Summary
Her viser vi en ny tilnærming til å bruke høy oppløsning spectral domener optical coherence tomografi (HR-SD-oktober) å hjelpe levering av gene terapi agenter i subretinal plass, vurdere dekningen areal og karakteriserer photoreceptor vitalitet.
Abstract
HR-SD-oktober benyttes å overvåke utviklingen av photoreceptor degenerasjon i levende mus modeller, vurdere levering av terapeutiske agenter i subretinal plass, og å vurdere toksisitet og effekt i vivo. HR-SD-oktober bruker nær infrarødt lys (800-880 nm) og har optikk spesielt utviklet for unike optikk musen øyet med sub-2-mikron aksial oppløsning. Transgene musen modeller av ytre retinal (photoreceptor) degenerasjon og kontroller ble fotografert for å vurdere sykdomsprogresjon. Trakk glass microneedles ble brukt til å levere sub retinal injeksjoner av adeno-assosiert virus (AAV) eller nanopartikler (NP) via en trans-Innbukking og trans-choroidal tilnærming. Nøye plassering av nålen i subretinal plass var nødvendig før en kalibrert trykk injeksjon, som leverer væske inn i sub retinal plass. Sanntid subretinal operasjonen ble utført på vår retinal imaging system (RIS). HR-SD-oktober vist progressiv uniform retinal degenerasjon på grunn av uttrykk for en giftig mutant menneskelige mutant rhodopsin (P347S) (RHOP347S) transgene i mus. HR-SD-oktober kan strenge kvantifisering av alle retinal lagene. Ytre kjernefysiske lag (bare) tykkelse og photoreceptor ytre segmentet (OSL) lengdemål korrelerer med photoreceptor vitalitet, degenerasjon eller redning. RIS leveringssystemet gir sanntids visualisering av subretinal injeksjoner i neonatal (~ P10-14) eller voksen mus og HR-SD-oktober umiddelbart avgjør suksessen til levering og kart areal grad. HR-SD-oktober er et kraftig verktøy som kan evaluere hvor vellykket subretinal kirurgi i mus, i tillegg til å måle vitalitet av fotoreseptorer i vivo. HR-SD-oktober kan også brukes til å identifisere uniform dyr kohorter å vurdere omfanget av retinal degenerasjon, giftighet og terapeutiske redning i preklinisk gene terapi forskningsstudier.
Introduction
Forskere utvikler gen-terapi for en rekke netthinnen og netthinnens degenerative sykdommer med håp om å oversette romanen therapeutics til behandlinger for menneskelig sykdom1,2,3,4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. tid domenet eller spektrale domene optical coherence tomografi (SD-oktober) er brukt til å undersøke aspekter av ytre retinal degenerasjon i bestemte musen modeller av sykdom12,13,14 . HR-SD-oktober er ikke, men mye brukt i forbindelse med optimalisering evaluering av musen modeller for å bestemme hastigheten og romlig sıtt retinal degenerasjon, eller i forbindelse med prekliniske evaluering av genet basert therapeutics, for eksempel til vurdere redning, toksisitet eller romlige omfanget av vektor levering8,15,16. Når en musemodell er fullt preget, kan HR-SD-oktober dataene tjene som en informativ og pålitelig ressurs å måle virkningen av therapeutics å utøve redning eller toksisitet i musen modeller retinal degenerasjon17. Mange grupper bruker subretinal injeksjon som vektor levering på grunn av sin effektivitet på transducing fotoreseptorer og netthinnens pigment epitel (RPE) celler. Men dette er fortsatt en vanskelig metode å mestre, gitt at det utføres vanligvis av fri hånd kirurgi fra hornhinnen overflaten, og er ofte fylt med cataracts, blødning og utilsiktede retinal detachments forekommer ved manipulering av bakre glasslegemet. Mange grupper fremdeles prøver subretinal injeksjoner blindt og levere viruset benytter manuell injeksjoner med relativt stor diameter rustfritt stål nåler (34G)8,17,18,19 ,20,21,22og noen bruker optical coherence tomografi (OCT) for å bekrefte riktig levering av vektor netthinnen8,17, 20 , 22. noen forbedringer i metoden har nylig blitt beskrevet over Mikroskala pinner drevet av en micromanipulator22.
Vi presenterer en integrert tilnærming som hjelpemidler i plasseringen av nålen og injeksjoner er tilrettelagt av en egendefinerte instruert stereo oftalmoskop utviklet i laboratoriet for se i lille øyet mus17, 23. Bruk av trakk glass mikro nåler i forbindelse med den stereotaxic micromanipulator gir bedre kontroll med nål plassering med ingen kirurgisk kuttet ned nødvendig (dvs. gjennom conjunctivae og bindevev) før injeksjon. Bruken av trykket regulert mikro injektor hjelper levere konsistent injeksjon volumer og injeksjon kan gjøres med mye større stabilitet, presisjon og mye tregere enn manuell injeksjoner utført av en håndholdt sprøyte, og dermed redusere den forekomst av boble injeksjon i øyet. Mindre nålen hindrer lekkasje etter nålen uttak fordi banen er selvtettende. For å vurdere omfanget av injeksjon/levering, stole mange undersøkende grupper på å finne og vurdere areal omfanget av forbedret grønne fluorescens protein (EGFP) uttrykk i netthinnen (uttrykk konstruere levert av vektor) på eksperimentell slutten Velg (euthanasia) bekrefte vellykket injeksjoner11,19,20,24. Denne metoden (ikke benytte OCT) for å bekrefte kirurgisk suksess avfall en enorm mengde ressurser kirurgisk fremgangsmåter og dyr, siden alle dyr med (Ukjent) kirurgisk feil må opprettholdes, etterfulgt med repeterende tiltak til Eutanasi og øye innhøstingen (når EGFP er målt). Bekreftelse av plasseringen av injeksjon i netthinnen kan forbedres med HR-SD-oktober for å demonstrere at injeksjon ligger mellom riktig lagene av netthinnen (dvs. subretinal plass). HR-SD-oktober kan også brukes til å avgrense umiddelbart mislykkede forsøk (kirurgiske feil) til å identifisere relevante variabler i ekte kirurgisk tid til å forbedre tilnærming. Vi fant at HR-SD-oktober gir mange fordeler i preklinisk gene terapi studier ved å tillate rask kvantitativ vurdering av ytre retinal degenerasjon, slik at ID/culling av studien dyr ikke oppfyller eksperimentelle kriterier ( f.eks feil subretinal injeksjon), og å direkte oppfølging imaging til regionen øyet der vektor ble levert (der prekliniske effekten er mest sannsynlig) samt kontrollere regioner der vektor ikke ble levert. Siden sin utvikling, bruk av SD-oktober har fortsatt å bli akseptert og brukes av Oftalmologi forskere regnes nå standarden på netthinnen bildebehandling i netthinnen vitenskapelige studier i mus eller gnager modeller13,25. HR-SD-oktober og programvare egenskaper ble benyttet i unike integrert måter å fremme vellykket kvantitativ genterapi musen modeller på hvert trinn i prosessen, inkludert dyremodell utvalg, karakterisering av degenerasjon i valgte mål sykdom modeller, terapeutiske levering, kartlegging vektor leveringsmåte og toksisitet/effekt evaluering. Bruk av HR-SD-oktober gir mer effektiv stoffet funnet på alle trinn i prosessen. Her beskriver vi disse fremgangsmåtene som brukes i RNA Drug Discovery programmet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyr protokoller blir gjennomgått og godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteer av VA WNY HCS og Universitetet i Buffalo-SUNY. Dyrene ble brukt i henhold til reglene i Association visjon og Oftalmologi (ARVO) og erklæring i Helsinki.
1. musen modeller
- Identifisere musen modeller evalueres inkludert kontroller.
