Summary
Här visar vi en ny metod att hjälpa leverans av gene therapy agenter i subretinalområdet, bedöma dess areala täckning och karakterisera ljusmätare vitalitet med hög upplösning spektral-domän optisk koherenstomografi (HR-SD-okt).
Abstract
HR-SD-okt utnyttjas att övervaka utvecklingen av ljusmätare degeneration i levande musmodeller, bedöma distribution av terapeutiska medel i subretinalområdet och utvärdera toxicitet och effekt i vivo. HR-SD-okt använder nära infrarött ljus (800-880 nm) och har optik speciellt utformad för de unika optiken på möss med sub-2-micron axiella upplösning. Transgena musmodeller av yttre retinal (ljusmätare) degeneration och kontroller var avbildas för att bedöma sjukdomsförloppet. Draget glas mikronålar användes för att leverera sub retinal injektioner av adeno-associerade virus (AAV) eller nanopartiklar (NP) via en trans-skleral och trans-koroidal strategi. Noggrann positionering av nålen i subretinalområdet krävdes före en kalibrerad injektion, som levererar vätska in i sub retinal utrymme. Realtid subretinal kirurgi utfördes på våra retinal imaging system (RIS). HR-SD-okt visat progressiva enhetliga näthinneförtvining på grund av uttryck av ett giftigt muterade mänskliga mutant rhodopsin (P347S) (RHOP347S) transgenens hos möss. HR-SD-okt tillåter rigorösa kvantifiering av alla retinala lagren. Yttre nukleära lagret (Onlinekanaler) tjocklek och ljusmätare yttre segment längd (OSL) mätningar korrelerar med ljusmätare vitalitet, degeneration eller räddning. RIS leveranssystemet tillåter realtid visualisering av subretinal injektioner i neonatal (~ P10-14) eller vuxna möss, och HR-SD-okt omedelbart avgör framgången för leverans och kartor areala omfattning. HR-SD-okt är ett kraftfullt verktyg som kan utvärdera framgången av subretinal kirurgi i möss, i tillägg till att mäta vitalitet av fotoreceptorer i vivo. HR-SD-okt kan också användas för att identifiera enhetliga djur kohorter för att bedöma omfattningen av retinal degeneration, toxicitet och terapeutiska räddning i prekliniska gen terapi forskningsstudier.
Introduction
Forskare utvecklar genterapi för en mängd olika retinala och retinala degenerativa sjukdomar med förhoppningar om att översätta roman therapeutics till behandlingar för mänskliga sjukdomar1,2,3,4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. tid domän eller spektrala domänen optisk koherenstomografi (SD-okt) har använts för att undersöka aspekter av yttre retinal degeneration i specifika musmodeller av sjukdom12,13,14 . HR-SD-okt har dock inte i stor utsträckning används i samband med optimera utvärdering av musmodeller för att bestämma hastigheten och rumsliga enhetlighet av retinal degeneration, eller i samband med preklinisk utvärdering av genen baserat therapeutics, till exempel till bedöma räddning, toxicitet eller den rumsliga utsträckning vektor leverans8,15,16. När en musmodell kännetecknas fullt, kan HR-SD-okt data fungera som en informativ och pålitlig resurs för att mäta effekten av therapeutics att utöva undsättnings- eller toxicitet i musmodeller av retinal degeneration17. Många grupper använder subretinal injektion som en metod för vektor leverans på grund av dess effektivitet på transducing fotoreceptorer och retinal pigment epitel (RPE) celler. Men detta är fortfarande en svår metod att bemästra, med tanke på att det görs vanligtvis av fri hand kirurgi från hornhinnans yta, och ofta förenat med grå starr, blödning och oavsiktliga retinala avskildhetar sker enkelt genom manipulation av bakre glaskroppen. Många grupper fortfarande försöka subretinal injektioner blint och leverera den virus användande manuell injektioner med relativt stor diameter rostfria nålar (34G)8,17,18,19 ,20,21,22, och några använder optisk koherenstomografi (ULT) imaging för att bekräfta korrekt leverans av vektor till näthinnan8,17, 20 , 22. några förbättringar i metoden har nyligen beskrivits med hur provtagningsutrustningen skall nålar drivs av en micromanipulator22.
Vi presenterar en integrerad strategi som hjälpmedel för positionering av nålen och injektionerna underlättas av en anpassad riktad stereo oftalmoskop utformad i labbet specifikt för att visualisera den små ögat av mus17, 23. de drog glas mikro nålar i samband med den stereotaxic micromanipulator ger bättre kontroll över nålen placering med inga kirurgiska skära ner krävs (dvs. genom konjunktiva och bindväv) före injektion. Användning av trycket regleras micro injektor hjälper leverera konsekvent injektionsvolymer och injektionen kan göras med mycket större stabilitet, precision och mycket långsammare än manuell injektioner utförs av en handhållen spruta, därmed minskar den förekomsten av bubbla injektion i ögat. Mindre nålen förhindrar läckage efter nålen uttag eftersom sökvägen är självtätande. För att bedöma omfattningen av injektion/leverans, många undersökande grupper förlita sig på att finna och bedöma areala omfattning förbättrade grön fluorescens-proteinuttryck (andra) i näthinnan (uttryck konstruktion levereras av vektorn) experimentella i slutet punkt (eutanasi) för att bekräfta lyckad injektioner11,19,20,24. Detta tillvägagångssätt (inte utnyttja OCT) för att verifiera kirurgiska framgång avfall en enorm mängd resurser i kirurgiska processuella tid och djur, eftersom alla djur med (okänd) kirurgiska fel behöver underhållas, följt med repetitiva åtgärder tills dödshjälp och ögat skörd (när andra mäts). Bekräftelse på platsen för injektion i näthinnan kan förbättras med hjälp av HR-SD-okt för att demonstrera att injektionen ligger mellan rätt lager av näthinnan (dvs subretinalområdet). HR-SD-okt kan också användas för att omedelbart avgränsa misslyckade försök (kirurgiska fel) att identifiera relevanta variabler i riktig kirurgisk tid att förbättra metoden. Vi hittade att HR-SD-okt ger många fördelar i prekliniska gen terapi studier genom att låta snabba kvantitativa utvärderingen av yttre retinal degeneration, möjliggör identifiering/utslaktning av studien djur som inte uppfyller experimentella kriterier ( t.ex. Felaktiga subretinal injektion), och att direkt uppföljning imaging att regionen i ögat där vector levererades (där prekliniska effekt är mest sannolikt) samt styra regioner där vektorn inte levererades. Sedan dess utveckling, användning av SD-okt har fortsatt att accepteras och används av oftalmologi forskare och anses nu standarden på retinal imaging i näthinnans vetenskapliga studier i musen eller gnagare modeller13,25. HR-SD-okt och dess programvara kapacitet utnyttjades i unika integrerade sätt att främja målet med framgångsrika kvantitativ genterapi i musmodeller vid varje steg i processen, inklusive djurmodell urval, karakterisering av degeneration i valda sjukdomsmodeller, terapeutiska leverans, kartläggning vektor leveranssätt och toxicitet/effekt utvärdering. Användning av HR-SD-okt möjliggör effektivare läkemedelsutveckling på varje nivå av processen. Här beskriver vi dessa metoder som används i vårt RNA Drug Discovery program.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djur protokoll var granskas och godkänns av institutionella djur vård och användning av kommittéer de VA WNY HCS och universitetet i Buffalo-SUNY. Djur användes enligt bestämmelserna i föreningen för forskning i Vision och oftalmologi (ARVO) och Helsingforsdeklarationen.
1. mus-modeller
- Identifiera musmodeller utvärderas inklusive kontroller.
