Summary
I denne metode, vi bruger photopolymerization og klik kemi teknikker til at skabe protein eller peptid mønstre på overfladen af polyethylenglycol (PEG) hydrogels, at give immobiliseret bioaktive signaler sammen med studiet af cellulære svar in vitro- .
Abstract
Der er mange biologiske stimuli, der kan påvirke adfærd og stamceller Celledifferentiering. Generelle celle kultur tilgange er afhængige af opløselige faktorer inden for mellemlang til kontrol celle adfærd. Men opløseligt tilføjelser kan ikke efterligne visse signalering motiver, såsom matrix-bundet vækstfaktorer, celle-celle signalering, og rumlige biokemiske stikord, som er fælles indflydelse på celler. Derudover spiller biofysiske egenskaber af matricen, som substrat stivhed, en vigtig rolle i celle skæbne, der ikke er nemt manipuleres ved hjælp af konventionelle celle dyrkning praksis. I denne metode beskriver vi en enkel protokol for at give mønstrede bioaktive proteiner på syntetisk polyethylenglycol (PEG) hydrogels ved hjælp af fotokemi. Denne platform giver mulighed for den uafhængige kontrol af substrat stivhed og rumlige biokemiske stikord. Disse hydrogels kan opnå en lang række fysiologisk relevante stivhed værdier. Derudover overflader af disse hydrogels kan være photopatterned med bioaktive peptider eller proteiner via thiol-en klik kemi reaktioner. Disse metoder er blevet optimeret for at bevare protein funktion efter overflade immobilisering. Dette er en alsidig protokol, der kan anvendes til protein eller peptid af interesse at skabe en række mønstre. Endelig kan celler seedede på overflader af disse bioaktive hydrogels følges over tid som de reagerer på rumligt specifikke signaler.
Introduction
Der er mange stimuli, der påvirker celle adfærd. Generelt, typisk celle dyrkningsbaserede teknikker stole på opløselige faktorer at fremkalde cellulære svar; der er dog begrænsninger for denne tilgang. Disse metoder er ikke præcist vise alle signaling motiver almindeligt forekommende in vivo. Sådanne signaling mekanismer omfatter afsondret vækstfaktorer, celle-celle signalering og rumligt-specifikke biokemiske stikord. Derudover substrat stivhed kan spille en vigtig rolle i adfærd og stamceller Celledifferentiering og er ikke let manipuleres ved hjælp af fælles celle dyrkningsbaserede metoder1,2. Biomateriale tilgange tilbyder en ny platform for at begynde at udforske disse signaling mekanismer. Især er hydrogels gode kandidater til tuning substrat stivhed3,4, blokeret proteiner og peptider5,6, og skabe rumligt bestemte mønstre7, 8.
Hydrogels er almindeligt anvendt som stilladser i vævsmanipulering på grund af deres biofysiske og biokemiske fællestræk med ekstracellulære matrix (ECM)9,10. Naturlige polymerer er fælles valg til stilladser, da de er biokompatible og findes i mange væv i kroppen. Begrænsning af brug af naturlige polymerer som substrater er, at de ikke lette at manipulere kemiske fraspaltning for bioconjugation. På den anden side er syntetiske hydrogels, som sådan som PIND, fremragende platforme for målrettede kemi11,12. Derudover PIND hydrogels fremkalde ikke en cellulære reaktion og derfor bruges som inert backbones til oprettelse af bioaktive stilladser.
Både photopolymerization og thiol-en Klik for at oprette bioaktive hydrogels, kemi reaktioner er ansat. Disse photoreactions kræver en photoinitiator og en UV-lyskilde. Når photoinitiators bliver introduceret til UV-lys, bryde obligationer til at danne radikaler. Teser radikaler er nødvendige for at indlede reaktionen, men kan indvirke negativt på protein bioactivity12,13. Derfor er det afgørende at optimere photoinitiator og UV eksponering gange at opretholde protein bioactivity.