Merk: Bildebehandling ble utført for en C57BL/6(J), hC1/hC1 / / mWT/mWT, en delvis humanized mus retinal degenerasjon modell homozygous for menneskelig mutant RHOP347S hC1 alleler på vill-type (WT) mus RHO+/ + genotype26 , 27, hC1 x BL/6(J), en delvis humanized modell med ett eksemplar av det muterte menneskelige RHOP347S hC1 allelet på WT musen RHO+/ + anleggspreg (hC1 /-/ / mWT/mWT) (ved krysset hC1/hC1 / / mWT/mWT med C57BL/6 ( J) mus). Den over autosomal dominant retinitis pigmentosa (adRP) modeller er på C57BL/6(J) bakgrunn. En musemodell som er homozygous for to kopier av menneskelig WT RHO genet på musen RHO knockout bakgrunnen var også brukt28,29. Denne linjen er på 129Sv bakgrunn. Når denne linjen var korslagt med en musen RHO knockout på 129Sv bakgrunn, oppstår en enkelt dose av menneskelig RHO på musen RHO bakgrunn. - Opprettholde dyrene følge betingelsene gjelder for eksperimentell design.
Merk: Dyrene ble opprettholdt i Veterinary medisinsk enhet (VMU) på VA WNY HCS. Mus ble matet standard lab chow og dyrket under 12 h:12 h lys: mørk sykluser med myk fluorescerende overhead hvitt lys med ca 300 lux på buret nivå på omtrent 72 ˚F.
2. musen Eye Gel
- Forberede optisk gel retinal imaging30 og kirurgiske prosedyrer.
- Kombinere 2 mg/mL w/v-høy molekylvekt (4 x 106 g/mol karbomer i sterilt 1 x fosfat Buffered Saline (PBS).
- Bland ved romtemperatur før gel danner en tyktflytende optisk gjennomsiktig gel.
- Overføre gel til små sterilt flasker og virvel i en svingende bøtte tabletop sentrifuge 350 x g å fjerne fanget luftbobler.
- Bruke gel direkte til hornhinnen for å opprette et grensesnitt mellom musen hornhinnen og premie cover glass (18 x 18 mm).
3. HR-SD-oktober Imaging
- Se HR-SD-oktober enheten (figur 1).
- Veie det dyr for å avgjøre det lated dosen bedøvelse. Deretter bedøve musen bruker 25 µL/g av kroppsvekt 2,5% løsningen av bufret 2,2,2-tribromoethyl alkohol (Avertin) løsning via intraperitoneal injeksjon (IP) og legge øyedråper for å dilate elevene når dyret er immobilisert.
- Bekreft at dyret er fullt anesthetized av en tå knipe, og være sikker på at dyret ikke reagerer.
- Trimme kinnskjegg og plassere musen på HR-SD-oktober sleden.
- Plasser musen er øye rett foran headpiece linsen og manipulere scenen kontrollene til hornhinnen og iris. Holde hornhinnen hydrert ved å bruke artificial tårer.
Merk: Finjustering micromanipulators på HR-SD-oktober sleden brukes til å plassere musen slik at elev blenderåpning er sentrert og orientert. Den optiske headpiece er så avansert til netthinnen blir synlig og dyret er ytterligere justert for å oppnå best mulig bilde. - Først, åpne programmet "Mus" og klikk "pasient/eksamen". Andre Klikk "Legg til pasienten" og skriv inn relevant informasjon for å identifisere dyr i vinduet ny pasient og "lagre og Avslutt". Tredje Klikk på "Legg til eksamen" etterfulgt av "start eksamen". Fjerde, klikk "Legg til egendefinert skanning" og velg "rektangulære volum", velge OD eller OS for øyet blir fotografert, klikk "Legg til eksamen". Endelig, start å sikte instrumentet og posisjonering dyr for å få området rundt. Etter å finne riktig region, fjerne overflødig væske fra øye overflaten med en steril bomull tippet applikatoren like før bildeopptak for å forbedre bildekvaliteten, så klikk "start øyeblikksbilde", og hvis oppnås et godt bilde, klikk "lagre Scan".
Merk: Typisk parametere for rektangulære HR-SD-oktober bilder er 900 en skanner/b-skanning og 90 b-skanner/image. Ervervet bilder er 1,4 x 1,4 mm. Regionen av netthinnen fotografert avhenger av bestemte eksperimentet, men de fleste bilder er sentrert på synsnerven hodet (ONH).
4. vurdere tilstedeværelse, pris, og enhetlig modell ytre Retinal Degenerations
- Ytre Retinal degenerasjon modell evaluering av HR-SD-oktober
- Få dyr med et bredt spekter av aldersgrupper for både kontrollen og eksperimentelle fag å vurdere tilstedeværelse, pris, og ensartethet av ytre retinal degenerasjon.
- Utføre HR-SD-oktober bildebehandling på flere dyr hvert år fra begge kohorter (sykdom og normal). Bruke metoden beskrevet i 3.1.6 for å få OCT bildene.
Merk: Data kan hentes fra en stor kohort av dyr samtidig som har distribuert fødselsdager som spenner over en lang periode (1 år), eller en liten kohort av dyr kan brukes til å samle flere bilder over lang tid (1 år) å oppnå lignende resultater. - Åpne en innspilt HR-SD-oktober rektangulære volumavbildning og identifisere første b-skanningen skal måles (ideelt inkluderer ONH eller andre identifiserende landemerke) fra ensemble av bilder. Forstørre bildet fyller hele skjermen bruker zoomfunksjonen i programvaren.
- Åpne ønsket antall calipers ved å høyreklikke på bildet av b-skanningen og deretter klikke på "Markører" og til slutt klikker på så mange calipers som ønsket (de er nummerert 1 til 10). Kontroller at kaliperne vises i nedre høyre hjørne av bildet. Bruke funksjonen "Konfigurere Caliper" tilordne dem alle som "vertikal" i vinkel blokk kolonnen og slå på "Caliper visningsplasseringen" å lette uniform plassering over netthinnen og til slutt klikker du bruk.
Merk: 1st caliper bør plasseres på venstre side av bildet under behandling øye dexter (OD) høyre øye og 1st Caliper bør plasseres på høyre side av bildet under behandling øye skumle (OS) venstre øye bildene. Dette resulterer i en nese til timelige retning av alle dataene for både venstre og høyre øynene når plotting. - Bruke mus, flytte hver caliper til ønsket plassering (2.0 mm fra hverandre) over b-skanningen, husk å plassere en caliper i midten av synsnerven hodet, i b-skanne bilder med det (satt denne caliper til null). Deretter bruker du musen Klikk og dra caliper til lengde til span regionen rundt. Vilkårlig sett calipers som ikke overlappe målbare regioner av b-skanning til maksimal lengde, og ignorere i dataanalyse.
- Måle bare tykkelsen ved hjelp av Caliper verktøy, ved å plassere øverst i caliper eksterne begrensende membranen (ELM) og nederst caliper nederst på den ytre plexiform lag (OPL). Gjenta dette for hver caliper over netthinnen 0.2 mm trinn på. Lagre målinger.
- Etter at alle calipers er plassert og tilpasset størrelse, høyreklikk på bildet og klikk "Lagre Caliper Data".
- Gjenta målene på etterfølgende b-skanner (hver 10th skanner fungerer godt) fra samme rektangulære volum OCT bilde som dekker hele netthinnen fra underlegne overlegen regioner. Calipers bør forbli åpen og på samme sted i x-aksen. Juster lengden på calipers uten å flytte dem i X-retningen.
- Åpne lagre datafiler ved å klikke ikonet liten fil behandlet b-skanningen bildet og klikk "Gå til Data". Klikk "dato endret for å ordne filene i rekkefølge basert på tid spart, og åpne alle filer for hver b-skanning målt.
