Investigando a von Willebrand Factor fisiopatologia usando um modelo de câmara de fluxo de von Willebrand Factor-plaquetas String formação

Resumo

Neste trabalho, descrevemos um método para avaliar endotelial von Willebrand fator liberação e as plaquetas subsequentes capturam sob tensão de cisalhamento de fluido em resposta a estímulos inflamatórios, usando um sistema de câmara de fluxo em vitro .

Resumo

Fator de von Willebrand (VWF) é um fator de coagulação multiméricas glicoproteína que medeia adesão plaquetária e agregação em locais de dano endotelial e que transporta o fator VIII na circulação. VWF é sintetizada pelas células endoteliais e também é lançado constitutivamente para o plasma ou é armazenada em organelas especializadas, chamadas corpos de Weibel-Palade (WPBs), para a liberação sob demanda em resposta ao desafio hemostática. Procoagulante e proinflammatory estímulos podem induzir rapidamente exocitose WPB e lançamento do VWF. A maioria de VWF liberado pelas células endoteliais circula no plasma; no entanto, uma proporção de VWF é ancorada à superfície da célula endotelial. Sob condições de cisalhamento fisiológica, VWF ancorada endotelial pode vincular a plaquetas, formando uma cadeia de caracteres de VWF-plaquetas que pode representar o nicho da formação de trombos. Um sistema de câmara de fluxo pode ser usado para observar visualmente a liberação de VWF de células endoteliais e a subsequente plaqueta de capturar em uma maneira que seja reprodutível e relevantes para a fisiopatologia da formação de trombos VWF-mediada. Usando esta metodologia, as células endoteliais são cultivadas em uma câmara de fluxo e são posteriormente estimuladas com secretagogues de induzir exocitose WPB. As plaquetas lavadas então são pintadas sobre o endotélio ativado. As plaquetas são ativadas e posteriormente ligam a sequências VWF alongadas na direção do fluxo do fluido. Usando os histones extracelulares como um estímulo procoagulante e proinflammatory, observamos maior formação de sequência de caracteres VWF-plaquetas células endoteliais histona-tratadas em comparação com as células endoteliais não tratadas. Este protocolo descreve uma avaliação quantitativa, visual e em tempo real da ativação de interações VWF-plaquetas em modelos de trombose e hemostasia.

Introdução

Trombose é a principal causa de mortalidade no mundo¹ e pode se desenvolver em resposta todysregulated plaquetária ativação e trombina geração em ambas as artérias veinsand. Os níveis plasmáticos de VWF são um regulador chave de coagulação do sangue, segundo o qual a níveis baixos (< 50%) resultar no distúrbio hemorrágico, conhecido como von Willebrand (VWD) de doença² e níveis elevados (> 150%) estão associados com um risco aumentado de venosa³ e trombose arterial⁴ .

VWF é uma glicoproteína multiméricas sintetizada pelos megacariócitos e células....

Protocolo

Estes estudos foram aprovados pelo University, Canadá da investigação ética Board da rainha.

1. endothelial da pilha estimulação

1. Uma placa de cultura de tecidos de 6-poços de colágeno-casaco.
   1. 24 h de antecedência, casaco, uma placa de cultura de tecidos de 6-poços em 37 ° C, com 1 mL de colágeno de buffer (50 µ g/mL rato cauda colágeno tipo 1 com 0,02 M de ácido acético glacial).
   2. Lave os poços duas vezes com 2 mL de Hank está equilibrado sal solução (HBSS).
      Nota: As placas podem ser embrulhadas em papel alumínio e armazenadas em um saco de plástico hermético a 4 ° C.

Resultados

Para avaliar diretamente o efeito das histonas na liberação VWF de células endoteliais, estamos expostos a confluentes BOECs de PMA contendo soro livre médio (controle positivo), UH, HR e HK por 2 h. Nós mostramos que a HK induziu um aumento de 2 vezes em proteínas VWF (VWFAg) no meio de células endoteliais expostas (Figura 1). Curiosamente, quando BOECs foram estimulados com UH e RH, lá era menos VWFAg detectado no meio do que na condição de não tratada. For.......

