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Artigo de método

Um modelo de cultura celular de artérias de resistência

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DOI:

10.3791/55992

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8 de setembro de 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, University of Virginia School of Medicine, 2Robert M. Berne Cardiovascular Research Center, University of Virginia School of Medicine, 3Department of Hematology, St. Jude Children's Research Hospital, 4Research Histology Core, University of Virginia School of Medicine

Neste artigo

Resumo

É descrito um modelo de cultura celular de artérias de resistência, permitindo a dissecção da sinalização de caminhos no endotélio, músculo liso, ou entre o endotélio e músculo liso (a junção de myoendothelial). A aplicação selectiva de agonistas ou isolamento da proteína, microscopia eletrônica ou imunofluorescência pode ser utilizada usando esse modelo de cultura celular.

Resumo

A junção myoendothelial (MEJ), um único microdomain sinalização nas artérias de resistência de pequeno diâmetro, exibe a localização de proteínas específicas e processos de sinalização que podem controlar o tônus vascular e pressão sanguínea. Como é uma projeção de qualquer célula endotelial ou músculo liso e devido ao seu pequeno tamanho (em média, uma área de ~ 1 µm2), o MEJ é difícil estudar isoladamente. No entanto, nós desenvolvemos um modelo de cultura de células chamado de cultura de células vasculares, co (VCCC) que permite em vitro MEJ formação, polarização da célula endotelial e dissecação de processos na parede vascular da resistência e proteínas de sinalização artérias. A VCCC tem uma infinidade de aplicações e pode ser adaptado para se adequar a diferentes tipos de células. O modelo consiste de dois tipos de células cultivados em lados opostos de um filtro com 0,4 µm poros, em que o em vitro Dinho Mello pode formar. Aqui descrevemos como criar o VCCC via chapeamento de células e isolamento de endotelial, MEJ e frações de músculo liso, que podem ser usadas para o isolamento de proteínas ou atividade ensaios. O filtro com camadas de célula intacta pode ser fixo, incorporado e seccionado para análise de imunofluorescência. Importante, muitas das descobertas deste modelo foram confirmadas usando artérias de resistência intacta, ressaltando sua relevância fisiológica.

Introdução

Nas artérias de resistência de pequeno diâmetro, uma fina lâmina elástica interna (IEL) separa endotelial (CE) e células musculares lisas (SMC). As células podem projeto através de furos nesta matriz elástica e fazer conexões citoplasmáticas diretas via lacuna junção canais1,2. Esta estrutura original é denominada junção myoendothelial (MEJ). O MEJ é um pequeno (aproximadamente 0,5 µm x 0,5 µm, dependendo da cama vascular), projeção celular composta predominantemente por células endoteliais, mas pode se originar de músculo liso também3,4. Um número de investigadores demonstraram a imensa complexidade de sinalização de redes que ocorrer seletivamente no MEJ, tornando-o um local especialmente importante para facilitar a sinalização de bi-direcional entre endotélio e músculo liso5 ,6,7,8,9,10.

No entanto, uma dissecação mecanicista das vias de sinalização para o MEJ é difícil em uma artéria intacta. Porque o MEJ é uma projeção de celular, não é atualmente possível isolar um na vivo MEJ da parede vascular. Por este motivo, foi desenvolvido o modelo VCCC1 . Importante, a VCCC Replica fisiológicas morfologia endotelial11 e polarização de sinalização entre o apical e MEJ porções da célula12. Foi este modelo que facilitou a descoberta de que a alfa-hemoglobina na célula endotelial, é polarizada para o MEJ. Isto está em contraste com células endoteliais convencionalmente cultivadas que não expressam alfa hemoglobina13. Para pesquisadores interessados no endotélio microvascular, pode ser mais adequado utilizar células endoteliais, que tenham sido cultivadas na VCCC, particularmente se a intenção é dissecar as vias de sinalização que ocorrem nas artérias de resistência de pequeno diâmetro.