- Kompilere rådata fra hver b-skanning i én fil i rekkefølge fra lavest til høyest basert på bildenummer. Velg datakolonnene inkludert "Caliper navnet", "Lengde" og "Center X".
- Kontroller at midten X er den samme for alle b-skanner til hver rektangulære volum OCT bilde behandlet. Slette data fra calipers som ikke brukes for å Registrer målinger, og angi caliper ligger i sentrum av synsnerven hodet til null.
- Plot dataene for X vs flere Y datasett å få en 3D tomten funksjon tegne samlede tykkelsen på bare eller en annen målt retinal lag.
- Sammenlign bare mål mellom kontrollen og forsøksdyr med tilsvarende aldre å bestemme hastigheten og ensartethet av noen potensielle retinal degenerasjon.
- Gjenta prosessen for OSL mål med de samme b-scan-bildene. Følge av samme metode som brukes til å måle bare, bortsett fra å plassere calipers mellom ELM og Bruchs membran (BM).
Merk: Et eksempel på hvordan du plasserer caliper vises i representant resultatinndelingen (Figur 3B). Dette bør gjøres på en zoomet i bildet for å redusere feil. - Gjenta dataanalyse for flere dyr for hver bursdag både eksperimentelle og kontroll kohorter.
- Omfattende måling og 3D tilordningen av bare eller OSL tykkelse ved hjelp av verktøyet programvare calipers
- Gjennom post injeksjon OCT bilder og noter eventuelle identifiserbare landemerker, som ONH eller blodårer i netthinnen. Deretter Plasser musen for å få en oppfølging SD-oktober fra samme område, og husk å ta samme identifiserbar landemerkene.
Merk: Kontroller at området av netthinnen fotografert og involvert i netthinnen brøkdel identifiseres i innlegget injeksjon SD-oktober bilder. Registrere en rektangulær volumavbildning SD-oktober og lagre den. - Behandle innspilte bilder som beskrevet ovenfor i trinn 4.1.3. til 4.1.14. Lagre caliper data og handlingen som beskrevet ovenfor.
Merk: Den resulterende rekke bare målinger brukes til å opprette en 3D tomt viser bare tykkelsen. Plasseringen av calipers langs x-aksen tillate en å replot grafen plassere synsnerven på origo (0) langs x-aksen. Y-aksen skal tegnes med hvor b-scan og synsnerven brukes deretter til å definere startpunktet, som gjør det mulig å riktig posisjon synsnerven på opprinnelsen på y-aksen. Identifisere den optiske nerven i hvert datasett kan oppfølging bilder til justeres pålitelig.
- Gjennom post injeksjon OCT bilder og noter eventuelle identifiserbare landemerker, som ONH eller blodårer i netthinnen. Deretter Plasser musen for å få en oppfølging SD-oktober fra samme område, og husk å ta samme identifiserbar landemerkene.
- Kartlegge omfanget av injeksjonsstedet på bildet fundus
- Utføre innlegget injeksjon rektangulære volum OCT for å bekrefte suksessen til injeksjon. Følg etter metoden beskrevet i 3.6.
- Bruk funksjonen Caliper i programvaren for å identifisere vendepunkt på grensen av frittstående netthinnen fra en rekke b-skanner som dekker hele OCT bildet. Bruke metoden til å åpne calipers beskrevet i 4.1.4.
- Registrere fundus bildene med tilordnede plasseringen av OCT b-scan og tilsvarende caliper sted i fundus bildet, som tilsvarer plasseringen.
- Samle alle fundus bildene i et sammensatt bilde, inkludert de caliper stillingene, som resulterer i et nøyaktig kart over injeksjonsstedet på fundus bildet (eksempel representant resultater delen figur 5et).
5. intraokulært injeksjoner
Merk: Informasjon om bruk av RIS er ytterligere utdypes i en fersk studie23.
- Forbereder glass injeksjon nåler
- Autoclave av kapillær rør med filamenter i små grupper, med tørr syklusen.
- Bruke en pipette avtrekker og sette opp et program som vil produsere et glass tips med skarpeste vinkelen og diameter i størrelsesorden 2-5 µm.
Merk: Et eksempel 5 trinn program som produserte effektiv nåler på våre pipette avtrekker er vist i tabell 1. - Lagre trakk glass nålene i et sterilt pipette nål krukke ved romtemperatur.
- Fylle injeksjon nålen med den ønskede injeksjonsvæske
- Montere nålen inn nålen innehaveren, forlater ca 5/8-tommers stikker utover slutten på holderen.
Merk: A avstand mindre enn 5/8-tommers vil gjøre det vanskelige nå injeksjon løsningen å fylle nålen, fordi nål holder ikke passer lett inn i åpningen av 0,2 mL rør. Også har nålen stikker ut mer enn 5/8-tommers resulterer i betydelig større svingning eller presesjon tips, gjør sanntid imaging vanskelig siden spissen forlater fokalplanet eller synsfelt (FOV) skjemakatalogfil punktering øyet. - Forberede injeksjon løsningen i et sterilt 0,2 mL tube. Legge til en 1:10 fortynning av sterile fluorescein sulfate (10 mg/mL i 1 x PBS) til injeksjon løsning å få en endelig konsentrasjon av fluorescein på 1 mg/mL.
Merk: Nøyaktig fargestoff brukt gjelder for brukeren og kan være alt som er giftig og synlig for det blotte øye under hvitt lys belysning for å gjøre nøyaktig plassering av pinne-spissen på nivå av RPE og subretinal rom. - Visualisere nålen gjennom stereo mikroskopet mens du bruker kontroll knotter av 3-akse micromanipulator for å plassere nålen slik at den justeres med midten av røret som inneholder injeksjon løsningen skal brukes for å fylle nålen.
- Nøye kjøre pinne-spissen i 0,2 mL tube til spissen av nålen er neddykket i væsken. Trekke opp ønsket injeksjon væske (f.eks 1 µL) inn nålen nødvendig for en enkelt injeksjon. Opprettholde den gjenværende løsningen i røret i isen.
- Montere nålen inn nålen innehaveren, forlater ca 5/8-tommers stikker utover slutten på holderen.
- Forbereder dyret injeksjon
Merk: RIS mikroskopet holdes rene, og er en ikke-kontakt. Varmeplaten er dekket med et rent adsorbent pad nåler er autoklaveres før blir trukket. Når de er trukket av en selv sterilisering oppvarmet metall stripe, lagres de i et lukket sterilisert kammer laget for å holde trakk glass nåler. Nålene er bare håndteres med hansker hendene og omsorg brukes til å forhindre berøre tuppen av nålen mens montering det inn i holderen. Injisert løsningene tilberedes med steril teknikk, og er testet for forurensning av striper et utvalg av virus forberedelsene på LB agar tallerkener og rugende dem over natten på 37 grader.- Veie dyret (g) for å finne den riktige dosen av bedøvende smertestillende.
- Administrere bedøvende (2,5% løsning bufret 2,2,2-tribromoethyl alkohol (Avertin)) via intraperitoneal injeksjon (IP).
- Umiddelbart bruke antikolinergisk legemidler (f.eks cyclopentylate) på begge øynene å dilate elevene.
- Trim dyrets værhår og antall dyr med øret slag eller andre metoden.
- Vask øye og omegn med fortynnet betadine.
Merk: Unngå å få noen løsning rundt nesen, da dette kan føre til utilsiktet drukning. - Plass musen på oppvarming pad, opprettholdt på 39 grader, i den pre støpte modeler leire musen holder med øyet skal injiseres mot nålen.
- Kontroller at musen ikke svarer med en klype test av det bakben fot.
