'analisi di Bradford seguendo il produttore ' s protocollo 18. Calcolare la piega cambiamento nella concentrazione di proteina rispetto al controllo negativo.
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Representative Results
Il protocollo per creare modelli bioattivi sulla superficie di idrogeli di PEG è illustrato nella Figura 1. Un foglio di calcolo è stato sviluppato per calcolare il volume e la concentrazione per ogni soluzione di riserva (tabella 1A). Proteine per essere immobilizzati sulla superficie dell'idrogel vengono modificate con 2-Iminotiolano (Figura 1B). Questa reazione viene eseguita utilizzando i volumi da tabella 1B. La soluzione di idrogel precursore viene preparata con 10% peso/volume di PEGDA con LAP (Figura 1A). Le varie concentrazioni PEGDA di precursore possono essere utilizzate per produrre la rigidità del substrato desiderata (Figura 2A). La fibronectina è inclusa all'interno di questa soluzione di precursore fini allegato delle cellule. Dopo accurata miscelazione, questa soluzione è dispensata nello stampo preparato ed esposti ai raggi UV (Figura 1C). L'esposizione alla luce UV deve essere ridotto al minimo; l'esposizione dovrebbe essere appena sufficiente per produrre un idrogel. Campioni di idrogel sono centrati per il diametro appropriato per la piastra ben desiderata (Figura 1C). Per superficie patterning, soluzione di proteina modificata è dispensato sulla superficie di un idrogel e distribuire uniformemente. Volume minimo deve essere utilizzato; volume di proteine deve essere appena sufficiente a coprire l'intera superficie dell'idrogel. Strato di fotoresist predefinito è posizionato direttamente sulla superficie idrogel; bolle d'aria tra la maschera e l'idrogel dovrebbe essere evitata. Un secondo ciclo di luce UV è utilizzato per coniugato covalente proteine UV-esposti per l'idrogel. Idrogel campioni vengono sciacquati per rimuovere proteine non reagiti e rivelare il disegno di proteine immobilizzate (Figura 1D).
È importante ridurre al minimo la concentrazione di fotoiniziatore e tempo di esposizione UV quando le proteine sono presenti. Usando bioattività di lisozima come indicatore, abbiamo trovato che la concentrazione di fotoiniziatore LAP dovrebbe essere inferiore a 2 mM (Figura 2B) e il tempo di esposizione UV dovrebbe totale meno di 2 min (Figura 2C) per mantenere una proteina bioattività superiore all'80%.
Tempo di esposizione UV durante la formazione di idrogel e patterning di proteina sono entrambi parametri importanti per lo sviluppo di un protocollo di successo (Figura 3). Prima di tutto, minimizzando l'esposizione ai raggi UV durante la formazione di idrogel è fondamentale per mantenere gruppi funzionali acrilato gratuito per reazioni di immobilizzazione della proteina successive (Figura 3A). Idrogeli esposti ai raggi UV per più di 2 min sono in grado di creare modelli della proteina immobilizzata. Inoltre, come l'esposizione ai raggi UV per il modello di proteina aumenta, più le proteine reagiscono alla superficie (Figura 3B).
Infine, le cellule possono essere coltivate su questi modellato idrogel substrati per manipolare il comportamento delle cellule. Per mostrare le potenzialità dei modelli immobilizzati su idrogeli, abbiamo modellato il VEGF, un fattore di crescita importante per le cellule endoteliali e coltivate HUVECs sulla superficie utilizzando basale EGM-2 medio (Figura 4). HUVECs sono stati seminati in modo uniforme sulla superficie di idrogeli di VEGF-fantasia PEG (Figura 4A). Due giorni dopo la semina, HUVECs sono stati osservati a migrare verso le regioni spaziali di idrogel che conteneva immobilizzato VEGF (Figura 4B, C). Questo è un esempio di un modello di proteine bioattive sul PEG idrogeli utilizzati per influenzare il comportamento delle cellule.