Usando uma inserção plástica resistente, contendo um filtro com poros de pequeno diâmetro (0,4 µm de diâmetro) para tipos de células distintas de co-cultura dois impede que as células migrando entre camadas. Isso resulta em uma distância de 10 µm entre as células, que é significativamente maior do que em vivo, mas ainda Replica muitas das características de Dinho Mello, incluindo a localização da proteína e segundo mensageiro sinalização1 na vivo , 14. Além disso, o VCCC permite a segmentação da célula tipo específico de sinalização através da adição de um agonista ou antagonista ao compartimento celular específico. Por exemplo, carregar o CE com BAPTA-AM de Quelato de cálcio e estimulando o SMC com fenilefrina14. Em contraste com outras descrições de co-cultura modelos15,16,17,18,19,20,21, isto fornece instruções sobre como isolar as distintas frações de mRNA e proteína, incluindo a fração MEJ distinta dentro dos poros do filtro. A adição desta técnica para a VCCC permite investigações específicas de mudanças na localização do mRNA ou transcrição22, fosforilação de proteínas12,23e proteína atividade12. Este artigo irá descrever chapeamento da CE no topo do filtro e SMC na parte inferior, embora seja possível à cultura os tipos de duas células em diferentes conformações11,18,24.

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Protocolo

1. chapeamento de células para a VCCC

  1. cultura grande 225 cm 2 frascos de CE e SMC em condições estéreis a 37 ° C, até 70-90% de Confluencia. Certifique-se de que a CE mais do que o SMC são usados; se usando CE humana primária e SMC, tipicamente 3 frascos grandes da CE para 1 frasco grande de SMC.
    1. Use as células primárias em passagens inferiores e não use passado passagem 10. Escolha os meios de cultura com base em células a ser co culta. Para artéria coronária primária humana CE, use mídia basal EBM-2 CE com fatores de crescimento EGM2 MV. Para SMC coronária humana primária, use mídia basal SmBM SMC com fatores de crescimento SmGM-2. Antes da sua utilização com células cultivadas, adicionar fatores de crescimento para a mídia.
  2. Construção do VCCC dia 1: Spray pratos de Petri (150 mm) grande e tampas com desinfetante (por exemplo, Cavicide) e limpe com uma toalha de papel ou toalhetes de fiapos. Em seguida pulverizar os pratos de Petri com 70% de etanol (EtOH) e colocá-los na capa de ar seco.
  3. Abrir a placa de pastilhas do filtro (consulte a Tabela de materiais) em condições estéreis e revestimento do lado SMC (parte inferior do filtro) da inserção com solução de fibronectina. Manter a inserção na placa 6-bem fornecida, pipetar a solução de fibronectina através do lado corta a parte inferior da placa, certificando-se que o fundo metade do filtro é coberto (não mais de 1 mL).
  4. Após 30 min de tratamento com solução de fibronectina à temperatura do capuz de cultura celular, leve inserções fora da placa, vácuo qualquer solução em excesso e invertido, colocando no fundo metade do prato de Petri limpa. Posta de lado. Certifique-se para não perturbar o filtro de membrana de inserção quando aspirar a solução em excesso; Isto pode ser evitado pelo delicadamente inclinando a placa e aspirar a solução fora da borda da inserção da.