- Utfører subretinal injeksjon
- Bruk et par sterilt sløv iris tang for å indusere forsiktig proptosis av verden ved å plassere tips av Tang på 7 og 10 o'clock stillinger på øyet lokkene mens skyve åpen og nedover samtidig.
- Bruk tang til å lokke øyelokkene under øyet verden å holde det ut av kontakten mens injeksjon pågår.
Merk: Dyr 10 til 14 dager gamle vil ofte holde øye ut av stikkontakten lettere enn eldre dyr. - Direkte spissen av nålen ca 1-1,5 mm under kanten av hornhinnen limbus og nøye kjøre den i øyet gjennom Konjunktiva til den skaper en Innbukking depresjon nålen trenger inn vev av sclera, og tillater manipulering av øyet.
- Rotere øyet nedover micromanipulator å visualisere Innbukking depresjon gjennom utvidede eleven med RIS stereo mikroskopet.
- Påfør en dråpe sterile øye gel eller 1 x PBS løsningen og dekk med et sterilt dekkglassvæske.
- Fokus på Innbukking depresjon opprettet av spissen av nålen (2-5 µm) og kjøre nålen frem til en skarp topp av netthinnen skjemaer på injeksjonsstedet.
- Rotere nålen bruke holderen til spissen kjeder gjennom sclera og fluorescein i nålen vises under netthinnen i umiddelbar nærhet av RPE celle monolayer.
- Kjøre spissen av nålen så det er tangential til verden, og deretter aktivere innsprøytingspumpe med pedal fotbryteren.
- Når ønsket volum er levert (0,5-1 µL) til subretinal plass, trekke nålen og sjekk hvis bleb er stabil og at væske ikke lekke ut av injeksjonsstedet, som er første kriteriene for en vellykket injeksjon.
Merk: Opprettholde en riktig tuppens diameter er (2-5 µm diameter) avgjørende for å unngå lekkasje fra injeksjonsstedet. - Plassere dyret tenkelig plattform OCT instrumentet. Følg skiltingen til HR-SD OCT Imaging for å registrere en rektangulær volumavbildning.
- Bekreft at injisert væsken ligger i subretinal rommet, og lagre bilder for å bestemme omfanget av bleb.
- Fjern dyret fra abonnenten og rikelig med antibiotika sårsalve gjelder injisert øynene.
- Plasser dyrene på en varmeputen til det helt gjenoppretter, deretter plassere den tilbake til opprinnelige buret hvor den kom fra.
Merk: Dyr er vanligvis injisert før avvenning, derfor må dyrene returneres til buret med mor.
- Kartlegging omfanget av den subretinal bleb bruker OCT instrument programvareverktøy.
- Få frem et rektangulært volum OCT bilde, ved hjelp av metodene beskrevet tidligere, av bleb og plasser den til å omfatte et gjenkjennelig landemerke i øyet som ONH.
Merk: Inn 90 b-skanner fungerer godt for kartlegging av bleb, men kan brukes avhengig av oppløsningen. - Legge til en enkelt tykkelse i figuren, og plasser den på vendepunkt der netthinnen løsner fra RPE og akkord.
Merk: Programvaren tilordner automatisk en tilsvarende punkt til en linje på fundus bildet representerer caliper og b-skanningen som evalueres. - Fange skjermen etter plassering av calipers, og kompilere bildene slik effektivt grensen av injeksjon bleb på fundus bildet, som nøyaktig kart injeksjonsstedet. Lagre kompilert bildet for referanse for å hjelpe å finne regionene rundt under oppfølging bildebehandling.
Merk: Eventuelt caliper dataene kan lagres sammen og plottet bruker en lignende metode for inntegningsrekkefølgen 3D datasett av bare tykkelse.
- Få frem et rektangulært volum OCT bilde, ved hjelp av metodene beskrevet tidligere, av bleb og plasser den til å omfatte et gjenkjennelig landemerke i øyet som ONH.
- Intravitreal injeksjon
- Plassere nålen bruker en lignende kirurgisk tilnærming som sub retinal injeksjon, bortsett fra at nålen er kjørt helt gjennom sclera i pars plana om 0,25 mm bak det hornhinnen limbus og inn i linsen.
- Etter nålen plassering, bruke injeksjon pulsen med fotpedal.
Merk: En rask spredning av fluorescein fargestoff gjennom linsen av eyecup er observert, fylle strekte elev blenderåpning med fluorescens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vurdere tilstedeværelse, Rate og enhetlig modell ytre Retinal degenerasjon
Målinger av bare innspilt fra OPL til ELM, definere grensene av bare bruke verktøyet caliper i Maskinprogramvar. Målet var å kartlegge progresjon av ytre retinal degenerasjon i en delvis humanized adRP musemodell. Sammenlignbare bilder fra en kontroll C57BL/6(J) mus og en hC1/hC1 / / mWT/mWT musemodell, uttrykke to kopier av mutant menneskelige stang opsin (RHOP347S) genene, ble vist å både kontroll retinal resultatene og i en alvorlig og raskt progressiv netthinnens degenerative tilstand. 3-uke-gamle adRP (hC1 x BL/6(J)) dyr, har bare en enkelt kopi av mutant menneskelige RHOP347S genet og to kopier av musen WT RHO genene, hadde nær normal bare tykkelse. Men skanner den oppfølging HR-SD-oktober 10 og 37 uker demonstrert timelig progressive og romlig uniform retinal degenerasjon som resulterte i ca 60% tap av fotoreseptorer anerkjent som bare tynnere over denne tidsrammen. I hC1 x BL/6(J) adRP modell har retinal degenerasjon en omtrentlig tidskonstant (1/e) 13 uker. Homozygous hC1 dyr, med to doser av giftig mutant menneskelige transgene på musen WT RHO bakgrunn, lider en mye mer rask degenerasjon som demonstrert av omfattende retinal tynning og i hovedsak fullstendig tap av alle fotoreseptorer av 3 ukens av alderen (figur 2).
BARE mål er bare en del av ytre retinal normalitet som en indeks av photoreceptor vitalitet. OSL fotoreseptorer og indre segment/ytre segmentet (er / OS) linje eller ellipsoid gir bevis til støtte for både photoreceptor vitalitet og funksjon. Sammenligninger i dyr som har blitt avlet inneholder en (N129R - x 129R-) eller to (2HRho 1T1T) kopier (doser) av menneskelig WT RHO genene på musen WT RHO knockout bakgrunnen ble målt for ytre netthinnen tykkelse. En statistisk signifikant økning av ~ 8 µm i bare ble observert i mus med to kopier av menneskelig WT RHO genet sammenlignet med mus med bare én kopi av menneskelig genet. En statistisk signifikant økning av ~ 5 µm i OSL ble observert i mus med to vs. én kopi av menneskelig WT RHO genet på musen WT RHO knockout bakgrunn. Et eksempel på hvordan bare og OSL målinger ble gjort vises i Figur 3. Den høye oppløsningen på bildene tatt med HR-SD-oktober systemet tillate nøyaktige målinger av bare eller OSL slik at diskriminering av små forskjeller med solid statistiske pålitelighet i humanized WT RHO musen modeller.