Obs: Imaging utfördes för en C57BL/6(J), hC1/hC1/mWT/mWT, en delvis humaniserad näthinneförtvining musmodell homozygota för mänskliga mutant RHOP347S hC1 alleler på vild-typen (WT) mus RHO+/ + genotyp26 , 27, hC1 x BL/6(J), en delvis humaniserad modell med en enda kopia av den muterade mänskliga RHOP347S hC1 allelen på WT musen RHO+/ + genotyp (hC1 /-/ / mWT/mWT) (erhålls genom att korsa hC1/hC1/mWT/mWT med C57BL/6 ( J) möss). Den ovan autosomalt dominerande retinitis pigmentosa (adRP) modeller är den C57BL/6(J) bakgrunden. En musmodell som är homozygota för två kopior av den mänskliga WT RHO -genen på musen RHO knockout bakgrunden var också används28,29. Denna linje är den 129Sv bakgrunden. När denna linje korsades med en mus RHO knockout på 129Sv bakgrund, sker en engångsdos av mänskliga RHO på musen RHO bakgrund. - Behålla djuren efter villkor som är relevanta för experimentell design.
Obs: Djuren bibehölls i den veterinärmedicinska medicinsk enhet (VMU) på den VA WNY HCS. Möss matades standard lab chow och odlas under 12 h:12 h ljus: mörka cykler med mjuk fluorescerande overhead vita lampor med ungefärligt 300 lux vid buren nivå på cirka 72 ° f.
2. mus Eye Gel
- Förbereda den optiska gel används för retinal imaging30 och kirurgiska ingrepp.
- Kombinera 2 mg/mL volymvikt hög molekylvikt (4 x 106 g/mol karbomer sterila 1 x fosfat fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Blanda i rumstemperatur tills gelen bildar en trögflytande optiskt transparent gel.
- Överför gelen till små sterila flaskor och Centrifugera i en svängande hink bordsskiva Centrifugera vid 350 x g att ta bort instängd luftbubblor.
- Applicera gelen direkt på hornhinnan att skapa ett gränssnitt mellan mus hornhinnan och en premium skyddsglaset (18 x 18 mm).
3. HR-SD-okt Imaging
- Se enhetens HR-SD-okt (figur 1).
- Väga djuret för att bestämma den korrekta dosen bedövningsmedel. Sedan söva musen använder 25 µL/g kroppsvikt 2,5% lösning av buffrad 2,2,2-tribromoethyl alkohol (Avertin) lösning via intraperitoneal injektion (IP) och lägga till de ögondroppar för att vidga eleverna efter djuret är orörlig.
- Bekräfta att djuret är fullt anesthetized av en tå nypa, och vara säker på att djuret inte reagerar.
- Trimma morrhåren och Placera musen på HR-SD-okt släden.
- Placerar musens öga direkt framför pannsmycke linsen och manipulera kontrollerna scenen tills hornhinnan och iris är belägna. Hålla hornhinnan återfuktad genom att tillämpa konstgjorda tårar.
Obs: De finjustering micromanipulators på HR-SD-okt släden används för att placera musen så att eleven bländaren är centrerad och orienterad. Den optiska pannsmycke är sedan avancerade tills näthinnan blir synlig och djuret justeras ytterligare för att få bästa möjliga bildkvalitet. - Först, öppna programmet ”mus” och klicka ”patienten och tentamen”. Andra, klicka på ”Lägg till patient” och ange relevant information för att identifiera djuret i fönstret ny patient och ”spara och avsluta”. Tredje, klicka på ”Lägg till examen” följt av ”start examen”. Fjärde, klicka på ”Lägg till anpassad genomsökning” och välj ”rektangulär volym”, Välj OD eller OS för ögat som avbildas, klicka ”Lägg till examen”. Slutligen, börja syftar till instrumentet och positionering djuret för att få regionen av intresse. Efter att hitta rätt region, ta bort någon överflödig vätska från ögats yta med en steril bomull tippas applikatorn precis före bild förvärv för att ytterligare förbättra bildkvaliteten, klicka på ”Starta ögonblicksbild”, och om erhålls en bra bild, klicka på ”Spara Scan ”.
Obs: Typiska parametrar för rektangulära HR-SD-okt bilder är 900 a-skanningar/b-scan och 90 b-skanningar/bild. Förvärvade bilder är 1,4 x 1,4 mm. Regionen i näthinnan avbildas beror på den specifika experimentet, men de flesta bilderna är centrerade på synnervspapillen (ONH).
4. bedömningen av den närvaro, ränta och enhetlig modell yttre Retinal degeneration
- Yttre näthinneförtvining modell utvärdering av HR-SD-okt
- Få djur med ett brett spektrum av åldrar för både kontroll och experimentella ämnen att bedöma den närvaro, ränta och likformighet av yttre retinal degeneration.
- Utföra HR-SD-okt imaging på flera djur vid varje ålder från båda kohorter (sjukdom och normal). Använd den metod som beskrivs i 3.1.6 för att få OCT bilderna.
Obs: Data kan samlas in från en stor kohort av djur på en gång, som distribuerats födelsedagar som spänner över en lång tidsperiod (1 år), eller en liten kohort av djur kan användas för att samla in flera bilder över en lång tidsperiod (1 år) att få liknande resultat. - Öppna en inspelad HR-SD-okt rektangulär volym bild och identifiera den första b-scan ska mätas (helst inkluderar ONH eller andra identifierbara landmark) från ensemblen av bilder. Förstora bilden fyller upp skärmen med hjälp av zoomningsfunktionen i programvaran.
- Öppna önskat antal bromsok genom rätt klickande på bilden av b-scan och sedan klicka på ”OK” och slutligen klicka på så många bromsok som önskas (de är numrerade från 1 till 10). Säkerställa att oken dyka upp i nedre högra hörnet av bilden. Funktionen ”konfigurera bromsok”, tilldela dem alla som ”vertikala” i vinkel block kolumnen och slå på ”Display bromsok plats” att underlätta enhetlig placering över näthinnan och slutligen, klicka på tillämpa.
Obs: 1st klaven bör placeras på vänster sida av bilden vid bearbetning av oculus dexter (OD) höger öga och 1st bromsok bör placeras på höger sida av bilden vid bearbetning av oculus sinister (OS) vänster öga bilder. Detta resulterar i en nasal temporal läggning av alla data för både vänster och höger ögonen när plottning. - Med hjälp av datormusen, flytta varje bromsok till önskad plats (2,0 mm apart) över den b-scan, vara säker på att placera ett bromsok i mitten av synnervspapillen, i b-scan bilder som innehåller det (ange detta bromsok till noll). Använd sedan musen för att klicka och dra klaven till längd sträcker sig över regionen av intresse. Godtyckligt ställa bromsok som inte overlay mätbara regioner av b-Skanna till maximal längd, och ignorera under dataanalysen.
- Mät tjockleken Onlinekanaler med bromsok verktyg, genom att placera toppen av klaven på yttre begränsande membranet (ELM) och botten av klaven längst ned i det yttre plexiform lagret (OPL). Upprepa detta för varje bromsok över näthinnan i steg om 0,2 mm. Spara mätningarna.
- Efter alla bromsok har släppts ut och anpassas till storlek, högerklicka på bilden och klicka på ”Spara bromsok Data”.
- Upprepa mätningar på efterföljande b-scannar (varje 10th skanna fungerar väl) från samma rektangulära volym OCT bild som spänner över hela näthinnan från underlägsen överlägsen regioner. Bromsok bör förbli öppen och på samma plats i x-axeln. Justera längden på oken utan att flytta dem i X-riktning.
- Öppna spara datafiler genom att klicka på ikonen liten fil bredvid den bearbetade b-scan bild och klicka på ”gå till Data”. Klicka på ”datum ändrad för att ordna filerna i ordning baserat på tid sparas, och öppna alla filer för varje b-scan mätt.