  5. Trypsinize um 225 cm 2 frasco de SMC com 3 mL de solução de X do Trypsin-EDTA 2 previamente aquecido, e uma vez que as células têm levantado o prato, adicionar mídia SMC 9 mL para neutralizar a tripsina (3:1, mídia: tripsina). Transfira para um tubo cónico, misture bem e pipetar 10 µ l em um hemocytometer para determinar o número de celular.
    1. Contagem do número de células em 5 x 5 caixas (ou seja, 18), multiplique isso por 10.000 para obter o número de células em 1 mL (180.000). Então, multiplique por 12 mL (volume total de suspensão de células, SMC 2,16 milhões). Certifique-se de que há suficiente SMC para o número desejado de poços da placa.
      Nota: por exemplo, 1 bem deve ter 75.000 SMC e, portanto, 18 poços teria SMC total 1,35 milhões. Dividir células 1,35 milhões necessárias por 180.000 células / mL 1 e isso resulta em 7,5 mL da suspensão de células que serão necessários para o chapeamento. Em seguida, calcular o volume final necessário (18 poços x 750 µ l = 13,5 mL). Assim, tomar 7,5 mL da suspensão de células, trazer o volume com mídia SMC previamente aquecido e misture bem até 13,5 mL.
  6. Placa 750 µ l de suspensão de células contendo aproximadamente 75.000 SMC na parte inferior de cada filtro, tomando cuidado para não derramar nenhum da solução de mídia e o celular. Coloque a tampa na parte superior e transferir com cuidado a placa de Petri com as inserções para a incubadora a 37 ° C durante a noite.
    Nota: A densidade celular ideal para outros tipos de célula terá que ser determinado empiricamente.
  7. No dia 2, encher bem limpo 6 pratos com 2 mL de mídia SMC fresca, previamente aquecida. Retire as placas da incubadora. Leve as inserções para fora um de cada vez e remova a mídia por sucção, em seguida, coloque no prato com mídia SMC 6-poços.
  8. Casaco do lado oposto do filtro (lado do CE), com 1 mL de uma solução de gelatina bovina de 0,5% pelo menos 30 min a 37 ° C.
  9. Trypsinize a 225 cm 2 flask(s) da CE com 3 mL de pré-aquecido 2 X Trypsin-EDTA (10 x diluído em Dulbecco estéril ' s PBS) solução, com suave toque do balão a fim de levantar as células no prato.
    Nota: Pode ser necessário colocar o balão de volta para a incubadora a 37 ° C por 1-3 min.
    1. Uma vez que as células tem levantado o prato, adicionar mídia de CE 9 mL para neutralizar a tripsina (3:1). Transfira para um tubo cónico, piscina juntos, misture bem e pipetar 10 µ l em um hemocytometer para determinar o número do celular.
      1. Contagem do número de células em 5 x 5 caixas (ou seja, 60), multiplique isso por 10.000 para obter o número de células em 1 mL (600.000). Então, multiplique por 12 mL (volume total de suspensão de células, CE 7,2 milhões). Certifique-se de que há suficiente CE para o número desejado de poços da placa.
        Nota: CE aproximadamente 360.000 são necessários por bem. Por exemplo, 18 poços exigem 6,48 milhões EC. Dividir células 6,48 milhões necessárias pela CE 600.000 por 1 mL e isso resulta em 10,8 mL de suspensão de células que serão necessários para o chapeamento. Em seguida, calcular o volume final necessário (18 poços x 1 mL = 18 mL). Assim, 10,8 ml da suspensão de células, trazer o volume até 18 mL com pré aquecido mídia CE e ressuspender delicadamente.
  10. 1 mL de 360.000 CE no lado superior de cada filtro de inserção da placa. Deixe que as células incubar imperturbável a 37 ° C, por meio de substituir 24 h. no dia 4. Colheita no dia 5.