Utvalg av kirurgisk resultatene detaljert av OCT når prøver Subretinal injeksjon
HR-SD-oktober evaluering av forsøkte subretinal innsprøytninger gitt forskjellige resultater. Først var det vanligste erfaringen bekreftelse på at injisert væsken er levert innen sub netthinnen. Åpningen av den implisitte subretinal plassen (som lukkes under utvikling) opprettet en bleb som kunne være tydelig visualisert både etter eget ansikt HR-SD-oktober og i b-scan bilder. Hypo-reflekterende væsken grenset neural netthinnen ovenfor, og det hyper-reflekterende RPE celle laget fortsatt imot BM, nedenfor (Figur 4). Omfanget av subretinal injeksjon kunne bestemmes hvis dyret ble avbildet av HR-SD-oktober umiddelbart etter injeksjon (se nedenfor). Andre injeksjon kan oppstå i choroidal plass (under BM) og ikke i subretinal plass. Dette resulterte i en hyper-sjiktet (RPE) byksende kuppelen på regionen væske-fortrengt av netthinnen, og ingen hyper Reflektivitet på bakre grensene for øyet i Tilpasningsverktøy for Office b-skanner. Tredje, en annen potensielle resultatet som kan oppstå under forsøk subretinal injeksjon var en netthinnen schisis (deling) på nerve fiber laget. Dette resultatet gitt en normal ytre netthinnen anatomi, men det indre laget av netthinnen innkapslet bleb, hvilke kanskje eller kanskje ikke har invadert linsen. I prinsippet så et schisis mønster kan forekomme med injeksjon hvor som helst i plastprodukter av neural netthinnen riktig, men vi har bare sett nerve fiber laget schisis ennå. Fjerde intravitreal injeksjon kan også oppstå, som har ingen innvirkning på Tilpasningsverktøy for Office. Alle disse feilene skyldes den første misplacement spissen av glass nålen, eller kanskje noen små bevegelse av nålen under injeksjon, på grunn av press hodet slått flyt injeksjon enheten.
Karakterisere plasseringen av Subretinal injeksjon
En kritisk faktor i å bestemme effekt eller toksisitet av kandidaten terapi er muligheten til å sammenligne retinal regioner har mottatt vektor vs de har. Vi rettet betydelig innsats i å utvikle en måte å merke området av netthinnen involvert i subretinal injeksjoner slik at under oppfølging undersøkelser, kan vi identifisere areal omfanget av netthinnen der terapi ble brukt, og dermed hvor signaltransduksjon var mulig. Gull NPs tillatt en høy grad av tillit i å identifisere områder av netthinnen som ble eller ikke ble injisert. Imidlertid syntes bestemte partikler eller deres utforming å være giftig og resulterte i en alvorlig lokaliserte retinal degenerasjon på stedet av subretinal injeksjon av 24 timer innlegget injeksjon (data ikke vist). Derfor har vi utviklet en alternativ metode for kartlegging injeksjonsstedet direkte fra HR-SD-oktober bildebehandling data. En metode for å nøyaktig identifisere injeksjon webområdet grenser ble utviklet med måleverktøyene (calipers) i programvarepakken i apparatet (figur 5). Vi kan identifisere kanten av bleb nettopp ved å undersøke den personlige b-skanner (fra mindreverdige overlegen netthinnen) brukes til å opprette fundus bildet. Når du plasserer en tykkelse på punktet der bleb krysser vedlagte netthinnen, tilordnes plasseringen av caliper automatisk til tilsvarende b-skanningen av en ansikt fundus bildet i nøyaktig posisjon langs x-aksen der caliper var plassert på b-skanningen. Gjenta denne prosessen gjør det mulig å spore kanten av bleb på en no fundus bildet. Justeringen prosessen krever at lignende områder av netthinnen er fotografert hver gang, i forhold til konstant synsnerven hodet, og bildene må roteres justeres retinal blodkar fra bildene før data segregering. Etter justering prosessen innlegget injeksjon bildet og senere oppfølging bilder ble injeksjon regionen lagt over punkt datarutenettet å identifisere plasseringen av målene i regionen involvert i Netthinneavløsning. Denne data kan tegnes som kart overflate, som et visuelt verktøy for å identifisere datapunkter inkludert injeksjonsstedet i forhold til områder utenfor injeksjonsstedet.
Tilordne bare tykkelsen i 3D
Endelig vi Registrer målinger av bare, OSL eller andre retinal lag fra hele hele fotografert regionen av netthinnen, og deretter tegne inn dataene med en overflate tomt (figur 5). Legge grensen kart over injeksjonsstedet lar segregering av de to datasettene, inkludert regionen injisert og regionen som ikke ble koblet fra under injeksjon prosessen. Videre kan behandling og dataanalyse deretter utføres på disse to datasett å teste hypoteser at bestemte terapeutiske agenter kan redde retinal degenerasjon eller indusere toksisitet. Denne tilnærmingen potensielt gir eksperimentell og kontrollere data skal hentes fra en enkelt øye, sammenligne injisert vs ikke-injisert regioner i samme øyet.
Figur 1 : UHR-SD-oktober enheten. HR-SD-oktober apparat vises. Instrumentet stativet (A) inneholder dataskjermen (en), tastaturet og musen (b), boksen sonde grensesnitt (c), OCT motoren (d), datamaskinen (e), kontroll enheten i super selvlysende utslipp dioder (infrarød) (f), og den avbruddsfri strømforsyning (g). Optisk benken (B) inneholder tenkelig sonde optisk hodet (for mus netthinnen) (h), multi-aksen (lineær og roterende) manipulatoren (jeg) og en mus emne (j). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Progressiv ytre Retinal degenerasjon i delvis humanized adRP modell målt ved HR-SD-oktober (A) HR-SD-oktober bildene av netthinnen ble oppnådd for adRP modellen (hC1 x BL/6 (J)) i ulike aldre og kontrollen C57BL/6(J) på 14 uker homozygous hC1 mutant linjen på 3 uker. Ytre netthinnen hadde en normal opptreden i 3 uker i adRP modellen, men det var bevis for progressiv bare tynning og disorganization og generelt 10 ukens av alderen. 37 uker, (hC1 x BL/6(J)) vist omfattende ytre retinal degenerasjon. Alle OCT avsøker var i nærheten av synsnerven. (B) bare tykkelsen (i mm) langs vannrett aksen gjennom den optiske nerven var plottet for kontroll (C57BL/6(J)), hC1 og adRP dyr i ulike aldre. Det var progressiv tap av bare tykkelse i delvis humanized adRP modellen. BARE tap var større enn 60% av 37 uker gammel. Feilfelt = standard feil av gjsnitt. Rød skala bar = 200 µm og alle bildene er samme skala. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Kvantitative tiltak av ytre kjernefysiske lag og ytre lengde med HR-SD-oktober (A) musen linjer brukes til å vise bare og OSL tiltak. Representant OCT bilder fra 2HRho1T/1T (2 doser HRho) på musen RHO knockout bakgrunn) (venstre panel) og N129R - x 129R-(en dose menneskelige RHO på musen RHO knockout bakgrunn) (høyre panel). (B) vises et eksempel på hvordan calipers ble plassert til å måle bare (rød) og OSL (blå). (C) data innhentet fra tre dyr av hver linje for bare tykkelse ble tegnet i bar grafisk format viser sammenligning av 2HRho1T/1T linje og N129R - x 129R-(venstre panel). 