I denne metode, er hydrogels syntetiseret gennem acrylat-acrylat kæde vækst photopolymerization. PIND-diacrylate (PEGDA) monomerer reagere med hinanden om at danner forgrenede polymer netværk ansvarlig for strukturen af hydrogel. Koncentrationen af PEGDA monomerer i forløber gelopløsning vil kontrollere substrat stivhed. På grund af lille pore størrelse af hydrogel, ECM proteiner som fibronektin nemt kan indarbejdes i hydrogel med henblik på celle vedhæftet fil. Endelig, disse hydrogels kan være overflade-mønstret med bioaktive peptider eller proteiner via thiol-en klik kemi reaktioner. Her, vil ureageret gratis akrylater under ordningen hydrogel for reagere med frie dithioler beliggende på protein eller peptid når den udsættes for UV-lys. Efter proteiner eller peptider er immobiliseret på hydrogel overflade, kan hydrogel opbevares ved 4 ° C i flere uger uden at miste bioactivity. Dette giver bekvemmelighed, fleksibel eksperimentelle planlægning og muligheden for samarbejde mellem labs. Samlet set denne platform giver mulighed for biomekaniske og rumlige biokemiske kontrol, uafhængigt af hinanden, mulighed at påvirke cellulære adfærd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse af materialer til Hydrogel syntese
- Forbered stamopløsninger af PEGDA, lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) og fibronektin under sterile forhold og baseret på beregninger (tabel 1A).
- Afvejes og opløses forbindelser i fosfatbufferet saltopløsning (PBS). Typisk, opretholde PEGDA arbejder løsning koncentrationer mellem 50 og 200 mg/mL (5-20% vægt/volumen). Afpipetteres PEGDA løsning gennem et 0,22 µm sprøjte filter for sterilisation.
Bemærk: Hold PEGDA løsninger er dækket med en folie indpakning for at beskytte dem mod lys. Forberede en frisk løsning af PEGDA (anbefales) til hvert eksperiment. - Rekonstruere fibronektin protein pulver baseret på fabrikanten ' s anbefaling. Vedligeholde fibronektin stamopløsning på 1 mg/mL, alikvot det i 60-100 µL delprøver, og gemme dem på-20 ° C indtil brug. Afrimning alikvoter ved 4 ° C for flere timer eller natten over før brug. Hvis protein materiel ikke allerede er fastsat i sterile forhold, bruge et 0,22 µm sprøjte filter for sterilisation.
Bemærk: Fibronektin bruges til celle vedhæftet fil. Andre ECM proteiner kan erstattes. - Afvejes LAP for stamopløsningen og opløse den i PBS, en typisk stock koncentration er 25 mg/mL. Der sonikeres hvis der er nogen problemer med opløsning. Passere løsningen gennem et 0,22 µm filter for sterilisation. Dække LAP med en folie indpakning og holde det ved 4 ° C i op til flere måneder.
Bemærk: LAP er photoinitiator anvendes til fotokemi.
- Afvejes og opløses forbindelser i fosfatbufferet saltopløsning (PBS). Typisk, opretholde PEGDA arbejder løsning koncentrationer mellem 50 og 200 mg/mL (5-20% vægt/volumen). Afpipetteres PEGDA løsning gennem et 0,22 µm sprøjte filter for sterilisation.
- Forberede hydrogel dannelse sterilt glas dias forme.
- Autoklave en polyester ark; en er nødvendig for hver gel skimmel. Sættetid to glas lysbilleder og tre plastik afstandsstykker (0,5 mm tyk) for hver gel mug i 70% ethanol i mindst 2 timer, men generelt give dem i blød natten over. Nyd fem bindemiddel klip for hver gel mug i 70% ethanol for 10 min før brug.
- Placer glas lysbilleder, afstandsklodser og bindemiddel klip på en lille autoklaveres ark i celle kultur hætte til lad dem lufttørre i flere timer.