2. Colheita de frações da VCCC

  1. executar o isolamento em uma sala de 4 ° C e manter todos os instrumentos na Ice.
  2. Manter em mente o número de inserções individuais sendo isolado e adicionar Lise para um tubo de 50ml rotulado MEJ (para os filtros isolados). Em seguida, dois pratos de 10mm de rótulo; uma para CE e outra para SMC.
  3. Ajustar o volume de tampão de Lise dependendo como concentrado precisa ser o lisado; para 15 insere, 500 µ l de tampão de Lise para o tubo do MEJ e 250 µ l por placa de Petri são recomendados.
  4. Trabalho com um 6-placa de pastilhas de cada vez. Sucção fora o médio no capô de cultura celular e depois transporte para uma sala fria na Ice.
    Nota: As instruções a seguir são para 1 Insira isolamento.
  5. Pipeta de 10 µ l de PBS 1x para o lado SMC da inserção da.
  6. Utilize o elevador de célula para raspe as células para uma extremidade da inserção e transferir as células de suporte de atendimento para o prato de Petri de SMC, que tem o tampão de Lise em la
  7. , Uma vez que o levantador celular tocou a Lise no prato, não deixe-o tocar o filtro de inserir até foi completamente apagado e secar sobre papel-toalha. Repita a raspagem do filtro SMC pelo menos uma a duas vezes para remover totalmente os detritos de células restantes SMC.
  8. Transformar a inserção sobre e pipetar 10 µ l de PBS 1x do lado superior/CE do filtro de inserção. Repita as etapas 2.6 e 2.7 com um raspador de célula e o prato de Petri CE.
  9. Recolher as restantes células e chorume de PBS do lado CE do filtro com uma pipeta e transferência para o prato de Petri CE com Lise. Ser muito minucioso em raspar as células fora ambos os lados do filtro sobre deixar contaminação mínima de CE/SMC na fração MEJ.
  10. Cuidadosamente use o bisturi para cortar o filtro da inserção plástica. Para fazer isso, corte 70-80% do que longe de plástico e use a pinça para puxar o filtro completamente fora da estrutura de inserção plástica. Coloque o filtro no tubo cónico de 50ml rotulado MEJ com Lise e certifique-se de que participa a Lise e permanece molhada.
  11. Repita as etapas de isolamento, em grupos de 6, até que todas as inserções foram processadas.
  12. Garantir que os grupos de tratamento diferentes são mantidos em tubos separados e pratos.
  13. Vortex o tubo cónico de MEJ 50ml na máxima força para 15 s ou até misturado bem. Retire os filtros do MEJ cónico com fórceps, arrastá-las ao longo das paredes do lado do tubo a deixar a quantidade máxima de proteínas e líquido no tubo. Após este ponto, descartar os filtros.
  14. , Uma vez que todos os filtros foram removidos do tubo cónico de MEJ, fazer uma volta rápida (10-15 s a velocidade máxima ~ 16.000 x g) em uma centrífuga para puxar todo o líquido e proteínas para o fundo do tubo. Transferir o conteúdo do tubo MEJ e os CE e SMC Petri pratos para tubos de centrífuga separado, menor.
  15. Opcional: proceda à sonicação o conteúdo dos tubos MEJ/SMC/CE na configuração 4 para pulsos de três 10 s no gelo ou homogeneizar suavemente pela mão.
  16. Centrifugar a velocidade máxima (~ 16.000 x g) 15 min a 4 ° C. Pipetar o sobrenadante de fora e do ensaio o lisado para conteúdo de proteína usando o método de ensaio de bicinchoninic.

3. Colheita a VCCC por imunofluorescência Rosto En

  1. de incubação no dia 5 de VCCC, remover as inserções da incubadora. Trabalhando no bairro cultura celular, sucção fora da mídia SMC de cada um dos poços inferiores da inserção de filtro e lave duas vezes com PBS 1x. Repita com o lado de CE.
  2. Mantendo as inserções intacta e na placa, adicionar 4% paraformaldeído (PFA) por 10-20 min em uma sala de walk-in 4 ° C num agitador suave. Lave os dois lados do filtro inserir com PBS 1x por 5 min e repita duas vezes.
    Cuidado: PFA é tóxico e deve ser manuseado com cuidado.
  3. Realizar a incubação do anticorpo de bloqueio, primário e secundário na placa, garantindo que ambos os lados do filtro são mantidos no anticorpo + solução de bloqueio (9 mL de PBS, 25 µ l Triton X100, 50 mg albumina de soro bovino, 500 µ l de soro normal)
  4. Para montar o filtro em um slide, cortar o filtro a inserção plástica com um bisturi, montado sobre um identificador e coloque sobre uma lâmina de microscópio com meio de montagem.

4. Colheita a VCCC por imunofluorescência transversal

  1. de incubação no dia 5 de VCCC, remover as inserções da incubadora. Os meios de comunicação de ambos os lados do filtro inserção do capuz de cultura celular de sucção e enxaguar cada lado do filtro duas vezes com PBS 1x.
  2. Mantendo as inserções intacta e na placa de 6, adicionar 4% PFA e incubar durante uma noite em um quarto de walk-in 4 ° C num agitador gentil.
    Cuidado: PFA é tóxico e deve ser manuseado com cuidado.