2HRho1T/1T linjen har ~ 8 µm tykkere bare. For å demonstrere forskjeller i OSL, ble flere målinger (syv) gjort fra en b-scan fra hver musen linje fra ELM til BM som B (blå linjen) i 9-uke-gamle dyr (høyre panel). Dette demonstrert ~ 5 µm forskjell i OSL dyr med 1 vs 2 eksemplarer av HRho genet. Både bare og OSL tiltakene var statistisk signifikant, bare p-verdien = 1.7e-5 og OSL p-verdien = 6.4e-5. Feilfelt = standard feil av gjsnitt. Rød skala bar = 100 µm begge b-skanner i 3A har samme skala, 3B zoomes å forbedre klarhet av netthinnen lag og gi en kvalitativ demonstrasjon av hvordan målingene ble anskaffet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Typer intraokulært injeksjoner i mus identifisert av HR-SD-oktober (A). A (hC1xBL/6(J)) musen ble injisert med ~ 1 µL av væske via Inferonasal transcleral transchoroidal injeksjon. Den resulterende Netthinneavløsning sett på som grønne nedre høyre regionen no ansiktet bildet, oppretter en skarp kant i forkant av bleb på høyre side av bildet. OCT fundus bildet av en injeksjonsstedet utstillinger bare små forskjeller avhengig av plasseringen av væske fylt hulrom, fordi bildet er en samling av alle b-skanner fra hele retinal tykkelsen. I tillegg endrer injeksjon bleb avstand på netthinnen overflaten fra OCT headpiece, produsere en ufokusert region på injeksjonsstedet. (B) OCT b-skanningen av en ikke-injisert retina er demonstrert. ONH er merket. (C) en subretinal injeksjon er demonstrert. ONH er merket, og pilene i eget ansikt bilde (høyre panel) viser den bakre kanten av brøkdel. (D) en choroidal injeksjon er vist med en klar høyde (oppadgående forskyvning) på den RPE (hyper-reflekterende kurve) nedre del av netthinnen (piler) og betydelige tap av hyper Reflektivitet av RPE og choroid lag under den injisert væske. Sammenligne piler i bilder (C og D). (E) A retinal schisis demonstrert nær nerve fiber laget. Observere veldig tynn hyper-reflekterende membranen innkapsle injisert væsken, mens den Netthinne fortsatt knyttet til RPE. Små forskjeller mellom de tre ulike detachments kan også visualiseres i eget ansikt bilder (C, D, og E). Subretinal brøkdel har en ramme som er vanskelig å visualisere (piler i C), mens choroidal injeksjon oppretter et uskarpt hyper reflekterende rim i forkant av bleb, og på netthinnen schisis er tydelig ved skarpe avgrensning av sin ledende (E). Både rød skalere barer = 200 μm i 4B. Alle bilder 4B til 4E skaleres like. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Kartlegging og kvantifisere ytre Retinal endringer etter Subretinal injeksjon. En metode ble utviklet for å identifisere områder av interesse under oppfølging undersøkelse av musene som hadde subretinal injeksjon av vektor, med 3D-plotting av bare målinger fra flere OCT b-skanner. En 2HRho1T/1T dyr ble injisert med en selv-utfyllende adeno-assosiert virus uttrykke både GFP og ledende kandidat hammerhead ribozyme (scAAV-GFP ad6 hhRz 725) (OS øyet) i toksisitet skjermen. (A) Imaged umiddelbart etter, areal omfanget av injeksjon ble kartlagt ved å plassere calipers i forkant av bleb på punktet der de ytre segmentene atskilt fra RPE i b-skanner (venstre panel (rød caliper)). Plasseringen av verktøyet caliper er automatisk tilordnet fundus bildet, og dette er gjentatt og kompilert for så mange b-skanning ved behov som avhenger av ønsket oppløsning (hver 5th skanning i (A) (høyre panel)). (Hver 2 uker) OCT studier fotografert den samme regionen i netthinnen tillate overliggende; ONH og retinal blodårene er landemerker til rette kartesiske eller roterende justeringene. Hele regionen av netthinnen ble målt for bare tykkelse forutsatt nødvendig grensene (OPL og ELM) var synlig. (B) å kartlegge hvor bare over injisert overflaten caliper stillingene (fargekodet) er igjen kartlagt på fundus bildet og samlet i et sammensatt bilde. Hver 5th b-scan fra OCT bilder ble målt med innebygd calipers på opptil ti poeng over netthinnen. (C) pre- og post kompilert bildene er rotert, ved hjelp av bildebehandlingsprogramvare justere retinal blodkar, som tillater datapunkt i frittstående retinal regionen netthinnen skal identifiseres av bildeoverlegg og atskilt. (D) data sett er tilordnet til en tabell, identisk til fundus bilde array, og delt i to grupper (mål innenfor bleb (rød viktigste) og de som ikke). (E) Data presenteres ved hjelp av en 3D overflaten inntegningsrekkefølgen ansiktstrekk, hvilke innrømmer visualisering av bare tykkelse over hele fotografert regionen. Dette gjør vurdering av kvantitative forskjeller mellom injisert og ikke-injisert i øyet. Kløft i 3D plottet (E) gir en praktisk måte å skille datasettet av bare målinger i regionen i frittstående netthinnen fra regionen som var knyttet umiddelbart etter injeksjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 1: brukes til å trekke glass nålene. Beskytte programparameterne å oppnå glass pinner nyttig for subretinal av trans-Innbukking, transchoroidal tilnærming.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HR-SD-oktober gir en enkel metode for karakteristikk av potensielle dyr modeller for menneskelig sykdom å fastslå nytten i testing potensielle therapeutics. Muligheten til å raskt og pålitelig karakterisere en potensiell dyr modell for menneskelig sykdom er avgjørende for prosessen med terapeutisk medikament oppdagelse (f.eks, erstatning gene terapi, ribozyme eller shRNA knockdown genterapi, kombinert genterapi). HR-SD-oktober gir en enkel, rask og ikke-invasiv metode for å vurdere retinal helse som kan brukes til å karakterisere og overvåke utviklingen av retinal degenerasjon i nesten alle musemodell. OCT bildene kan brukes til å foreta målinger av noen eller alle de forskjellige lagene av netthinnen, som kan gi en detaljert vurdering av en ytre retinal (photoreceptor) degenerasjon over tid eller effekten av terapeutisk redningsforsøkene på degenerering grad eller kinetisk tidslinjen. HR-SD-oktober kan også brukes til å vurdere toksisitet av leverte vektor eller materialer. Den beste virkningen på et photoreceptor retinal degenerasjon forskningsprogram er evnen å lage raffinerte målinger av bare over tid i levende dyr. En kan tegne en retinal degenerasjon tidslinje å pakke ut en gang konstant, som er et avgjørende første skritt å vurdere effekt og toksisitet av kandidaten legemiddelselskap i de samme modellene over en timelig vindu av terapeutiske muligheter. Denne teknologien gir også mulighet for betydelige besparelser dyrebare ressurser (dyr og tid) i forhold til klassisk endepunktet histology ved at forskeren å identifisere avvik i dyr kohort før inn en studie og eliminere dyr som ikke oppfylle eksperimentelle kriterier (f.eks, vellykket subretinal levering).
Behovet for presis levering av visse therapeutics i subretinal plass i musen øyet er utfordrende og HR-SD-oktober gir en nøyaktig visuell bekreftelse av vellykket subretinal injeksjoner som et kriterium for pågående inkludering av dyr i den pre-klinisk studie design. Det kreves omfattende innsats ofte følge dyr injisert i gene terapi studier over tid, siden disse modellene ofte simulere menneskelige netthinnens degenerative sykdommer hvor sykdommen tidslinjer dukke opp over tiår. Mange oppfølging Undersøkelser er nødvendig å bestemme terapeutiske effekten eller vurdere toksisitet. En løsning på denne kritiske utfordringen er å ha evnen til å identifisere og fjerne dyr fra studien design, som er kirurgisk feil for levering av terapeutiske vektoren. Muligheten til å levere en vellykket injeksjon for en godt tekniker med års erfaring har nærmet 90% hvis sprøytebruk ett øye per dyr og ca 80% suksess hvis sprøytebruk begge øynene. Med denne effektivitetsnivå er fjerning fra studien design av dyr med mislykket injeksjoner fordelaktig å hypotesetesting. Dette ikke bare sparer kritisk tid, men også gir mer konsekvente og forutsigbare resultater. I tillegg HR-SD-oktober gjør det mulig å redusere antall dyr kreves for alle et eksperiment ved at de samme dyrene som skal følges over tid, som reduserer dyr til dyr variasjon i både eksperimentelle og kontroll grupper, og tillater mer robust statistiske evalueringer av hypoteser om potensielle effekt og toksisitet av kandidaten therapeutics.