- Forbered hydrogel forme ved at placere plastik afstandsstykker rundt i kanten af et glas dias. Placer det andet glas dias på toppen. Sikre afstandsstykker tæt ved siden af hinanden med bindemiddel klip, to på hver langside og 1 på top.
Bemærk: Hvis dette ikke er korrekt monteret, gelopløsning vil sive ud. - Overflade-sterilisere mug med cellekultur hætte UV-lys for 30 min før brug. Halvvejs gennem, flip formen til at eksponere både overflader.
2. Ændre proteiner med en gratis Thiol
- forberede lager løsninger ved hjælp af beregninger fra regnearket til at konvertere Amin til thiol på proteiner (tabel 1A).
- At gøre reaktion buffer, justere PBS til pH 8 og tilføje 5 mM EDTA. Pipette reaktion buffer ind i et 0,22 µm sprøjte filter for sterilisation.
Bemærk: EDTA er vigtig, da det beskytter dithioler fra formning disulfid obligationer. Thiol grupper skal forblive i deres reduceret form for reaktion at forekomme. - Afvejes 2-iminothiolane (Traut ' s reagens) og opløse den i reaktion buffer for en stamopløsning, hvis koncentration 2 mg/ml (14 mM). Sendes gennem et 0,22 µm sprøjte filter for sterilisation. Gemme stamopløsning ved 4 ° C i op til flere måneder.
Bemærk: 2-iminothiolane er det molekyle, der reagerer med opløsningsmiddel-eksponerede gratis aminer på proteiner og konverterer dem til gratis dithioler. - Rekonstruere protein i reaktion buffer i en koncentration på mellem 0,1 og 1 mg/mL. Medmindre tidligere sterile, afpipetteres denne løsning gennem et 0,22 µm sprøjte filter for sterilisation.
Bemærk: Dette protein er den biokemiske signal, der vil være mønstrede hydrogel overfladen. Også, mens protein koncentrationer kan variere, højere koncentrationer er ideelle til stærkere protein mønstre.
- At gøre reaktion buffer, justere PBS til pH 8 og tilføje 5 mM EDTA. Pipette reaktion buffer ind i et 0,22 µm sprøjte filter for sterilisation.
- Reagere protein med 2-iminothiolane ved at blande både stamopløsninger sammen; Brug tabel 1B til at beregne korrekte volumen-forholdet. Bruger typisk et molære forhold på 8:1 2-iminothiolane til protein.
Bemærk: For større proteiner eller mere fortyndes koncentrationer, bruge en højere molære forhold af 2-iminothiolane. Henvise til fabrikanten ' s protokol 15. - Ruger reaktion i 1 time ved stuetemperatur. Brug en udvanding spin mikro-kolonne til at fjerne thiolated protein produkt fra de resterende reaktanter, efter fabrikanten ' s protokol 16.
Bemærk: Den udelukkelse grænse for denne harpiks er 5 KDa. - Brug Ellman ' s Assay kvantitativt mål antallet af gratis dithioler pr. protein. Følg fabrikantens ' s protokol for assay 17.
3. Hydrogel dannelsen
- Opret forløber gelopløsning baseret på værdier, der beregnes ud fra tabel 1 c. Bland PEGDA, fibronektin og LAP diskenheder. Der afpipetteres løsning kraftigt for at sikre en ensartet løsning, men undgå at skabe bobler. Opløsningen beskyttet mod lys.
- Afpipetteres forløber gelopløsning omhyggeligt mellem to glas lysbilleder af gel skimmel. Typisk, tilføje en volumen mellem 800 og 1.000 µL til formen. Udsætte gelopløsning i formen for UV-lys (bølgelængde: 365 nm, magt: 3-4 mW/cm 2) for 1-2 min til at danne hydrogel.
Bemærk: Undlad at udsætte hydrogel til langvarig UV-lys, da det vil begrænse den overflade protein mønster kapaciteter. - Tage bindemiddel klip og forsigtigt fjerne top glas dias ved at anvende overfor pres på to side afstandsstykkerne.