- Sammanställa rådata från varje b-scan i en enda fil i ordning från lägsta till högsta baserat på bildrutenummer. Välj kolumnerna data inklusive ”bromsok namn”, ”längd” och ”Center X”.
- Se till att centret X är samma för alla b-skanningar mäts för varje rektangulär volym OCT-bild som bearbetas. Ta bort data från bromsok som inte används för att spela in mätningar och ange klaven ligger i centrum av synnervspapillen till noll.
- Plotta data för X vs flera Y datauppsättningar för att få en 3D plot-funktion för att rita Onlinekanaler totala tjocklek eller en annan mätt näthinnans skikt.
- Jämför Onlinekanaler mätningar mellan kontroll och försöksdjur med motsvarande åldrar att bestämma takt och enhetlighet för alla potentiella retinal degeneration.
- Upprepa processen för OSL mätningar med samma b-scan bilder. Följ samma metod används för att mäta Onlinekanaler, utom att placera oken mellan ELM och Bruchs membran (BM).
Obs: Ett exempel på hur du placerar klaven visas i representant Results (figur 3B). Detta bör göras på en inzoomade bilden för att minska fel. - Upprepa dataanalys för flera djur för varje födelsedag för både experimentell och kontroll kohorter.
- Omfattande mätning och 3D kartläggning av Onlinekanaler eller OSL tjockleken med verktyget programvara bromsok
- Granska post injektion OCT bilderna och anteckna alla identifierbara landmärken, såsom ONH eller blodkärlen i näthinnan. Sedan placera musen för att få en uppföljande SD-okt från samma region, och se till att inkludera samma identifierbara landmärken.
Obs: Säkerställa att regionen i näthinnan avbildas och involverade i näthinneavlossning identifieras i post injektion SD-okt bilder. Spela in en rektangulär volymavbildning SD-okt och spara den. - Bearbeta de inspelade bilderna som beskrivs ovan i steg 4.1.3. till 4.1.14. Spara bromsok data och tomt som beskrivs ovan.
Obs: Matrisen Onlinekanaler mätningar används för att skapa en 3D handling som skildrar Onlinekanaler tjocklek. Oken längs x-axeln ställning tillåter en att replot grafen utsläppande synnerven på beskärningen (0) längs x-axeln. Y-axeln ritas med hjälp av b-scan nummer och synnerven används sedan för att fastställa utgångspunkten, som tillåter en att korrekt position synnerven ursprung på y-axeln. Att identifiera synnerven i varje datauppsättning kan uppföljande bilder anpassas på ett tillförlitligt sätt.
- Granska post injektion OCT bilderna och anteckna alla identifierbara landmärken, såsom ONH eller blodkärlen i näthinnan. Sedan placera musen för att få en uppföljande SD-okt från samma region, och se till att inkludera samma identifierbara landmärken.
- Kartlägga omfattningen av injektionsstället på ögonbotten bilden
- Utföra post injektion rektangulär volym OCT bekräfta framgången för injektionen. Följa den metod som beskrivs i 3.6.
- Använda funktionen bromsok i programvaran för att identifiera en brytpunkt vid gränsen av fristående näthinnan från ett antal b-skanningar som spänner över hela OCT bilden. Använd metoden för att öppna bromsok som beskrivs i 4.1.4.
- Spela in fundus bilderna med den mappade platsen av OCT b-scan och motsvarande bromsok position på ögonbotten bilden, som motsvarar till dess läge.
- Sammanställa alla fundus bilder i en sammansatt bild, inklusive de bromsok positionerna, vilket resulterar i en exakt karta över injektionsstället på ögonbotten bilden (exempel i representant Results figur 5A).
5. intraokulära injektioner
Obs: Mer information om användning av RIS utarbetas ytterligare i en senare studie23.
- Förbereda glas injektionsnålar
- Autoklav kapillären slangar med filament i små batcher, med torr cykeln.
- Använd en pipett avdragare och set-up ett program som kommer att producera ett glas tips med den skarpaste vinkeln och en diameter i storleksordningen 2-5 µm.
Obs: Prov 5 steg program som produceras effektivt nålar på våra pipett avdragare visas i tabell 1. - Lagra drog glas nålar i en steril pipett nål burk i rumstemperatur.
- Fyll injektionsnålen med den önska lösningen för injektion
- Montera nålen i nålen hållaren, lämnar cirka 5/8 ”utskjutande bortom slutet av innehavaren.
Obs: A avståndet mindre än 5/8 ”kommer att göra det svårt nå injektionslösningen att fylla nålen, eftersom nålen innehavaren inte passar lätt i öppnandet av 0,2 mL tuber. Också, med nålen sticker ut mer än 5/8 ”resulterar i betydligt större svängning eller precession av spets, vilket gör realtid imaging svårt eftersom spetsen lämnar fokalplanet eller synfältet (FOV), samtidigt försöker punktera ögat. - Förbereda injektionslösningen i en steril 0,2 mL tub. Lägga till en 1:10 utspädning av sterila fluorescein sulfate (10 mg/mL i 1 x PBS) till injektionslösningen att få en slutlig koncentration av fluorescein vid 1 mg/mL.
Obs: Den exakta färgämne som används är specifikt för användaren och kan vara något som är giftfri och synlig för blotta ögat under vita ljus belysning för att underlätta exakt placering av nålens spets på nivån av RPE och subretinalområdet. - Visualisera nålen genom stereomikroskopet medan du använder de kontroll knopparna av en 3-axlig micromanipulator för att placera nålen så att det ligger i linje med mitten av röret som innehåller injektionslösningen ska användas för att fylla nålen.
- Kör försiktigt kanylspetsen i 0,2 mL röret tills spetsen på nålen är nedsänkt i vätska. Dra upp önskad volym injektion vätska (t.ex. 1 µL) in nålen nödvändigt för en enda injektion. Upprätthålla den återstående lösningen i röret placeras i isen.
- Montera nålen i nålen hållaren, lämnar cirka 5/8 ”utskjutande bortom slutet av innehavaren.
- Förbereda djuret för injektion
Obs: mikroskopet RIS hålls ren, och är en icke-kontakt-system. Värmeplattan är täckt med en ren adsorbent pad och nålar är Ånghärdad före dras. Efter de är dragna av en egen sterilisering uppvärmd metallremsa, hålls de i en sluten steriliserad kammare konstruerad för att hålla draget glas nålar. Nålarna kan bara hanteras med handskar på händerna och vård används för att förhindra att röra spetsen på nålen samtidigt montera den i hållaren. De injicerade lösningarna är beredda med steril teknik och testas för kontaminering av strimmor ett prov av virus förberedelserna på LB agarplattor och inkubering över natten vid 37 ˚C.- Väga djuret (g) för att bestämma lämplig dos av bedövningsmedel smärtstillande.
- Administrera bedövningsmedel (2,5% lösning buffrad 2,2,2-tribromoethyl alkohol (Avertin)) via intraperitoneal injektion (IP).
- Applicera omedelbart antikolinerga läkemedel (t.ex. cyclopentylate) i båda ögonen att vidga eleverna.
- Antalet djur med örat punch eller annan metod och trimma djurets morrhår.
- Tvätta ögat och omgivningarna med utspädda betadine.
Obs: Undvik att få någon lösning runt näsan, eftersom detta kan leda till oavsiktlig drunkning. - Placera musen på den värmedyna, hålls vid 39 ° c, i förväg gjuten Modellerarens lera mus hållare med ögat att injiceras mot nålen.
- Kontrollera att musen inte svarar med en nypa testet av hind foten.