Figura 1: Schematica di idrogel formazione e proteina patterning. (A) preparare la soluzione di idrogel di precursore con monomeri PEGDA, fotoiniziatore e proteina extracellulare per collegamento delle cellule. (B) modificare le proteine con gratis gruppi tioalcool reagendo con 2-Iminotiolano. (C) dispensare la soluzione di precursore nello stampo preparato ed esporlo alla luce UV per formare l'idrogel. Pugno i campioni di idrogel della dimensione desiderata. Pipetta (D) la soluzione di proteina modificata sulla superficie dell'idrogel, posizionare un photomask sulla superficie ed esporlo a un secondo turno di luce UV. Risciacquare il gel per rimuovere non reagito specie prima dell'imaging e semina delle cellule. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Modulando la rigidità e la proteina bioattività. (A) cambiamenti nella concentrazione di monomeri PEGDA all'interno della soluzione di gel precursore altera idrogel rigidità. (B) aumentando la concentrazione di fotoiniziatore LAP abbassa la funzione della proteina dopo 1 minuto di esposizione ai raggi UV. Tempo di esposizione (C) aumento UV abbassa la funzione delle proteine con 2mm LAP. Tutte le barre di errore rappresentano la deviazione standard delle ripetizioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Modello e idrogel tempi di esposizione UV ottimizzati per la modellatura della proteina. I tempi di esposizione (A), Minimizing UV per formazione di idrogel consente superficie patterning. Tempi di esposizione (B) aumento UV per superficie patterning aumenta la forza del modello. Scala bar = 200 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Cellule endoteliali risponde a un modello VEGF. (A) uniforme HUVECs seminate su idrogel. (B e C) HUVECs senso il modello VEGF e migrare verso VEGF immobilizzato. Immagini sono state scattate due giorni dopo la semina in (B) (C), 10 X ingrandimento e 4x. Scala bar = 500 µm. HUVEC-RFP (rosso) e modello di VEGF-488 (verde) sono stati catturati con filtri di eccitazione e di emissione a 528/553 e 465/495, rispettivamente.
Tabella 1: i calcoli per le soluzioni di precursore di stock e gel. Il riquadro rosso indica valori definiti dall'utente, come il peso molecolare, desiderato concentrazioni d'archivio e pesava-out masse. Scatole blu rappresentano i valori che sono stati calcolati in base ai valori definiti dall'utente.
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Discussion
Questo protocollo fornisce un metodo per la creazione di modelli di proteine bioattive per applicazioni biologiche. Ci sono diverse modifiche che possono essere fatte per adattare questo protocollo per diversi esperimenti. In primo luogo, requisiti di collegamento cella varierà per diversi tipi di cellule. Se inizialmente si osserva un collegamento scadente delle cellule per i gel, aumentando la concentrazione della proteina all'interno della soluzione di precursore ECM è consigliato. Altre proteine ECM possono essere utilizzati invece di fibronectina, tra cui diversi tipi di collagene, laminina o una loro combinazione. Per ogni nuovo tipo di cella, collegamento delle cellule deve essere ottimizzata prima di patterning di idrogel. Questo protocollo consente inoltre di fotomaschere progettati dall'utente. Basato sull'applicazione desiderata, maschere fotografiche possono essere prodotte con vari dispongono di dimensioni, forme e modelli generali. Immobilizzazione uniforme può essere realizzato in assenza di un photomask.
Questo protocollo ha alcune limitazioni. Come evidenziato nei Risultati di rappresentante, questo metodo è sensibile alla quantità di luce UV ad ogni passo. Sovraesposizione durante la fase di formazione di idrogel limita i gruppi di acrilato disponibile per successive bioconjugation superficiale. Di conseguenza, un passo fondamentale in questo protocollo è ben gestiti tempi di esposizione alla luce UV per ogni passaggio. Inoltre, questo protocollo richiede uno stock di proteine ad alta concentrazione per il modello di successo. Basse concentrazioni di proteina si tradurrà in modelli di superficie scadente. Inoltre, maschere fotografiche sono anche limitante in quanto possono solo produrre modelli discreti. Modelli più complessi possono essere raggiunti con approcci simili ma richiedono una metodologia più avanzata.