- Bruger en passende størrelse biopsi punch for at skære hydrogel prøver. Punch ud flere hydrogels fra gel rektangel til at tjene som replikater og kontrolprøver.
4. Hydrogel stivhed målinger
- Punch ud hydrogels med et 8 mm-diameter biopsi punch til en 8 mm parallelle plade rheometer. Indlæse en hydrogel prøve i rheometer (Se Tabel of Materials).
- Lavere parallelle plade geometri er 8 mm i diameter indtil at gøre kontakt med overfladen af gelen. Holde en hul afstand på 0,5 mm til en 0,5 mm tyk hydrogel prøve.
- Udføre tid fejer for 5 min på 0,1% stamme, 0,1 Hz frekvens og 37 ° C. gennemsnittet af G ' værdier på tværs af hver gang feje. Køre uafhængigt hydrogels for replikater af hver sammensætning.
Bemærk: G ' værdier bør være stabil over tidspunkter; Hvis ikke, procent stamme og frekvens fejer bør udføres for at vælge den passende værdier 14.
5. Protein mønster
- Forbered det ønskede mønster for photomask ved hjælp af en computer aided design (CAD) program. Udskrive photomask på en gennemsigtig plade ved hjælp af en højopløsningsprinter. Nyd photomask i 70% ethanol for 10 min før brug. Tillade photomask til luft tørre i en celle kultur hætte før brug.
- Tilføje thiolated protein løsning forberedt i trin 2 på overfladen af hydrogel til overflade mønstre. Tilsæt 1-2 µL/cm 2 thiolated protein løsning på overfladen af hver udskæring gel.
Bemærk: Det er vigtigt at minimere protein volumen; blot tilføje nok til jævnt dække hele overfladen af eksemplet hydrogel. - Omhyggeligt placere photomask på overfladen af hydrogel. Tillad ikke luftbobler mellem photomask og hydrogel overflade. Tryk forsigtigt ned på maske til at fjerne eventuelle bobler der danner.
- Afsløre hydrogel til en anden runde af UV-lys (bølgelængde: 365 nm, magt: 3-4 mW/cm 2) for 30-60 s.
Bemærk: Det er vigtigt at eksponering mønsteret for nok UV lys til at skabe en stærk mønster uden forårsager tab af protein funktion. - Vask hydrogels med PBS til at fjerne ureageret arter og placere hver hydrogel inden for godt pladen. Vær forsigtig, når du placerer geler i hver brønd; Sørg for, at de mønstrede flade er ansigt op. Vaske geler i PBS ved 4 ° C; geler er stabil i mindst to uger ved 4 ° C.
6. Forberede Hydrogels for celle såning
- inkuberes geler i basal medium for 5-10 minutter ved 37 ° C før såning. Menneskelige umbilical vene endothelial celler (HUVECs), at bruge EGM-2 medium uden vækstfaktorer. Minimere mængden af medium tilføjes hver godt at forhindre hydrogel flydende. For en 48-godt plade, bruge en 250 µL volumen af medium.
- Spin ned plade på 300 x g i 3 min. til at sikre, at hydrogels er placeret i bunden af brønden og er ikke flydende. Gøre dette umiddelbart før celle såning.
7. Celle forhåndsudfyldning på Hydrogels
- Brug standard sterile pattedyr celle kultur procedurer for celle såning og eksperimentelle procedurer. Fjern HUVECs fra vævskultur flasker ved hjælp af standard celle detachement protokoller. Vaske vævskultur fadet med steril PBS og inkuberes med trypsin i 3-5 min. på 37 ° C.
- Dæmpning af trypsinized cellesuspension med overskydende celle medium eller trypsin neutralizer løsning.
- Spin ned cellesuspension i centrifugen på 300 x g for 5 min. omhyggeligt fjernes supernatanten og holde celle pellet.