- Utför subretinal injektion
- Använd ett par sterila trubbiga iris pincett försiktigt inducera proptosis av världen genom att placera tips av tången på 7 och 10 klockan positioner på ögonlocken och trycka öppna och nedåt samtidigt.
- Använd tången för att lirka ögonlocken under ögat världen och hålla den ur uttaget under injektionen.
Obs: Djur 10 till 14 dagar gamla kommer ofta att hålla ögat ur uttaget lättare än äldre djur. - Rikta spetsen på nålen ca 1-1,5 mm nedanför kanten av hornhinnan limbus och kör det försiktigt in i ögat genom bindhinnan tills det skapar en skleral depression som nålen tränger in i vävnaden i sklera, och tillåter manipulering av ögat.
- Rotera ögat nedåt med micromanipulator att visualisera skleral depression genom dilaterade pupillen med RIS stereomikroskopet.
- Applicera en droppe steril ögongel eller 1 x PBS lösning och täck med ett sterilt täckglas.
- Fokusera på skleral depression skapad av spetsen på nålen (2-5 µm), och driva nålen vidarebefordrar tills en skarp topp av näthinnan former vid injektionsstället.
- Rotera nålen med innehavaren tills spetsen borrar genom sklera och fluorescein i nålen syns under näthinnan i omedelbar närhet av den RPE cell enskiktslager.
- Kör spetsen på nålen så det är tangentiell till Globen, och sedan aktivera insprutningspumpen med pedal fotpedalen.
- Efter önskad volym har levererats (0.5-1 µL) till subretinalområdet, dra ut injektionsnålen och kontrollera om blåsa är stabil och att vätska inte läcker ut ur injektionsstället, som är de första kriterierna för en framgångsrik injektion.
Obs: Att upprätthålla en ordentlig spets diameter är (2-5 µm diameter) avgörande för att undvika läckage från injektionsstället. - Placera djuret på imaging plattformen av OCT instrumentet. Följ anvisningarna för HR-SD OCT Imaging för att spela in en rektangulär volymavbildning.
- Bekräfta att den injicerade vätskan ligger i subretinalområdet, och spara bilderna för att fastställa omfattningen av blåsa.
- Ta bort djuret från innehavaren och applicera en riklig mängd antibiotisk salva på injicerade ögon.
- Placera djuret på en värmedyna tills det helt återhämtar sig, sedan placera den tillbaka till den ursprungliga buren var den kom ifrån.
Obs: Våra djur är oftast injiceras innan avvänjning, måste djuren därför returneras till buren med mamman.
- Kartlägga omfattningen av den subretinal blåsa med OCT instrument programvaruverktyg.
- Få en rektangulär OCT volymavbildning, med metoderna som beskrivs tidigare i blåsa och placera den till att omfatta ett igenkännbart landmärke i ögat såsom ONH.
Obs: Inspelning 90 b-skanningar fungerar väl för att mappa blåsa, men kunde användas beroende på önskad upplösning. - Lägga till en enda bromsok i figuren och placera den på en brytpunkt där på näthinnan lossnar från RPE och åderhinnan.
Obs: Programmet Kartor automatiskt en motsvarande punkt till en linje på ögonbotten bilden representerar klaven och b-scan utvärderas. - Fånga skärmen efter placering av oken och kompilera bilderna mappa effektivt gränsa av den injektion blåsa på ögonbotten bilden, som just kartor injektionsstället. Spara den kompilerade bilden för hänvisning till hjälp för att lokalisera regionerna av intresse under uppföljning imaging.
Obs: Alternativt, bromsok data kan sparas, följt och ritade med en liknande metod för plottning 3D datauppsättningar Onlinekanaler tjocklek.
- Få en rektangulär OCT volymavbildning, med metoderna som beskrivs tidigare i blåsa och placera den till att omfatta ett igenkännbart landmärke i ögat såsom ONH.
- Intravitreal injektion
- Placera spetsen på nålen med en liknande kirurgiska metod som sub retinal injektion, förutom att nålen drivs helt genom sklera på de pars plana ca 0,25 mm bakom hornhinnan limbus och i glaskroppen.
- Efter nålen placering, gälla injektion pulsen med fotpedalen.
Obs: En snabb spridning av färgämnet fluorescein hela glaskroppen av ögonmusslan observeras, fylla dilaterad pupill bländaren med fluorescens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Att bedöma den närvaro, dosering och jämnhet vid modell yttre Retinal Degeneration
Mätningar av Onlinekanaler registrerades från OPL till Almen, definiera gränserna för den Onlinekanaler verktyget bromsok i programvaran instrument. Målet var att kartlägga utvecklingen av yttre retinal degeneration i en delvis humaniserad adRP musmodell. Jämförbara bilder från en kontroll C57BL/6(J) mus och en hC1/hC1/mWT/mWT musmodell, uttrycker två kopior av muterade mänskliga rod opsin (RHOP347S) generna, visades att uppvisa både kontroll retinal resultaten och de av en svår och snabbt progredierande retinal degenerativa tillstånd. Den 3-vecka-gammal adRP (hC1 x BL/6(J)) djur, att ha bara en enda kopia av den muterade genen för mänskliga RHOP347S och två kopior av mus WT RHO generna, hade nära normala Onlinekanaler tjocklek. Dock File uppföljande HR-SD-ULT på 10 och 37 veckor visade temporally progressiva och rumsligt enhetlig näthinneförtvining som resulterade i cirka 60% förlust av fotoreceptorer erkänd som Onlinekanaler gallring över denna tidsram. I hC1 x BL/6(J) adRP modell har retinal degeneration en ungefärlig tidskonstant (1/e) på 13 veckor. Homozygot hC1 djur, med två doser av den giftiga muterade mänskliga transgenens på musen WT RHO bakgrund, drabbas av en mycket mer snabb degeneration framgår av omfattande retinal gallring och i huvudsak komplett förlusten av alla fotoreceptorer av 3 veckors ålder (figur 2).
Onlinekanaler åtgärden är endast en komponent av yttre retinal normalitet som ett index av ljusmätare vitalitet. OSL av fotoreceptorer och inre segment/yttre segmentet (IS / OS) linje eller ellipsoid lämna bevis till stöd för både ljusmätare vitalitet och funktion. Jämförelser i djur som har fötts till innehålla antingen en (N129R - x 129R-) eller två (2HRho 1T1T) kopior (doser) av de mänskliga WT RHO generna på mus WT RHO knockout bakgrunden mättes för yttre näthinnan tjocklek. En statistiskt signifikant ökning av ~ 8 µm i Onlinekanaler observerades hos möss med två kopior av genen för mänskliga WT RHO jämfört med möss med bara en kopia av den mänskliga genen. En statistiskt signifikant ökning av ~ 5 µm i OSL observerades hos möss med två vs. en kopia av den mänskliga WT RHO -genen på mus WT RHO knockout bakgrunden. Ett exempel på hur Onlinekanaler och OSL mätningar gjordes visas i figur 3. Den höga upplösningen av de bilder som tagits med HR-SD-okt systemet tillåta noggranna mätningar av Onlinekanaler eller OSL tillåter diskriminering av små skillnader med solid statistisk tillförlitlighet i humaniserad WT RHO musmodeller.