Questo protocollo è significativo a metodi esistenti, poiché fornisce un metodo semplice per regolare la rigidità del substrato e proteina patterning. Usando acrilato chimica per la formazione di idrogel consente una gamma di grandezza di rigidità del substrato all'interno della gamma fisiologica. Semplicemente regolando la concentrazione di PEGDA all'interno della soluzione di precursore dà il controllo sopra la rigidità di idrogel. Inoltre, l'utilizzo della chimica clicca per la modellatura di proteina permette rapida coniugazione tra substrato idrogel e chitosani per volta della proteina. Questa è una caratteristica chiave di design, come permette questo protocollo sia applicabile a qualsiasi proteina o peptide di interesse.
Idrogeli PEG sono promettenti biomateriali che possono essere utilizzati per esplorare nuove piattaforme per la visualizzazione di segnali biochimici di sistemi biologici. Se immobilizzazione superficiale uniforme o motivi spazialmente specifici, queste tecniche forniscono nuovi modi per controllare il comportamento delle cellule. Andando avanti, l'avanzamento della tecnologia di biomateriale fornirà nuove intuizioni sul comportamento delle cellule e ulteriormente le nostre capacità di ricapitolare in vivo motivi segnalazione all'interno di sistemi in vitro . Questo può essere utile per la differenziazione delle cellule staminali e modellazione segnalazione inerente allo sviluppo all'interno di un sistema sperimentale controllato.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto principalmente da sovvenzioni dalla American Heart Association scienziato sviluppo concessione (12SDG12050083 alla GD), il National Institutes of Health (R21HL102773, R01HL118245 alla GD) e della National Science Foundation (CBET-1263455 e CBET-1350240 alla GD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PEG-diacrylate (PEGDA) | Laysan Bio | ACRL-PEG-ACRL-3400 | Can also be synthesized or purchased through other venders. Different molecular weights can be used. |
| Lithium Phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Synthesized in lab | ||
| Fibronectin | Corning | 356008 | Other cell attachment proteins can be used, such as laminin, matrigel |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | D8537-500ML | |
| Photomask | FineLine Imaging | n/a | Custom prints on transparent sheets with high resolution DPI. |
| Binder Clips | Various Vendors | ||
| Compact UV Light Source (365nm) | UVP | UVP-21 | Other UV light sources can be used, calibration of power is required. |
| 2-iminothiolane (Pierce Traut’s Reagent) | Thermo Sci. | 26101 | |
| Ellman’s Reagent: DTNB; 5,5-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) | Thermo Sci. | 22582 | |
| human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | Lonza | passage number between 6- 10 | |
| EGM-2 Media | Lonza | CC31-56, CC-3162 | EGM-2 without growth factors was used in experiments. Full EGM-2 media was used for cell maintainance |
| 0.25% Trypsin EDTA | Life Tech | 25200-056 | |
| Trypsin Neutralizer | Life Tech | R-002-100 | |
| Centrifuge | Various Venders | ||
| Hemocytometer | Hausser Sci. Bright-line | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | E6758 | |
| 0.22µm filter | Cell Treat | 229743 | |
| 1mL Syringe | |||
| Glass Microscope Slides | Fisher Sci. | 12-550C | |
| Plastic spacers | Various Venders | 0.5mm thickness | |
| 70% Ethanol | BICCA | 2546.70-1 | |
| Bio-shield | Bio-shield | 19-150-0010 | |
| Bradford Reagent | BIO-RAD | ||
| Desalting Resin - Sephadex G-25 | GE Healthcare | 95016-754 | |
| Microspin Columns | Thermo Sci. | PI69725 | |
| AR-G2 rehometer | TA Instruments |
References
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