- Celle resuspenderes i basal EGM-2 med ingen vækstfaktorer. Bruge en hemocytometer til celle optælling.
- Tilføje 75.000 celler/cm 2 til hver hydrogel overflade af pipettering langsomt ind i midten af hver godt for ikke at forstyrre geler. Godt pladen anbringes i en celle kultur inkubator ved 37 ° C. For flere dage, mellemrum fjerne parabol for observation.
8. Evaluering af Bioactivity
- kultur E. coli overnatning i suspension i LB bouillon i en orbital suspension ved 37 ° C og 200 rpm. Spin ned E. coli kultur, dekanteres og rekonstruere den celle pellet i minimal mængde af PBS. Lysozym der afvejes og rekonstruere på 1 mg/mL for stamopløsningen.
- Afpipetteres en lille mængde (25 µL) af lysozym stamopløsning i microcentrifuge rør. Tilføje varierende niveauer af LAP photoinitiator (0-12 mM) og udsætte prøver til 1 min af UV-lys. I en særskilt gruppe, tilføje den samme mængde af LAP (2 mM) til lysozym løsning og udsætte prøver til varierende UV lys gange (0-4 min). Omfatter flergangsbestemmelser for hver behandling.
- Tilføj lige saa stort volumen af koncentreret E. coli løsning til hver lysozym sample for en afsluttende lysozym proteinkoncentration på 0,5 mg/mL. Inkuber de blandede løsninger i 4 timer ved stuetemperatur.
Bemærk: Dette giver tid til funktionelle lysozym lyse den bakterielle cellevæg og frigive proteiner oploesningen. - Bruge ubehandlet lysozym inkuberes med E. coli i en positiv kontrol, overveje dette en 100% bioaktive måling. Bruge lysozym løsning inkuberes med PBS alene som en negativ kontrol.
- Spin ned prøver at fjerne celle debris og holde supernatanten. Køre en Bradford assay for at kvantificere den samlede koncentration af protein i supernatanten til at måle mængden af bakterielle lysate.
- Køre en Bradford assay efter fabrikanten ' s protokol 18. Beregne folden ændre i proteinkoncentration i forhold til den negative kontrol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokol til at oprette bioaktive mønstre på overfladen af PIND hydrogels er illustreret i figur 1. Et regneark blev udviklet for at beregne mængden og koncentrationen for hver stamopløsning (tabel 1A). Proteiner til at blive immobiliseret på overfladen af hydrogel er modificeret med 2-iminothiolane (figur 1B). Denne reaktion er udført ved hjælp af diskenheder fra tabel 1B. Forløber hydrogel løsning er forberedt med 10% vægt/volumen af PEGDA med LAP (fig. 1A). Forskellige forløber PEGDA koncentrationer kan bruges til at give den ønskede substrat stivhed (fig. 2A). Fibronektin er medtaget inden for dette forløber løsning til celle vedhæftet fil formål. Efter grundig blanding, er denne løsning pipetted ind i den forberedte mug og udsat for UV-lys (figur 1C). UV-lys eksponering bør minimeres; eksponeringen skal være lige nok til at producere en hydrogel. Hydrogel prøver er hulles ud til passende diameter for den ønskede godt plade (figur 1C). For overflade mønstre, er modificeret protein løsning pipetted på overfladen af en hydrogel og jævnt fordelt. Minimal mængde bør anvendes; protein volumen skal være lige nok til at dække hele overfladen af hydrogel. De foruddesignede photomask er placeret direkte på hydrogel overflade; luftbobler mellem masken og hydrogel bør undgås. En anden runde af UV-lys bruges til kovalent konjugat UV-eksponerede proteiner til hydrogel. Hydrogel prøver skylles for at fjerne ureageret proteiner og afsløre immobiliseret protein mønster (figur 1D).
Det er vigtigt at minimere photoinitiator koncentration og UV eksponeringstid når proteiner er til stede. Ved hjælp af lysozym bioactivity som indikator, fandt vi, at SKØDET photoinitiator koncentration skal være mindre end 2 mM (figur 2B) og UV eksponeringstid bør alt mindre end 2 min (figur 2C) for at bevare et protein bioactivity større end 80%.