Utbud av kirurgiska resultat detaljerad ULT när försöker Subretinal injektion
HR-SD-okt utvärdering av försök subretinal injektioner gav en mängd resultat. Först var den vanligaste erfarenheten bekräftelse på att den injicerade vätskan var framgångsrikt levererat inom sub retinal utrymmet. Öppnandet av implicita subretinalområdet (som stänger under utveckling) skapade en blåsa som kan visualiseras tydligt både i vyn sv ansikte HR-SD-ULT och i b-scan images. Hypo-reflekterande vätskan kantades av neurala näthinnan ovan och det hyper-reflekterande RPE celllagrar fortfarande motståndare till BM, nedan (figur 4). Omfattningen av subretinal injektionen kan bestämmas om djuret fotograferades av HR-SD-okt omedelbart efter injektion (se nedan). Andra injektionen kan uppstå i koroidal utrymmet (under BM) snarare än i subretinalområdet. Detta resulterade i en hyper-reflekterande skikt (RPE) avgränsar kupolen i regionen vätska-fördrivna i näthinnan, och ingen hyper-reflektionsförmåga vid den bakre gränsvärden i ögat i ULT b-skanningar. Tredje, ett annat potentiella resultat som kan inträffa vid försök subretinal injektion var en retinal schisis (uppdelning) nerv fiber lagret. Detta resultat gav en normal yttre näthinnan anatomi, men det inre lagret av näthinnan inkapslade det blåsa, som kan eller kan inte har invaderat glaskroppen. I princip sådant schisis mönster kunde uppstå med injektion var som helst inom laminations av neurala näthinnan korrekt, men vi har bara sett nervfiber skikt schisis hittills. För det fjärde en intravitreal injektion kan också förekomma, som har ingen inverkan på ULT. Alla dessa misslyckanden resultera från den inledande felplacering av spetsen på nålen glas, eller kanske några små vinkar av nålen vid injektion, på grund av lyfthöjden switched flöde injektion enhetens.
Karaktärisera placeringen av Subretinal injektion
En avgörande faktor vid fastställandet av effekt eller toxicitet av kandidat terapier är möjligheten att jämföra retinal regioner som har fått vektor vs dem som inte har. Vi riktade betydande ansträngningar på att utveckla ett sätt att markera regionen i näthinnan inblandade i subretinal injektionerna så att vid uppföljande undersökningar, vi kunde identifiera areala omfattningen av näthinnan där terapier tillämpades, och därmed där transduktion var genomförbart. Guld NPs får en hög nivå av förtroende för att identifiera regioner av näthinnan som var eller var inte injiceras. Dock föreföll särskilda partiklarna eller deras formulering vara giftiga och resulterade i en svår lokaliserade näthinneförtvining på platsen av subretinal injektion av 24 timmar efter injektionen (inga data anges). Därför utvecklade vi en alternativ metod för att kartlägga injektionsstället direkt från HR-SD-okt imaging data. En metod för att exakt identifiera injektion webbplats gränserna utvecklades med hjälp av mätning verktyg (bromsok) i programpaketet av instrumentet (figur 5). Vi kunde identifiera kanten av blåsa just genom att undersöka enskilda b-skanning (från underlägsen överlägsen näthinnan) används för att skapa bildens fundus. När du placerar ett bromsok vid den punkt där blåsa korsar bifogade näthinnan, mappas positionen för klaven automatiskt till motsvarande b-genomsökning av sv ansikte fundus bilden på den exakta positionen längs x-axeln där klaven var placeras på b-scan. Upprepa denna process gör att man kan spåra kanten av blåsa på ett eget ansikte fundus bild. Justeringsprocessen kräver att likartade regioner av näthinnan är avbildade varje gång, i förhållande till konstant synnerven huvud, och bilder kan behöva roteras om du vill justera de retinala blodkärl från flera bilder innan data segregation. Efter justeringsprocessen post injektion bild och efterföljande uppföljande bilder var regionen injektion överlagrade över data point grid att identifiera placeringen av mätningarna inom regionen som deltar i näthinneavlossning. Denna data kan ritas som en surface karta, som gav ett visuellt verktyg för att identifiera datapunkter inklusive injektionsstället i förhållande till regioner utanför injektionsstället.
Kartläggning Onlinekanaler tjockleken i 3D
Slutligen vi spela in mätningar av Onlinekanaler, OSL eller andra retinala lagren från hela regionen för hela avbildad i näthinnan, och sedan rita data med hjälp av en surface tomt (figur 5). Överlagras gränsen karta över injektionsstället tillåter åtskillnad av de två datauppsättningarna, inklusive regionen injicerade och regionen som inte var fristående under injektionen. Ytterligare kan bearbetning och dataanalys sedan utföras på dessa två datauppsättningar för att testa hypoteser att specifika terapeutiska medel kan rädda retinal degeneration eller framkalla toxicitet. Detta tillvägagångssätt potentiellt möjliggör experimentella och kontrollera data ska samlas in från en enda öga, jämföra injicerade vs icke-injiceras regioner i samma öga.
Figur 1 : UHR-SD-okt enhet. HR-SD-okt enheten används visas. Instrumentet racket (A) innehåller datorskärmen (en), tangentbordet och musen (b), rutan sonden gränssnitt (c), OCT motorn (d), datorn (e), manöverorganet för den super självlysande utsändande av dioder (infraröd) (f), och avbrottsfri leverans (g). Den optiska bänken (B) innehåller imaging sonden optiska huvudet (för mus näthinnan) (h), multi-axlig (linjär och roterande) manipulatorn (jag) och en mus ämne (j). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Progressiv yttre Retinal Degeneration i delvis humaniserad adRP modell mätt som HR-SD-okt (A) HR-SD-okt bilder av näthinnan erhölls för adRP modellen (hC1 x BL/6 J) vid olika åldrar, C57BL/6(J) kontroll på 14 veckor och homozygot hC1 mutant linjen på 3 veckor. Yttre näthinnan hade ett normalt utseende på 3 veckor i adRP modellen, men det fanns tecken på progressiv Onlinekanaler gallring och oordning vid och bortom 10 veckors ålder. Av 37 veckor, den (hC1 x BL/6(J)) visat omfattande yttre retinal degeneration. Alla OCT skanningar var i närhet av synnerven. (B), ONL tjocklek (i mm) längs vågrätt axeln genom synnerven var ritade för kontroll (C57BL/6(J)), hC1 och adRP djur i olika åldrar. Det var progressiv förlust av Onlinekanaler tjocklek i delvis humaniserad adRP modellen. Onlinekanaler förlust var större än 60% av 37 veckor ålder. Felstaplar = standardavvikelsen för medelvärdet. Röd skalstapeln = 200 µm och alla bilder är samma skala. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Kvantitativa mått av yttre nukleära lagret och yttre segment längd med HR-SD-okt (A) mus linjer används för att demonstrera Onlinekanaler och OSL åtgärder. Representant OCT bilder från 2HRho1T/1T (2 doser HRho) på mus RHO knockout bakgrund) (vänster panel) och N129R - x 129R-(en dos mänskliga RHO på mus RHO knockout bakgrund) (höger panel). (B) visas ett exempel på hur bromsok placerades för att mäta Onlinekanaler (röd) och OSL (blå). (C) data erhållits från tre djur av varje rad för Onlinekanaler tjocklek var ritade i stapeldiagram format visar jämförelse av 2HRho1T/1T linje och N129R - x 129R-(till vänster). 2HRho1T/1T raden har ~ 8 µm tjockare Onlinekanaler. För att Visa skillnader i OSL, gjordes flera mätningar (sju) från en b-scan från varje mus linje från Almen till BM som i B (blå linje) i 9 veckor gamla djur (höger panel). Detta visade en ~ 5 µm skillnad i OSL mellan djur med 1 vs 2 kopior av genen HRho. Både Onlinekanaler och OSL åtgärderna var statistiskt signifikant, ONL p-värde = 1.7e-5 och OSL p-värde = 6.4e-5. Felstaplar = standardavvikelsen för medelvärdet. Röd skalstapeln = 100 µm båda b-skannar i 3A har samma skala, 3B zoomas att förbättra tydligheten i de retinala lagrarna och tillhandahålla en kvalitativ demonstration av hur mätningarna anskaffades. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Typer av intraokulära injektioner hos möss som identifierats av HR-SD-okt (A). A (hC1xBL/6(J)) mus injicerades med ~ 1 µL av vätska via Inferonasal transcleral transchoroidal injektion. Den resulterande näthinneavlossning ses som grön lägre rätt region i sv ansikte bilden, skapar en skarp kant i framkant av blåsa på höger sida av bilden. OCT fundus bilden av ett injektionsställe uppvisar endast subtila skillnader beroende på placeringen av vätska fylld hålighet, eftersom bilden är en sammanställning av alla b-skanning från hela retinal tjocklek. Dessutom ändras de injektion blåsa distansera av näthinnans yta från den OCT pannsmycke, producerar en ofokuserad region vid injektionsstället. (B) OCT b-skanningen av en icke-injiceras näthinnan demonstreras. ONH är märkt. (C) en subretinal injektion demonstreras. ONH är märkt och pilarna i bilden sv ansikte (rätt panelerna) visar den bakre gränsen av avskildheten. (D) ett koroidal injektion demonstreras med en tydlig höjd (uppåtgående förskjutning) av RPE lagret (hyper-reflekterande kurva) på den nedre gränsen av näthinnan (pilar) och betydande förlust av hyper-reflektionsförmåga av RPE och koroidea lager nedan den injicerade vätskan. Jämföra pilar i bilder (C vs. D). (E) A retinala schisis demonstreras nära nerv fiber lagret. Observera den mycket tunn hyper-reflekterande membran kapsla in den injicerade vätskan, medan den näthinna förblir kopplad till RPE. Subtila skillnader mellan de tre olika detachement kan också visualiseras i sv ansikte bilder (C, D, och E). Subretinal avskildheten har en kantlinje som är svår att visualisera (pilar i C), medan koroidal injektionen skapar en suddig hyper reflekterande kant i framkant av blåsa, och den retinala schisis framgår av den skarpa avgränsningen av dess framkant (E). Både röd skala barer = 200 µm i 4B. Alla bilder 4B genom 4E skalas lika. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Kartläggning och kvantifiering av yttre retinala förändringar efter Subretinal injektion. En metod har utvecklats för att identifiera områden av intresse vid uppföljande granskning av möss som hade subretinal injektion av vektor, med 3D-plottning av Onlinekanaler mätningar från flera OCT b-skanningar. En 2HRho1T/1T djur injicerades med en self-kompletterande adeno-associerade virus att uttrycka både god Jordbrukarsed och den ledande kandidaten hammerhead ribozyme (scAAV-GFP ad6 hhRz 725) (OS öga) i en toxicitet skärm. (A) Imaged omedelbart efter, areala omfattningen av injektionen mappades genom att placera bromsok i framkanten av blåsa vid den punkt där de yttersta segmenten separera från RPE i b-skanningar (vänstra panelen (röda bromsok)). Placeringen av verktyget bromsok mappas automatiskt till fundus bilden, och detta upprepas och sammanställt för så många b-skanningar som behövs, som är beroende av önskad upplösning (varje 5th scan (A), (höger panel)). Efterföljande OCT studier (varannan vecka) avbildas samma område i näthinnan till tillåta överlagring; de ONH och retinala blodkärl är sevärdheter att underlätta de kartesiska eller roterande justeringarna. Hela regionen av näthinnan mättes för Onlinekanaler tjocklek förutsatt krävs gränserna (OPL och ELM) var synliga. (B) att kartlägga Onlinekanaler längden över injicerade ytan bromsok positioner (färgkodade) igen mappas på ögonbotten bilden och sammanställas i en sammansatt bild. Varje 5th b-scan från OCT bilder mättes med inbyggda bromsok på upp till tio punkter över näthinnan. (C) före och efter kompilerade bilder roteras, använda bildprogram för att anpassa retinala blodkärlen, vilket gör datapunkter inom fristående näthinnans regionen näthinnan måste identifieras genom bild överlägg och separerade. (D), data som är mappade till ett tabellformat, identisk med fundus bild matrisen, och indelade i två grupper (mätningar inom blåsa (röda höjdpunkter) och de som inte är). (E) Data presenteras med hjälp av en 3D yta plotting huvudnummer, vilken tillåt visualisering av Onlinekanaler tjocklek över hela avbildad regionen. Detta tillåter bedömning av kvantitativa skillnader mellan regionerna injicerade och icke-injiceras i ögat. Skreva i 3D tomten (E) ger ett bekvämt sätt att segregera datauppsättningen Onlinekanaler mätningar inom regionen i fristående näthinnan från regionen som förblev knuten omedelbart efter injektion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1: Program som används för att dra glas nålar. Programparametrarna att uppnå glas nålar användbar för subretinala genom trans-skleral, transchoroidal synsätt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HR-SD-okt ger en enkel metod för karakterisering av potentiella djurmodeller av mänskliga sjukdomar att bestämma deras användbarhet i testning potentiella therapeutics. Förmågan att snabbt och tillförlitligt karakterisera en potentiell djurmodell av mänskliga sjukdomar är avgörande för processen för terapeutiska läkemedelsutveckling (t.ex., ersättare genterapi, ribozym eller shRNA knockdown genterapi, kombinerade genterapi). HR-SD-okt ger en enkel, snabb och icke-invasiv metod för att utvärdera retinal hälsa som kan användas för att karakterisera och övervaka utvecklingen av retinal degeneration i nästan alla musmodell. OCT bilderna kan användas för att få mätningar av någon eller alla av de olika lagren av näthinnan, som kan ge en detaljerad bedömning av en yttre retinal (ljusmätare) degeneration över tid eller effekterna av terapeutiska räddnings försök på degeneration omfattning eller kinetiska tidslinje. HR-SD-okt kan också användas för att bedöma toxiciteten av levererade vektor- eller material. Den mest betydande inverkan på en ljusmätare näthinneförtvining forskningsprogram är förmågan att göra raffinerade mätningar av Onlinekanaler över tid med levande djur. Man kan rita en retinal degeneration tidslinje till extraktet en tidskonstant, vilket är ett viktigt första steg att utvärdera effekt och toxicitet av kandidat therapeutics i samma modeller över en temporal fönster av terapeutiska möjligheter. Denna teknik möjliggör också betydande besparingar på värdefulla resurser (djur och tid) i förhållande till klassiskt endpoint histologi genom att forskaren att identifiera avvikelser i djurens kohorten innan du anger en studie och eliminera djur som inte uppfyller experimentella kriterier (t.ex., framgångsrik subretinal leverans).
Behovet av exakt leverans av vissa therapeutics i subretinalområdet på möss är utmanande och HR-SD-okt ger en noggrann visuell bekräftelse av framgångsrika subretinal injektioner som ett kriterium för pågående införande av djur i den preklinisk studiedesign. Omfattande arbete krävs ofta följa djur injiceras i gen terapi studier över tid, eftersom dessa modeller ofta simulera människors retinala degenerativa sjukdomar där sjukdomen tidslinjer dyka upp under decennier. Många uppföljande undersökningar krävs att bestämma terapeutisk effekt eller att bedöma toxiciteten. En lösning på detta kritiska utmaningen är att ha förmågan att identifiera och ta bort djuren från studiedesigner, som är kirurgisk misslyckanden för leverans av terapeutiska vektorn. Förmåga att leverera en framgångsrik injektion för en välutbildad tekniker med mångårig erfarenhet har närmat sig 90% om injicerar ett öga per djur, och cirka 80% framgång om injektionen båda ögonen. Med denna verkningsgrad är borttagning från studiedesign av djur med misslyckade injektioner fördelaktiga för hypotesprövning. Detta inte bara sparar kritisk tid men också tillåter mer konsekventa och förutsägbara resultat. Dessutom HR-SD-okt gör att man kan minska antalen djur som krävs för någon ett experiment genom att låta samma djur följas över tid, vilket minskar djur-till-djur variationen inom både experimentell och kontrollerar grupper och tillåter mer robust statistisk utvärdering av hypoteser om potentiella effekt och toxicitet av kandidat therapeutics.
