Espectroscopia de força das moléculas de proteína único, usando um microscópio de força atômica

Resumo

Descrevemos os procedimentos detalhados e estratégias para medir as propriedades mecânicas e mecânicas vias desdobramento de moléculas de proteína único, usando um microscópio de força atômica. Também mostramos resultados representativos como uma referência para a seleção e a justificativa de gravações de molécula de proteína única boa.

Resumo

A determinação do processo de dobramento de proteínas da sua sequência de aminoácidos para sua estrutura nativa 3D é um problema importante na biologia. Microscopia de força atômica (AFM) pode resolver este problema, permitindo o alongamento e relaxamento das moléculas de proteína único, que dá a evidência direta de desdobramento e dobrar características específicas. AFM-based single-força-espectroscopia molecular (AFM-SMFS) fornece um meio para medir consistentemente alta energia conformações em proteínas que não são possíveis em medições (Bioquímica) em massa tradicional. Embora numerosos foram publicados para mostrar os princípios de AFM-SMFS, não é fácil conduzir experimentos SMFS devido à falta de um protocolo completo exaustivamente. Neste estudo, podemos ilustrar brevemente os princípios da AFM e extensivamente detalham os protocolos, procedimentos e análise de dados como uma diretriz para alcançar bons resultados de experimentos SMFS. Podemos demonstrar resultados representativos de SMFS de medições de desdobramento mecânico só proteína e nós fornecemos a solução de estratégias para alguns comumente encontrado problemas.

Introdução

Avanços em espectroscopia de força única molécula (SMFS) por AFM permitiram a manipulação mecânica e caracterização precisa das moléculas de proteína única. Esta caracterização tem produzido novos insights sobre proteína mecânica^1,2, proteína³de dobramento, de interações proteína-ligante⁴de interações proteína-proteína⁵, e à base de proteínas engenharia materiais de^7,6,8. SMFS é especialmente útil para estudar proteínas desdobramentos, como alonga....

Protocolo

1. a proteína preparação

1. Clonagem de DNA.
   1. Sintetizar uma sequência de DNA de interesse, por exemplo, a sequência de DNA de NI₁₀C¹⁰, ou isolar através do PCR do organismo hospedeiro usando padrão biologia molecular técnicas¹¹. Flanqueiam o gene de interesse, com sites de restrição durante a síntese ou colocando sites na extremidade 5'-dos primers PCR para corresponder a um módulo em pEMI91 o plasmídeo (Addgene #74888)¹².
   2. Digeri separadamente tanto o plasmídeo pEMI91¹² e a sequência de DNA de interesse com um par de sítios de r....

Resultados

Resultados representativos do presente protocolo são mostrados na Figura 2. Ambos os painéis mostram curvas força-extensão representativa das proteínas. A parte superior mostra os resultados uma poliproteína I91, enquanto a parte inferior mostra a proteína I91 flanqueando um proteína de interesse, a molécula de₁₀C NI. Estas gravações mostram o vigor característico do I91 (200 pN) e contorne o incremento de comprimento (28 nm) que indica que o alinh.......

Discussão

Um passo crítico no protocolo é a utilização de uma poliproteína, descrita na etapa 1.1.2, que serve como um controle positivo de "impressões digitais" single-molécula eventos. Geralmente, deve ser desdobramento eventos das proteínas poliproteína (para I91, isso significa uma força de desdobramento de cerca de 200 pN e contorno incremento de comprimento de cerca de 28 nm) para concluir inequivocamente que a proteína de interesse tem sido desdobrada. Por exemplo, quando a proteína de interesse é flanqueada por três domíni.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Discos do espécime do AFM, diâmetro de 15mm	Ted Pella, Inc.	16218	Servir como base para substrato de vidro
Lamínulas de vidro redondas, 15 mm de diâmetro No.1 Thick	Ted Pella, Inc.	26024	servem como substrato de vidro e base para revestimento de ouro
Abas adesivas	Ted Pella, Inc.	16079	Cole em discos do espécime do AFM para fornecer uma cara pegajosa para unir lamínulas de vidro
STD Conjunto principal multimodo	Bruker Nano Inc.	1B75C	AFM cabeça
de vidro suporte de sonda de vidro	Bruker Nano Inc.	MTFML-V2	para varredura em fluido com o AFM Multimodo.
As pontas de prova de Microlever AFM	Bruker Nano Inc.		Os cantilevers do nitreto de silicone de MLCT com pontas do nitreto de silicone, ideais para pontas de prova AFM dos modos da imagem latente
do contato com pontas revestidas Au	Bruker Nano Inc.	OBL-10	para puxar proteínas com baixa força de desdobramento
Cartão de aquisição de dados multifunções (DAQ), 16 bits, 1 MS/s (multicanal), 1,25 MS/s (1 canal), 32 entradas analógicas	Instrumentos nacionais	PCI-6259	Aquisição de dados para sinais da cabeça AFM e atuadores piezoelétricos
LISA Linear Piezo Stage Actuators	Physik Instrumente LP	P-753.11C	Atuador Piezo para controlar a posição do substrato e realizar medições de tração
XY Piezo Stage	Physik Instrumente LP	P-541.2CD	Atuador Piezo para controlar a posição do substrato e digitalizar na superfície do substrato

Suporte de sonda de vidro Suportes