Apresentamos um protocolo para a rápida caracterização da biomolecular de dobramento e vinculação interações com ligantes termolábil utilizando Calorimetria exploratória diferencial.
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Artigo de método
Medição de perfis Biomolecular DSC com ligantes termolábeis para caracterizar rapidamente de dobramento e vinculação de interações
Neste artigo
Resumo
Resumo
Diferencial de calorimetria de varredura (DSC) é uma técnica poderosa para quantificação dos parâmetros termodinâmicos que regem biomolecular de dobramento e interações de ligação. Esta informação é fundamental na concepção de novos compostos farmacêuticos. No entanto, muitos ligantes farmaceuticamente relevantes são quimicamente instáveis a temperaturas elevadas, usado em análises de DSC. Assim, as interações de ligação de medição é um desafio porque as concentrações de ligantes e termicamente-convertido produtos estão constantemente mudando dentro da célula do calorímetro. Aqui, apresentamos um protocolo usando ligantes termolábeis e DSC para rapidamente obter informação termodinâmica e cinética sobre o dobramento, a vinculação e ligante processos de conversão. Nós aplicamos nosso método para aptamer o DNA MN4 que vincula a cocaína de ligante termolábil. Usando uma nova análise de encaixe global que é responsável para a conversão de ligante termolábeis, o conjunto completo de dobramento e parâmetros de ligação são obtidos a partir de um par de experimentos de DSC. Além disso, mostramos que a constante de velocidade para a conversão de ligante termolábeis pode ser obtida com apenas um conjunto de dados suplementar DSC. As orientações para a identificação e análise de dados de vários cenários mais complicados são apresentadas, incluindo agregação irreversível da biomolécula, dobramento lento, ligação lenta e rápido esgotamento do ligante termolábil.
Introdução
Diferencial de calorimetria de varredura (DSC) é um método poderoso para dosar biomolecular vinculação e dobramento interações1,2,3. Os pontos fortes do DSC incluem sua habilidade de elucidar de ligação e mecanismos de dobramento e para produzir os correspondentes parâmetros termodinâmicos2,3. Além disso, o DSC pode ser executada em solução sob condições fisiológicas perto e não exige a rotulagem da biomolécula ou ligante, por exemplo, com fluorophores, rotação-etiquetas ou isótopos nucleares
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Protocolo
1. preparação da amostra
- Purifica o desejado biomolécula13.
Nota: Este protocolo usa comprada cocaína-ligação DNA aptamer MN4 após a troca contra 2 M NaCl três vezes seguido por três rodadas de água desionizada, utilizando um filtro centrífugo com uma membrana de corte de peso molecular 3 kDa. - Sintetizar e purificar ou comprar o desejado ligante termolábil13.
Nota: MN4 vincula a cocaína de ligante termolábil. MN4 também vincula o quinino, que é usado como um controle negativo para thermolability de ligante a estas temperaturas experimentais. - Prepare amortecedores para diálise da biomol....
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Resultados
Dados representativos para o DSC ligante termolábeis são mostrados na Figura 1. A posição e a altura do pico do ligand-limite termolábil sucessivamente se desloca para baixo no sentido da biomolécula desacoplada como o ligante termolábil está esgotado com cada verificação (Figura 1a). O perfil de desnaturação livre é usado como uma referência para o ponto de extremidade de conversão termolábil ligante (Figura.......
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Discussão
Modificações e solução de problemas
Os detalhes da análise global de encaixe usado na Figura 1 e Figura 2 têm sido descritos anteriormente4. Aqui, podemos descrever aspectos práticos de executar e analisar experimentos de vinculação DSC com ligantes termolábil. Observe que uma linha de base do DSC obtidos para o ligante termolábil sozinho é subtraído do ligante + biomolécula dataset, efetivament.......
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Divulgações
Os autores declaram não há conflitos de interesse.
Agradecimentos
R. W. H. V foi apoiado pelo programa de treinamento engenharia pesquisa Conselho de Canadá (NSERC) em Bionanomachines e ciências naturais de McGill. A. K. M. e P. E. J. foram apoiados por subsídios NSERC 327028-09 (r. K. M) e 238562 (P. E. J.).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Cloreto de sódio | Chem Impex | #00829 | |
| Fosfato de sódio monobásico di-hidratado | Sigma Aldrich | 71502 | |
| Fosfato de sódio dibásico | Sigma Aldrich | S9763 | |
| Água desioinizada para biologia molecular | Millipore | H20MB1001 | |
| 0,2 mícron | VWR | CA28145-477 | |
| Filtros centrífugos de 3 kDa | de | Millipore | |
| Corte de 0,5-1,0 kDa | Spectrum Laboratories | 131048 | |
| Tubo de silício | VWR | 89068-474 | |
| Tampas de flange DSC de plástico | TA Instruments | 6111 | |
| Aptâmero de DNA MN4 | Integrated DNA | Technologies https://www.idtdna.com/site/order/menu | |
| Cocaína | Sigma Aldrich | C008 | |
| Quinino | Sigma Aldrich | 22620 | |
| NanoDSC-III microcalorímetro | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/nanodsc/ | |
| DSCRun software | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/ | |
| Software NanoAnalyze | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/ | |
| Contrad-70 | VWR | 89233-152 |
Referências
- Bruylants, G., Wouters, J., Michaux, C. Differential scanning calorimetry in life science: thermodynamics, stability, molecular recognition and application in drug design. Curr Med Chem. 12 (17), 2011-2020 (2005).
- Privalov, P. L., Dragan, A. I.
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Reimpressões e permissões