Omfattningen av retinal täckning av subretinal injektion är normalt inte 100%, som kan vara giftiga31,32,33,34. Därav, förmågan att skilja mellan Sensorik och icke-sensorik regionerna är avgörande för korrekt testning av hypoteser av räddnings- och toxicitet för en given kandidat terapeutiska. Kreativ användning av tillgänglig programvaruverktyg möjliggör exakt kartläggning av subretinal injektioner i möss. Den omedelbara avbildning av injicerade ögat ger riktning för uppföljande avbildning till regioner av intresse och möjligheten att jämföra regioner som har varit sensorik till regioner som inte har behandlats inom samma världen. Beroende på mappning precision önskas, den här processen kan utföras för varje b-scan eller regelbundet provtagning från ensemblen av b-skanningar samlade omedelbart efter injektionen och sammanställa alla fundus bilder till en enda bild med grafik programvara så som den styckevis kontinuerlig gränsen är noggrant mappad på ögonbotten bilden. Jämföra bilder från omedelbart efter injektion till uppföljande bilder kräver att bilderna anpassas så att mätpositioner kan mappas på ögonbotten bilden och datapunkterna kan uppdelas i injektionsstället och icke-injiceras regioner av den näthinnan. Kartläggning av synnervspapillen och retinala blodkärl kan också åstadkommas med detta samma metodik, vilket underlättar orienteringen i ögat när du försöker anpassa bilderna efter injektion med efterföljande uppföljande bilder. Denna information kan användas i efterföljande imaging identifiera regionen i näthinnan där injektionen hade inträffat. Naturligtvis, när djuren är euthanized, kan platsen för andra uttryck, levereras av en AAV vektor som också innehåller en kandidat terapeutisk gen (t.ex., ribozym), också användas att jämföra platsen för transduktion med arealen av bild kartläggning som förlitar sig på platsen för blodkärlen. Detta gör att identifiering av diffusion av vektor i därefter stängt subretinalområdet utöver områden av anatomiska lösgörande.
Vår framgång med att använda guld NPs att märka den subretinal blåsa var begränsad på grund av toxicitet framkallas av använt material. Vi vill uppmuntra ytterligare utredning av sådant material att märka omfattningen av subretinal blebs, om alternativa preparat (varierande dimensioner, ytmodifieringar) kan hittas som inte framkalla toxicitet.
HR-SD-ULT ger en enorm mängd information med betydligt mindre tid och resurser, och kan vara quantitated för att ge mer information om effekt och toxicitet av potentiella therapeutics jämfört med traditionella metoder som histologi. Användningen av denna teknik gör det möjligt för forskaren att lindra en av de svåra flaskhalsarna i prekliniska retinal drug discovery35. Musen RIS och HR-SD-okt är kraftfulla verktyg för stöd prekliniska retinal gen terapi studier som en del av vårt RNA Drug Discovery program. Dessa verktyg kan användas i stort sett.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Kommersiella relationer: MCB: None; JMS: ingen. Den retinal imaging system (RIS)23 används i denna studie är en ny enhet till betydande nytta för någon grupp som söker gen terapi leverans studier i möss, gnagare eller små djur. Även om författarna har inga konflikter att deklarera med avseende på denna enhet vid denna tid, universitetet i Buffalo - SUNY och Veterans Administration har rättigheter till immateriell egendom och begära att kommersialisera instrumentet i framtiden.
Acknowledgments
Detta material bygger på arbete som stöds, delvis av institutionen av veteraner frågor (VA), Veterans Health Administration, kontor för forskning och utveckling (biomedicinsk laboratorieforskning och utveckling) (VA Merit Grant 1I01BX000669). JMS är anställd, delvis som personalen läkare-forskare, oftalmologi, VA WNY; MCB är anställd, delvis av VA WNY. Studien genomfördes på, och delvis med stöd av Veterans Administration Western New York hälso-systemet (Buffalo, NY). Innehållet representerar inte åsikter Department of Veterans Affairs eller Förenta staternas regering. Stödde också, i större delen av NIH/NEI R01 bevilja EY013433 (PI: JMS), NIH/NEI R24 bevilja EY016662 (UB Vision infrastruktur Center, PI: M slakt, direktör - Biofotonik Module: JMS), ett fritt bidrag till avdelningen för oftalmologi/universitetet i Buffalo från forskning till förhindra blindhet (New York, NY), och ett bidrag från stiftelsen Oishei (Buffalo, NY). Vi erkänner gåva hC1 transgena RHOP347S linjen och exon 1 musen RHO knockout från Dr. Janis Lem (Tufts New England Medical Center, Boston, MA), och gåvan av NHR-E transgenens modellen i heterozygot staten på den mus exon 2 RHO knockout bakgrund från Drs. G. Jane Farrar och Peter Humphries (Trinity College, Dublin, Irland).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL6 (J) | Jackson Laboratories | 664 | |
| N129R- | N/A | N/A | |
| 2HRho 1T/1T | N/A | N/A | |
| Envisu R-2200 Ocular Coherence Tomography Instrument (OCT) | Bioptigen | 90-R2200-U1-120. | |
| Retinal Imaging System (RIS) | In-house | N/A | |
| Stemi 2000C Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
| P-97 Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co | p-97 | |
| MMN-33 micro manipulator | Narishige USA | MMN-33 | |
| PLI-100 micro injector | Harvard Apparatus | 64-1736 | |
| Micropipette Holder (Rotating) | In-house | N/A | |
| Micropipette Storage Receptacle | World Precision Instruments Inc. | E210 | |
| Borosilicate glass capillary tubes 1.5-1.8 X 100mm, | Harvard Apparatus | 30-0053 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol | SIGMA Aldrich | T48402-25G | |
| Tert-amyl Alcohol | SIGMA Aldrich | 240486-100ML | |
| Atropine Sulfate Ophthalmic Solution, USP 1% | Akorn Inc. | NDC 17478-215-05 | |
| Goniovisc | BioVision Limited | NDC 17238-610-15 | |
| Cyclopentolate Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP 2% | Akorn Inc. | NDC 17478-097-10 | |
| Gentamicin Sulfate Ointment USP, 0.1% | Perigo | NDC 45802-046-35 | |
| Systane Ultra | Alcon Laboratories, Inc. | 9006619-1013 | |
| Tetracaine Hydrochloride | Bausch and Lomb | NDC 24208-920-64 | |
| Ophthalmic Solution, USP 0.5% | Bausch and Lomb | NDC 24208-920-64 | |
| DPBS | Gibco Life Technologies | 14190-136 | |
| Virus Preparations | ViGene /UNC | N/A | |
| Gold nanorods | NANOPARTz | D12M-850-1.75 | |
| Fluorescein Sulfate AK-FLUOR 25% | Akorn Inc. | NDC 17478-250-20 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-A | |
| Forceps | Milton | 18-825 | |
| Needles 30 guage | Beckton Dickenson | W11604 | |
| Syringes | Beckton Dickenson | 309659 | |
| Bioptigen software Package | Bioptigen | N/A | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP 0.5% | Akorn Inc. | NDC 17478-263-12 | |
| Windows Excel | Microsoft | N/A | |
| Adobe Illustrator | Adobe | ||
| Scale | Mettler | ||
| Scissors | World Precision Instruments | ||
| Ear punch | Nat’l band | ||
| CL 100 Light source | Welch Allyn | CL100 | |
| Nitrogen Gas | Jackson Welding Supply | N/A | |
| Heated Water bath | Neslab | RTE-140 | |
| Heating plate | In House | N/A | |
| Heating mat | Cincinnatti Sub Zero | 273 | |
| Clay mouse holder | Plast.i.clay American Art Clay Co. | N/A | |
| Betadine | MedLine | NDC53329-938-06 | |
| Cotton Tip Applicators | American Health Service | Ctag | |
| EtOH 70% | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
| Gloves Nitrile | VWR | 89038-272 | |
| Diagnosys ERG Color Dome instrument | Diagnosys Inc. | D125 | |
| Contact lenses | In-house | N/A | |
| Diagnosys Software | Diagnosys Inc. | N/A | |
| Origin 6.1 software | OriginLab Corp. | N/A | |
| Reference electrodes | Ocuscience | F-Thread Electrode (DTL) 24” |
References
- Regus-Leidig, H., et al. In-vivo knockdown of Piccolino disrupts presynaptic ribbon morphology in mouse photoreceptor synapses. Front Cell Neurosci. 8 (259), 1-13 (2014).