UV eksponeringstid under hydrogel dannelse og protein mønstre er begge vigtige parametre for at udvikle en vellykket protokol (figur 3). Først og fremmest, er minimere UV eksponering under hydrogel dannelse afgørende for at opretholde frie acrylat funktionelle grupper til efterfølgende protein immobilisering reaktioner (fig. 3A). Hydrogels udsat for UV-lys i længere tid end 2 min er afskåret fra skabe immobiliseret protein mønstre. Derudover som UV eksponering for protein mønster øger, reagere flere proteiner på overflade (fig. 3B).
Endelig celler kan være kulturperler på disse mønstrede hydrogel substrater til at manipulere celle adfærd. For at vise potentialet i immobiliseret mønstre på hydrogels, vi mønstrede VEGF, en vigtig i endothelial celler, vækstfaktor og kulturperler HUVECs på overfladen ved hjælp af basal EGM-2 medium (figur 4). HUVECs var ensartet seedede på overfladen af VEGF-mønstrede PIND hydrogels (figur 4A). To dage efter såning, blev HUVECs observeret for at migrere over de rumlige regioner af den hydrogel, der indeholdt immobiliseret VEGF (fig. 4B, C). Dette er et eksempel på en bioaktive protein mønster på PIND hydrogels bliver brugt til at påvirke celle adfærd.
Figur 1: Skematisk hydrogel dannelse og protein mønstre. (A) forberede celle vedhæftede forløber hydrogel løsning med PEGDA monomerer, photoinitiator og ekstracellulære protein. (B) ændre proteiner med gratis thiol grupper ved at reagere med 2-iminothiolane. (C) afpipetteres forløber løsning i den forberedte mug og udsætter det for UV-lys til at danne hydrogel. Punch ud hydrogel prøver af den ønskede størrelse. (D) afpipetteres modificeret protein løsning på overfladen af hydrogel, placere en photomask på overfladen, og udsætter det for en anden runde af UV-lys. Skyl gel for at fjerne ureageret arter inden imaging og celle såning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Modulerende stivhed og protein bioactivity. (A) ændringer i koncentrationen af PEGDA monomerer i forløber gelopløsning alter hydrogel stivhed. (B) øger koncentrationen af LAP photoinitiator sænker protein funktion efter 1 min af UV-eksponering. (C) stigende UV eksponeringstid sænker protein funktion med 2 mM LAP. Alle fejllinjer repræsenterer standardafvigelsen af replikater. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Mønster og hydrogel UV eksponering gange optimeret til protein mønstre. (A) minimering UV eksponering gange for hydrogel dannelse gør det til overflade mønstre. (B) stigende UV eksponering gange for overflade mønstre øger mønster styrke. Skalere barer = 200 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Endothelial celler reagerer på en VEGF mønster. (A) ensartet HUVECs seedet på hydrogels. (B og C) HUVECs fornemme VEGF mønster og vandrer mod immobiliseret VEGF. Billeder blev taget to dage efter såning i (B) 4 X og (C) 10 X forstørrelse. Skalere barer = 500 µm. HUVEC-RFP'er (rød) og VEGF-488 mønster (grøn) blev fanget med excitations- og filtre på 528/553 og 465/495, henholdsvis. Klik venligst her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1: beregninger for materiel og gel forløber løsninger. Det røde felt angiver bruger-definerede værdier, såsom molekylvægt, ønskes stock koncentrationer og vejes-out masserne. Blå bokse repræsenterer værdier, der er beregnet baseret på bruger-definerede værdier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol indeholder en metode til at skabe bioaktive protein mønstre for biologiske applikationer. Der er flere ændringer, der kan gøres til at tilpasse denne protokol for forskellige eksperimenter. Første varierer celle tilslutningskrav for de forskellige celletyper. Hvis fattige celle tilknytning til geler er i første omgang observeret, anbefales øger koncentrationen af ECM proteiner inden for forløber løsningen. Andre ECM proteiner kan bruges i stedet for fibronektin, herunder forskellige typer af kollagen, laminin eller en kombination heraf. For hver ny celletype, skal celle vedhæftet fil optimeres inden hydrogel mønstre. Denne protokol tillader også brugerdesignede komponeneter. Baseret på det ønskede program, komponeneter kan fremstilles med forskellige indslag størrelser, former og overordnede mønstre. Ensartet immobilisering kan opnås i mangel af en photomask.
