Peptídeos e proteínas quantificação usando Automated imuno-MALDI (iMALDI)

Huiyan Li; Robert Popp; Bjorn Frohlich; Michael X. Chen; Christoph H. Borchers

doi:10.3791/55933

É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Peptídeos e proteínas quantificação usando Automated imuno-MALDI (iMALDI)

7.1K vistas

⸱

DOI:

10.3791/55933

⸱

18 de agosto de 2017

Huiyan Li¹ , Robert Popp¹ , Bjorn Frohlich¹ , Michael X. Chen² , Christoph H. Borchers¹^,³^,⁴^,⁵

¹University of Victoria-Genome BC Proteomics Centre, ²Jewish General Hospital, McGill University, ³Dept of Biochemistry and Microbiology, University of Victoria, ⁴Proteomics Centre, Segal Cancer Centre, Lady Davis Institute, Jewish General Hospital, McGill University, ⁵Gerald Bronfman Department of Oncology, Jewish General Hospital

Neste artigo

Resumo

Um protocolo para a quantificação de proteínas em fluidos biológicos complexos usando tecnologia automatizada imuno-MALDI (iMALDI) é apresentado.

Resumo

Espectrometria de massa (MS) é uma das tecnologias mais utilizadas para quantificar proteínas em amostras complexas, com especificidade de excelente ensaio em resultado da detecção direta de relação massa-de-carga de cada molécula do alvo. No entanto, proteômica baseada em MS, como a maioria das outras técnicas analíticas, tem um viés para medição alta abundância analitos, então é um desafio para atingir limites de deteção de baixo ng/mL ou pg/mL em amostras complexas e isto é o intervalo de concentração para muitos doença-relevantes proteínas em biofluids tais como plasma humano. Para auxiliar na detecção de baixa abundância analitos, imuno-enriquecimento foi integrado no ensaio para concentrar-se e purificar o analito antes da medição do MS, melhorando significativamente a sensibilidade do ensaio. Neste trabalho, a imuno - Matrix-Assisted Laser dessorção/ionização (iMALDI) tecnologia é apresentada para a quantificação de proteínas e peptídeos em biofluids, com base em imuno-enriquecimento em grânulos, seguida por MALDI-MS medição sem prévia eluição. Os anticorpos antipeptídeos são acrescidos em grânulos magnéticos e incubados com amostras. Após a lavagem, os grânulos são transferidos diretamente em uma placa de destino MALDI, e os sinais são medidos por um MALDI-tempo de instrumento de voo (MALDI-TOF) após a solução de matriz foi aplicada aos talões. O procedimento de preparação de amostra é simplificado em comparação com outros ensaios imuno-MS, e a medição de MALDI é rápida. A preparação de toda a amostra é automatizada com um manuseio sistema, com reprodutibilidade do ensaio melhorada e uma taxa de transferência de líquidos. Neste artigo, o ensaio de iMALDI é usado para determinar a angiotensina peptídeo eu (Ang eu) concentração no plasma, que é usado clinicamente como leitura da atividade de renina do plasma para o rastreio de aldosteronismo primário (PA).

Introdução

Espectrometria de massa tornou-se uma ferramenta indispensável em proteômica quantitativa. Espectrometria de massa pode determinar as massas de alvo proteínas ou peptídeos, portanto, os sinais obtidos do analito podem ser altamente específicos em comparação com os imunoensaios. Dois métodos de ionização, electrospray e MALDI, são mais comumente utilizados para a detecção de proteínas e peptídeos¹^,²^,³^,⁴. Um grande desafio na quantificação da proteína baseada em MS situa-se na detecção de proteínas de baixo-abundância em amostras complexas, em....