- Jiang, L., Frederick, J. M., Baehr, W. RNA interference gene therapy in dominant retinitis pigmentosa and cone-rod dystrophy mouse models caused by GCAP1 mutations. Front Mol Neurosci. 7 (25), 1-8 (2014).
- Seo, S., et al. Subretinal gene therapy of mice with Bardet-Beidl Syndrome Type-1. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (9), 6118-6132 (2013).
- Molday, L. L., et al. RD3 gene delivery restores guanylate cyclase localization and rescues photoreceptors in the RD3 mouse model of Leber congenital amaurosis 12. Hum. Mol. Genet. 22 (19), 3894-3905 (2014).
- Pang, J. J., et al. AAV-mediated gene therapy in mouse models of recessive retinal degeneration. Curr. Mol. Med. (3), 316-330 (2012).
- Vandenberghe, L. H., Auricchio, A. Novel adeno-associated viral vectors for retinal gene therapies. Gene Ther. 19 (2), 162-168 (2012).
- Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors. Curr. Gene Ther. 3 (6), 545-565 (2003).
- Parikh, S., Le, A., Davenport, J., Gorin, M. B., Nusinowitz, S., Matynia, A. An alternative and validated injection method for accessing the subretinal space via a transcleral posterior approach. J. Vis. Exp. (118), e54808 (2016).
- Bainbridge, J. W. B., Mistry, A. R., Thrasher, A. J., Ali, R. R. Gene therapy for ocular angiogenesis. Clinical Science. 104, 561-575 (2003).
- Igarashi, T., Miyake, K., Asakawa, N., Miyake, N., Shimada, T., Takahashi, H. Direct comparison of administration routes for AAV-8 mediated ocular gene therapy. Curr. Eye Res. 38 (5), 569-577 (2013).
- Bennett, J., Duan, D., Engelhardt, J. F., Maguire, A. M. Real-time noninvasive in vivo.assessment of adeno-associated virus-mediated retinal transduction. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 38, 2857-2863 (1997).
- Ruggeri, M., et al. In vivo three-dimensional high-resolution imaging of the rodent retinal with spectral-domain optical coherence tomography. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48 (4), 1808-1814 (2007).
- Berger, A., et al. Spectral domain optical coherence tomography of the rodent eye: highlighting layers of the outer retina using signal averaging and comparison with histology. PLoS One. 9 (5), 96494 (2014).
- Dysli, C., Enzmann, V., Sznitman, R., Zinkernagel, M. S. Quantitative analysis of mouse retinal layers using automated segmentation of spectral domain optical coherence tomography images. TVST. 4 (4), 9 (2015).
- Bhootada, Y., Choudhury, S., Gully, C., Gorbatyuk, M. Targeting caspase-12 to preserve vision in mice with inherited retinal degeneration. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56, 4725-4733 (2015).
- Wert, K. J., Skeie, J. M., Davis, R. J., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye. J. Vis. Exp. (69), e4286 (2012).
- Berger, A., al,, et al. Spectral-domain optical coherence tomography of the rodent eye: highlighting layers of the outer retina using signal averaging and comparison with histology. PLoSOne. 9 (5), 96494 (2014).
- Muhlfriedel, R., Michalakis, S., Garrido, M. G., Biel, M., Seeliger, M. W. Optimized technique for subretinal injections in mice. Methods in Molecular Biology. , Clifton, NJ. (2013).
- Sarra, G. M., et al. Kinetics of transgene expression in mouse retina following subretinal injection of recombinant adeno-associated virus. Vision Res. 42, 541-549 (2002).
- Yan, Q. I., et al. Trans-corneal subretinal injection in mice and its effect on the function and morphology of the retina. PLoS One. 10 (8), 0136523 (2015).
- Park, S. W., Kim, J. H., Park, W. J., Kim, J. H. Limbal approach-subretinal injection of viral vectors for gene therapy in mice retinal pigment epithelium. J. Vis. Exp. (102), e53030 (2015).
- Westenskow, P. D., et al. Performing subretinal injections in rodents to deliver retinal pigment epithelium cells in suspension. J. Vis. Exp. (95), e52247 (2015).
- Butler, M. C., Sullivan, J. M. A novel, real-time, in vivo mouse retinal imaging system. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56 (12), 7159-7168 (2015).
- Rolling, F., et al. Evaluation of adeno-associated virus-mediated gene transfer into the rat retina by clinical fluorescence photography. Hum. Gene Ther. 10, 641-648 (1999).
- Ferguson, L. R., Grover, S., Dominguez, J. M., Balaiya, S., Chalam, K. V. Retinal thickness measurement obtained with spectral domain optical coherence tomography assisted optical biopsy accurately correlates with ex vivo histology. PLoS One. 9 (10), 111203 (2014).
- Li, T., Snyder, W. K., Olsson, J. E., Dryja, T. P. Transgenic mice carrying the dominant rhodopsin mutation P347S: evidence for defective vectorial transport of rhodopsin to the outer segments. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 14176-14181 (1996).
- Brill, E., et al. A novel form of transducin-dependent retinal degeneration: accelerated retinal degeneration in the absence of rod transducing. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48, 5445-5453 (2007).
- Olsson, J. E., et al. Transgenic mice with a rhodopsin mutation (Pro23His): a mouse model of autosomal dominant retinitis pigmentosa. Neuron. 9, 815-830 (1992).
- Humphries, M. M., et al. Retinopathy induced in mice by targeted disruption of the rhodopsin gene. Nat. Genet. 15, 216-219 (1997).
- Hruby, K. Clinical examination of the vitreous body. Proc. Roy. Soc. Med. 47, 163-170 (1953).
- Kolniak, T. A., Sullivan, J. M. cell-based toxicity screen of potentially therapeutic post-transcriptional gene silencing agents. Experimental Eye Research. 92, 328-337 (2011).
- Qi, Y., et al. Trans-corneal subretinal injection in mice and its effect on the function and morphology of the retina. PLoS One. 10 (8), 0136523 (2015).
- Timmers, A. M., Zhang, H., Squitieri, A., Gonzalez-Pola, C. Subretinal injections in rodent eyes: effects on electrophysiology and histology of rat retina. Mol. Vis. 7, 131-137 (2000).
- Johnson, C. J., Berglin, L., Chrenek, M. A., Redmond, T. M., Boatright, J. H., Nickerson, J. M. Technical brief: subretinal injection and electroporation into adult mouse eyes. Mol. Vis. 14, 2211-2226 (2008).
- Sullivan, J. M., Yau, E. H., Taggart, R. T., Butler, M. C., Kolniak, T. A. Bottlenecks in development of therapeutic post-transcriptional gene silencing agents. Vision Res. 48, 453-469 (2008).