Omfanget av netthinnen dekning av en subretinal injeksjon er vanligvis ikke 100%, noe som kan selv være giftig31,32,33,34. Derfor er muligheten til å skille mellom transduced og ikke-transduced avgjørende for riktig testing av hypoteser redning og toksisitet for en gitt kandidat terapeutisk. Kreativ bruk av tilgjengelig programvareverktøy gir presis kartlegging av subretinal injeksjoner i musen øyet. Umiddelbar avbilding av injisert øyet gir retning for oppfølging imaging til områder av interesse, og muligheten til å sammenligne områder som har vært transduced til områder som ikke har vært behandlet i samme verden. Avhengig av kartlegging presisjon ønsket, denne prosessen kan utføres for hver b-skanning eller regelmessig prøvetaking fra ensemble av b-skanner samlet umiddelbart innlegget injeksjon og kompilere alle fundus bildene til ett enkelt bilde med grafikkfilterprogramvare så som den piecewise kontinuerlig grensen er nøye kartlagt på fundus bildet. Sammenligne bilder fra umiddelbart etter injeksjon til oppfølging bilder krever at bildene justeres slik at måling posisjoner kan tilordnes på fundus bildet, og datapunktene kan være segregert i injeksjonsstedet og ikke-injisert regionene den netthinnen. Tilordningen av synsnerven hodet og retinal blodkar kan også oppnås med denne samme metodikk, som hjelpemidler i retning av øyet når du prøver å justere etter injeksjon bildene med påfølgende oppfølging bilder. Denne informasjonen kan brukes i påfølgende imaging for å identifisere området av netthinnen der injeksjon hadde skjedd. Selvfølgelig når dyrene er euthanized, kan plasseringen av EGFP uttrykk, levert av en AAV vektor også inneholder en kandidat terapeutiske genet (f.eks, ribozyme) også brukes til å sammenligne plasseringen av signaltransduksjon med området bestemmes av bildetilordning som avhenger av plasseringen av blod fartøy. Dette vil tillate identifikasjon av spredningen av vektor i senere lukket subretinal plass utenfor områder av anatomiske avdeling.
Vår suksess med bruk av gull NPs å merke de subretinal bleb var begrenset på grunn av toksisitet av materialer. Vi vil oppfordre videre undersøkelser av slike materialer å merke omfanget av subretinal blebs, hvis alternativ forberedelsene (varierende dimensjoner, overflate modifikasjoner) kan bli funnet som ikke Fremkall toksisitet.
HR-SD-oktober gir en enorm mengde informasjon med betydelig mindre tid og ressurser, og kan være quantitated for å gi mer informasjon om effekten og toksisitet av potensielle therapeutics sammenlignet med tradisjonelle metoder som histology. Bruk av denne teknologien gjør forskeren en av alvorlig flaskehalser i preklinisk retinal drug discovery35. Musen RIS og HR-SD-oktober er kraftige verktøy for å hjelpe prekliniske retinal gene terapi studier som en komponent i programmet vårt RNA Drug Discovery. Disse verktøyene kan brukes generelt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Kommersielle relasjoner: Kalt MCB: None; JMS: ingen. Retinal imaging system (RIS)23 brukt i denne studien er en roman enhet av betydelig bruk til en gruppe søker å gjennomføre gene terapi levering studier i mus og gnagere liten dyrene. Mens forfatterne har ingen konflikter å erklære med hensyn til denne enheten samtidig, Universitetet i Buffalo - SUNY og veteraner Administration har rettigheter i intellektuell eiendom og kan søke å kommersialisere dette i fremtiden.
Acknowledgments
Dette materialet er basert på arbeid støttes, delvis av Institutt for Veteraner saker (VA), veteraner helse Administration, Office for forskning og utvikling (biomedisinsk laboratorium forskning og utvikling) (VA Merit Grant 1I01BX000669). JMS er ansatt, delvis som ansatte lege-forsker, Oftalmologi, VA WNY; Kalt MCB er ansatt, delvis av VA WNY. Studien ble utført på, og støttes delvis av veteraner administrasjon Western New York helse systemet (Buffalo, NY). Innholdet representerer ikke synspunktene til Department of Veterans Affairs eller myndighetene i USA. Støttes også, i stor del, ved NIH/NEI R01 gir EY013433 (PI: JMS), NIH/NEI R24 gi EY016662 (UB Vision infrastruktur Center, PI: M slakting, direktør - Biophotonics modul: JMS), en ubegrenset tilskudd til avdeling for Oftalmologi/Universitetet i Buffalo fra forskning til forhindre blindhet (New York, NY), og et stipend fra Oishei Foundation (Buffalo, NY). Vi erkjenner gave hC1 transgene RHOP347S linjen og ekson 1 musen RHO knockout fra Dr. Janis Lem (dusker New England Medical Center, Boston, MA), og gave NHR-E transgene modellen i heterozygote tilstand på den musen ekson 2 RHO knockout bakgrunn fra Dr. G. Jane Farrar og Peter Humphries (Trinity College, Dublin, IRE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL6 (J) | Jackson Laboratories | 664 | |
| N129R- | N/A | N/A | |
| 2HRho 1T/1T | N/A | N/A | |
| Envisu R-2200 Ocular Coherence Tomography Instrument (OCT) | Bioptigen | 90-R2200-U1-120. | |
| Retinal Imaging System (RIS) | In-house | N/A | |
| Stemi 2000C Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
| P-97 Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co | p-97 | |
| MMN-33 micro manipulator | Narishige USA | MMN-33 | |
| PLI-100 micro injector | Harvard Apparatus | 64-1736 | |
| Micropipette Holder (Rotating) | In-house | N/A | |
| Micropipette Storage Receptacle | World Precision Instruments Inc. | E210 | |
| Borosilicate glass capillary tubes 1.5-1.8 X 100mm, | Harvard Apparatus | 30-0053 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol | SIGMA Aldrich | T48402-25G | |
| Tert-amyl Alcohol | SIGMA Aldrich | 240486-100ML | |
| Atropine Sulfate Ophthalmic Solution, USP 1% | Akorn Inc. | NDC 17478-215-05 | |
| Goniovisc | BioVision Limited | NDC 17238-610-15 | |
| Cyclopentolate Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP 2% | Akorn Inc. | NDC 17478-097-10 | |
| Gentamicin Sulfate Ointment USP, 0.1% | Perigo | NDC 45802-046-35 | |
| Systane Ultra | Alcon Laboratories, Inc. | 9006619-1013 | |
| Tetracaine Hydrochloride | Bausch and Lomb | NDC 24208-920-64 | |
| Ophthalmic Solution, USP 0.5% | Bausch and Lomb | NDC 24208-920-64 | |
| DPBS | Gibco Life Technologies | 14190-136 | |
| Virus Preparations | ViGene /UNC | N/A | |
| Gold nanorods | NANOPARTz | D12M-850-1.75 | |
| Fluorescein Sulfate AK-FLUOR 25% | Akorn Inc. | NDC 17478-250-20 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-A | |
| Forceps | Milton | 18-825 | |
| Needles 30 guage | Beckton Dickenson | W11604 | |
| Syringes | Beckton Dickenson | 309659 | |
| Bioptigen software Package | Bioptigen | N/A | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP 0.5% | Akorn Inc. | NDC 17478-263-12 | |
| Windows Excel | Microsoft | N/A | |
| Adobe Illustrator | Adobe | ||
| Scale | Mettler | ||
| Scissors | World Precision Instruments | ||
| Ear punch | Nat’l band | ||
| CL 100 Light source | Welch Allyn | CL100 | |
| Nitrogen Gas | Jackson Welding Supply | N/A | |
| Heated Water bath | Neslab | RTE-140 | |
| Heating plate | In House | N/A | |
| Heating mat | Cincinnatti Sub Zero | 273 | |
| Clay mouse holder | Plast.i.clay American Art Clay Co. | N/A | |
| Betadine | MedLine | NDC53329-938-06 | |
| Cotton Tip Applicators | American Health Service | Ctag | |
| EtOH 70% | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
| Gloves Nitrile | VWR | 89038-272 | |
| Diagnosys ERG Color Dome instrument | Diagnosys Inc. | D125 | |
| Contact lenses | In-house | N/A | |
| Diagnosys Software | Diagnosys Inc. | N/A | |
| Origin 6.1 software | OriginLab Corp. | N/A | |
| Reference electrodes | Ocuscience | F-Thread Electrode (DTL) 24” |
References
- Regus-Leidig, H., et al. In-vivo knockdown of Piccolino disrupts presynaptic ribbon morphology in mouse photoreceptor synapses. Front Cell Neurosci. 8 (259), 1-13 (2014).