Denne protokol har visse begrænsninger. Som fremhævet i Repræsentative resultaterer denne metode følsomme over for mængden af UV-lys på hvert trin. Overeksponering under trinnet hydrogel dannelse begrænser de tilgængelige acrylat grupper til efterfølgende overflade bioconjugation. Derfor er et vigtigt skridt i denne protokol veldrevet UV lys eksponering gange for hvert trin. Denne protokol kræver også en høj koncentration protein bestand for vellykket mønstre. Lave koncentrationer af protein vil resultere i dårlig overflade mønstre. Derudover begrænser komponeneter også i, at de kan kun producere diskrete mønstre. Mere komplekse mønstre kan opnås med lignende metoder, men kræver en mere avanceret metode.
Denne protokol er væsentlige for eksisterende metoder, da det giver en enkel metode til justering af substrat stivhed og protein mønstre. Ved hjælp af acrylat kemi for hydrogel dannelsen giver mulighed for en størrelsesorden række substrat stivhed inden for den fysiologiske interval. Blot justere koncentrationen af PEGDA inden for forløber løsningen giver kontrol over hydrogel stivhed. Desuden, brug af klik kemi for protein mønstre giver mulighed for hurtig konjugation mellem hydrogel substrat og thiolated modificeret protein. Dette er en centrale design feature, da det giver mulighed for denne protokol til at gælde for enhver protein eller peptid af interesse.
PIND hydrogels er lovende biomaterialer, der kan bruges til at udforske nye platforme til at vise biokemiske stikord til biologiske systemer. Uanset om ensartet overflade immobilisering eller rumligt bestemte mønstre, disse teknikker give nye måder at styre celle adfærd. Bevæger sig fremad, vil fremme af biomateriale teknologi give ny indsigt i celle adfærd og yderligere vores evner til at sammenfatte in vivo signaling motiver inden for in vitro- systemer. Dette kan være gavnligt for stamcelleforskning differentiering og modellering udviklingsmæssige signalering inden for en kontrolleret eksperimentel system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev hovedsagelig støttet af tilskud fra American Heart Association videnskabsmand udvikling Grant (12SDG12050083 til G.D.), National Institutes of Health (R21HL102773, R01HL118245 til G.D.) og National Science Foundation (CBET-1263455 og CBET-1350240 til G.D.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PEG-diacrylate (PEGDA) | Laysan Bio | ACRL-PEG-ACRL-3400 | Can also be synthesized or purchased through other venders. Different molecular weights can be used. |
| Lithium Phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Synthesized in lab | ||
| Fibronectin | Corning | 356008 | Other cell attachment proteins can be used, such as laminin, matrigel |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | D8537-500ML | |
| Photomask | FineLine Imaging | n/a | Custom prints on transparent sheets with high resolution DPI. |
| Binder Clips | Various Vendors | ||
| Compact UV Light Source (365nm) | UVP | UVP-21 | Other UV light sources can be used, calibration of power is required. |
| 2-iminothiolane (Pierce Traut’s Reagent) | Thermo Sci. | 26101 | |
| Ellman’s Reagent: DTNB; 5,5-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) | Thermo Sci. | 22582 | |
| human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | Lonza | passage number between 6- 10 | |
| EGM-2 Media | Lonza | CC31-56, CC-3162 | EGM-2 without growth factors was used in experiments. Full EGM-2 media was used for cell maintainance |