Discussão

Enquanto a relevância fisiológica do VWF-plaquetas cordas permanece controverso devido a sua rápida dissolução na presença da VWF-cleaving protease ADAMTS13, eles servem como um modelo quantificável em vitro de recrutamento de plaquetas pelo VWF para um site em que um trombo pode formar na presença de localizadas aumentos nos níveis de histona⁵. Além disso, em patologias falta ADAMTS13 atividade-tais como púrpura trombocitopênica trombótica (PTT) - ou no microambiente inflamatório - onde .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Histonas não fracionadas do timo de bezerro (UH)	Worthington Biochemical	HLY	Reconstituído em meio com redução de soro (5 mg/mL)
Histonas ricas em lisina de timo de bezerro (HK)	Sigma-Aldrich	H5505	Reconstituído em meio com redução de soro (5 mg/mL)
Histonas ricas em arginina de timo de bezerro (HR)	Sigma-Aldrich	H4830	Reconstituído em meio com redução de soro (5 mg/mL)
Phorbol 12-miristato 13-acetato (PMA)	Sigma-Aldrich	P8139	Reconstituído em DMSO (20 mM)
Histamina	Sigma-Aldrich	H7125-1G	Reconstituído em água (50 mg/mL)
3,3' Dihexiloxacarbocianina Iodeto (DiOC6)	Invitrogen	D273	Reconstituído em metanol (20 mM)
Anticorpo de revestimento anti-VWF de coelho	DAKO	A0082	para VWF ELISA
Anticorpo de detecção anti-VWF de coelho, conjugado com HRP	DAKO	P0026	Para VWF ELISA e ensaio de ligação de histona-VWF
Nunc MaxiSorp microplacas de fundo plano de 96 poços	eBioscience	44-2404-21	Para ensaio de ligação de histona-VWF
Immulon 4 HBX Flat Bottom Microtiter 96-Well Placas Thermo	Scientific	3855	Para VWF ELISA
Humate-P	CSL Behring	N / A	Fator de von Willebrand humano derivado de plasma/complexo de fator VIII
Plasma de referência normal	Precision BioLogic	CCNRP-05	Para VWF Curva padrão ELISA
Reagente de dicloridrato de O-fenilenodiamina (OPD)	Sigma-Aldrich	P8287	Produto equivalente disponível através da ThermoFisher Scientific (Número de catálogo: 34006)
EGM-2 BulletKit	Lonza	CC-3162	Para cultura e inicial semeadura de BOEC
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	ThermoFisher Scientific	14025092
Rat-tail Collagen Type 1	Corning	354236
Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Media	ThermoFisher Scientific	31985070	Para estimulação de células endoteliais
METAMORPH Microscopia Software de Automação e Análise de Imagem	Dispositivos Moleculares	N/A
Tubos de Coleta de Sangue BD Vacutainer, Sem Aditivo	BD Biosciences	366703
µ-Slide III 0.1 (câmaras de fluxo)	Ibidi		Este produto foi descontinuado. Sugerimos usar µ-Slide VI 0.1 (#80661) ou 0.4 (# 80601) e recalcular a taxa de fluxo e o volume de plaquetas necessários para manter uma tensão de cisalhamento de 4.45 dyn/cm2
Tubo de silicone 1.6 mm ID: 5 m, esterilizado	Ibidi	10842
Luer Lock Connector Fêmea: polipropileno natural, esterilizado	Ibidi	10825
Cotovelo Luer Connector Macho: polipropileno branco, esterilizado	Ibidi	10802
Agulha 18G sem corte	BD Biosciences	305180
Seringas de 20 mL	BD Biosciences	302830
Bomba de seringa	New Era Pump Systems Inc. NE-1600 Multi-PhaserTM	N/A
Quorum WaveFX- Microscópio de disco giratório 4X1	Quorum Technologies	N/A
Software de processamento de imagem	ImageJ	N/A