- Jiang, L., Frederick, J. M., Baehr, W. RNA interference gene therapy in dominant retinitis pigmentosa and cone-rod dystrophy mouse models caused by GCAP1 mutations. Front Mol Neurosci. 7 (25), 1-8 (2014).
- Seo, S., et al. Subretinal gene therapy of mice with Bardet-Beidl Syndrome Type-1. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (9), 6118-6132 (2013).
- Molday, L. L., et al. RD3 gene delivery restores guanylate cyclase localization and rescues photoreceptors in the RD3 mouse model of Leber congenital amaurosis 12. Hum. Mol. Genet. 22 (19), 3894-3905 (2014).
- Pang, J. J., et al. AAV-mediated gene therapy in mouse models of recessive retinal degeneration. Curr. Mol. Med. (3), 316-330 (2012).
- Vandenberghe, L. H., Auricchio, A. Novel adeno-associated viral vectors for retinal gene therapies. Gene Ther. 19 (2), 162-168 (2012).
- Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors. Curr. Gene Ther. 3 (6), 545-565 (2003).
- Parikh, S., Le, A., Davenport, J., Gorin, M. B., Nusinowitz, S., Matynia, A. An alternative and validated injection method for accessing the subretinal space via a transcleral posterior approach. J. Vis. Exp. (118), e54808 (2016).
- Bainbridge, J. W. B., Mistry, A. R., Thrasher, A. J., Ali, R. R. Gene therapy for ocular angiogenesis. Clinical Science. 104, 561-575 (2003).
- Igarashi, T., Miyake, K., Asakawa, N., Miyake, N., Shimada, T., Takahashi, H. Direct comparison of administration routes for AAV-8 mediated ocular gene therapy. Curr. Eye Res. 38 (5), 569-577 (2013).
- Bennett, J., Duan, D., Engelhardt, J. F., Maguire, A. M. Real-time noninvasive in vivo.assessment of adeno-associated virus-mediated retinal transduction. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 38, 2857-2863 (1997).
- Ruggeri, M., et al. In vivo three-dimensional high-resolution imaging of the rodent retinal with spectral-domain optical coherence tomography. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48 (4), 1808-1814 (2007).
- Berger, A., et al. Spectral domain optical coherence tomography of the rodent eye: highlighting layers of the outer retina using signal averaging and comparison with histology. PLoS One. 9 (5), 96494 (2014).
- Dysli, C., Enzmann, V., Sznitman, R., Zinkernagel, M. S. Quantitative analysis of mouse retinal layers using automated segmentation of spectral domain optical coherence tomography images. TVST. 4 (4), 9 (2015).
- Bhootada, Y., Choudhury, S., Gully, C., Gorbatyuk, M. Targeting caspase-12 to preserve vision in mice with inherited retinal degeneration. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56, 4725-4733 (2015).
- Wert, K. J., Skeie, J. M., Davis, R. J., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye. J. Vis. Exp. (69), e4286 (2012).
- Berger, A., al,, et al. Spectral-domain optical coherence tomography of the rodent eye: highlighting layers of the outer retina using signal averaging and comparison with histology. PLoSOne. 9 (5), 96494 (2014).
- Muhlfriedel, R., Michalakis, S., Garrido, M. G., Biel, M., Seeliger, M. W. Optimized technique for subretinal injections in mice. Methods in Molecular Biology. , Clifton, NJ. (2013).
- Sarra, G. M., et al. Kinetics of transgene expression in mouse retina following subretinal injection of recombinant adeno-associated virus. Vision Res. 42, 541-549 (2002).
- Yan, Q. I., et al. Trans-corneal subretinal injection in mice and its effect on the function and morphology of the retina. PLoS One. 10 (8), 0136523 (2015).
- Park, S. W., Kim, J. H., Park, W. J., Kim, J. H. Limbal approach-subretinal injection of viral vectors for gene therapy in mice retinal pigment epithelium. J. Vis. Exp. (102), e53030 (2015).
- Westenskow, P. D., et al. Performing subretinal injections in rodents to deliver retinal pigment epithelium cells in suspension. J. Vis. Exp. (95), e52247 (2015).
- Butler, M. C., Sullivan, J. M. A novel, real-time, in vivo mouse retinal imaging system. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56 (12), 7159-7168 (2015).
- Rolling, F., et al. Evaluation of adeno-associated virus-mediated gene transfer into the rat retina by clinical fluorescence photography. Hum. Gene Ther. 10, 641-648 (1999).
- Ferguson, L. R., Grover, S., Dominguez, J. M., Balaiya, S., Chalam, K. V. Retinal thickness measurement obtained with spectral domain optical coherence tomography assisted optical biopsy accurately correlates with ex vivo histology. PLoS One. 9 (10), 111203 (2014).
- Li, T., Snyder, W. K., Olsson, J. E., Dryja, T. P. Transgenic mice carrying the dominant rhodopsin mutation P347S: evidence for defective vectorial transport of rhodopsin to the outer segments. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 14176-14181 (1996).
- Brill, E., et al. A novel form of transducin-dependent retinal degeneration: accelerated retinal degeneration in the absence of rod transducing. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48, 5445-5453 (2007).
- Olsson, J. E., et al. Transgenic mice with a rhodopsin mutation (Pro23His): a mouse model of autosomal dominant retinitis pigmentosa. Neuron. 9, 815-830 (1992).
- Humphries, M. M., et al. Retinopathy induced in mice by targeted disruption of the rhodopsin gene. Nat. Genet. 15, 216-219 (1997).
- Hruby, K. Clinical examination of the vitreous body. Proc. Roy. Soc. Med. 47, 163-170 (1953).
- Kolniak, T. A., Sullivan, J. M. cell-based toxicity screen of potentially therapeutic post-transcriptional gene silencing agents. Experimental Eye Research. 92, 328-337 (2011).
- Qi, Y., et al. Trans-corneal subretinal injection in mice and its effect on the function and morphology of the retina. PLoS One. 10 (8), 0136523 (2015).
- Timmers, A. M., Zhang, H., Squitieri, A., Gonzalez-Pola, C. Subretinal injections in rodent eyes: effects on electrophysiology and histology of rat retina. Mol. Vis. 7, 131-137 (2000).
- Johnson, C. J., Berglin, L., Chrenek, M. A., Redmond, T. M., Boatright, J. H., Nickerson, J. M. Technical brief: subretinal injection and electroporation into adult mouse eyes. Mol. Vis. 14, 2211-2226 (2008).
- Sullivan, J. M., Yau, E. H., Taggart, R. T., Butler, M. C., Kolniak, T. A. Bottlenecks in development of therapeutic post-transcriptional gene silencing agents. Vision Res. 48, 453-469 (2008).