| 0.25% Trypsin EDTA | Life Tech | 25200-056 | |
| Trypsin Neutralizer | Life Tech | R-002-100 | |
| Centrifuge | Various Venders | ||
| Hemocytometer | Hausser Sci. Bright-line | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | E6758 | |
| 0.22µm filter | Cell Treat | 229743 | |
| 1mL Syringe | |||
| Glass Microscope Slides | Fisher Sci. | 12-550C | |
| Plastic spacers | Various Venders | 0.5mm thickness | |
| 70% Ethanol | BICCA | 2546.70-1 | |
| Bio-shield | Bio-shield | 19-150-0010 | |
| Bradford Reagent | BIO-RAD | ||
| Desalting Resin - Sephadex G-25 | GE Healthcare | 95016-754 | |
| Microspin Columns | Thermo Sci. | PI69725 | |
| AR-G2 rehometer | TA Instruments |
References
- Yao, S., et al. Co-effects of matrix low elasticity and aligned topography on stem cell neurogenic differentiation and rapid neurite outgrowth. Nanoscale. 8 (19), 10252-10265 (2016).
- Evans, N. D., et al. Substrate stiffness affects early differentiation events in embryonic stem cells. Eur Cells Mater. 18, 1-13 (2009).
- Ye, K., et al. Matrix Stiffness and Nanoscale Spatial Organization of Cell-Adhesive Ligands Direct Stem Cell Fate. Nano Lett. 15 (7), 4720-4729 (2015).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
- Sridhar, B. V., Doyle, N. R., Randolph, M. A., Anseth, K. S. Covalently tethered TGF-beta1 with encapsulated chondrocytes in a PEG hydrogel system enhances extracellular matrix production. J Biomed Mater Res A. 102 (12), 4464-4472 (2014).
- Salinas, C. N., Anseth, K. S. Decorin moieties tethered into PEG networks induce chondrogenesis of human mesenchymal stem cells. J Biomed Mater Res A. 90 (2), 456-464 (2009).
- Joddar, B., Guy, A. T., Kamiguchi, H., Ito, Y. Spatial gradients of chemotropic factors from immobilized patterns to guide axonal growth and regeneration. Biomaterials. 34 (37), 9593-9601 (2013).
- Wylie, R. G., Ahsan, S., Aizawa, Y., Maxwell, K. L., Morshead, C. M., Shoichet, M. S. Spatially controlled simultaneous patterning of multiple growth factors in three-dimensional hydrogels. Nat Mater. 10 (10), 799-806 (2011).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering. Nat Biotechnol. 23 (1), 47-55 (2005).
- Saik, J. E., Gould, D. J., Keswani, A. H., Dickinson, M. E., West, J. L. Biomimetic hydrogels with immobilized ephrinA1 for therapeutic angiogenesis. Biomacromolecules. 12 (7), 2715-2722 (2011).
- McCall, J. D., Anseth, K. S. Thiol-ene photopolymerizations provide a facile method to encapsulate proteins and maintain their bioactivity. Biomacromolecules. 13 (8), 2410-2417 (2012).
- Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 29 (6), 997-1003 (2009).
- Zuidema, J. M., Rivet, C. J., Gilbert, R. J., Morrison, F. A. A protocol for rheological characterization of hydrogels for tissue engineering strategies. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 102 (5), 1063-1073 (2014).
- Truat's Reagent Instructions. Thermo Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/.../MAN0011238_Trauts_Reag_UG.pdf (2017).
- Ellman's Reagent Instructions. Thermo Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011216_Ellmans_Reag_UG.pdf (2017).
- Desalting Columns. GE Life Sciences. , Available from: https://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/1478781880316/litdoc52130800_2016111034421.pdf (2017).
- Quick State Bradford Reagent Protein Assay, Instruction Manual. Bio-Rad. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4110065A.pdf (2017).