5. Incorporando a VCCC por imunofluorescência transversal

  1. após o filtro inserções tenham sido fixadas aproximadamente 24 h em 4% PFA, transferência para 70% EtOH pelo menos 24 h, mas até várias semanas.
  2. Processar os filtros em um longo (overnight), executado em um processador de tecido automatizado. Use o programa da seguinte forma: 70% EtOH para 30 min, 85% EtOH 30 min, 95% EtOH 30 min, 100% EtOH 30 min, 100% EtOH 45 min, 100% EtOH 45 min, xileno 30 min, xileno 30 min, xileno 45 min, 60 ° C de parafina 30 min, 30 min de parafina de 60 ° C , 45 min. de parafina de 60 ° C
  3. Após o processamento, transferir os filtros colhidos para a estação de encastre em parafina líquida, mantendo o filtro na gaveta.
  4. Retirar o filtro da gaveta, cuidadosamente, usando fórceps para segurá-la apenas na borda. Com uma tesoura, corte o filtro ao meio, formando dois semi circular em forma de metades. Lino cada uma das 2 metades na porção prato frio da estação de encaixe apenas tempo suficiente para encher a incorporação de um molde com parafina líquida.
  5. Uma vez cheio de parafina líquida, muito brevemente toca o molde encaixe para a placa fria, em seguida incorporar cada metade do filtro para incorporação de molde (cortado lado para baixo); isso garante que durante o corte, um vai cortar no centro do filtro em direção à borda .
  6. Durante a incorporação, usar pinça para segurar o filtro no lugar para evitar as metades de cair uns aos outros até que a parafina é legal o suficiente para eles ficar sozinho. Mover o molde de encaixe para um prato frio até completamente solidificado.
    Nota: Blocos em forma de gelo de refrigeração ajuda a prevenir seções enrugadas.

6. Seccionamento e manchando a VCCC por imunofluorescência transversal

  1. para os blocos de parafina de seccionamento e deslize de montagem: 5 µm de seções de corte, coloque as seções em banho maria a 42 ° C e pegar as seções usando positivamente carregado slides. Então mantenha slides durante a noite em um forno de 42 ° C para secar.
  2. Antes de iniciar as etapas de reidratação, asse os slides a 60 ° C para derreter a parafina e ajudar a aderir as seções VCCC para o slide. Esfriar rapidamente e, em seguida, Re-hidratar os slides por duas mudanças de xileno, 100% EtOH, 95% EtOH, uma mudança de 70% EtOH e duas mudanças de água destilada.
  3. Evitar métodos de recuperação de antígeno que envolvem microondas ou aquecimento como seções podem cair fora do slide.
  4. Executar o bloqueio padrão por 1h à temperatura ambiente, então a incubação durante a noite com o anticorpo primário a 4 ° C, seguido de lavagem passos e anticorpo secundário por 1h à temperatura ambiente. Montar com os meios de montagem e lamela.

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Resultados

As inserções de filtro usadas para a VCCC têm pequenas, 0,4 µm de furos. Figura 1A, uma rosto pt vista a inserção de filtro VCCC, mostra os poros no qual o MEJ pode formar em vitro. O diagrama esquemático retrata as células de músculo liso chapeadas no lado inferior do filtro, um dia antes das células endoteliais são banhadas no lado oposto (figura 1B). Uma vez que as células são banhadas, as frações de CE, MEJ ...

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Discussão

A VCCC tem uma série de vantagens em termos de recapitulando Dinho Mello em vitro, mas existem pontos de discussão ao determinar se o VCCC pode ser utilizado para aplicações específicas. Por exemplo, se diferentes tipos de células a ser usado com este modelo, ele precisará ser otimizado. Nós usamos as células humanas primárias, mas é possível isolar as células da aorta bovina24, ou sua ou mata-mata ratos, e usá-los na VCCC1,5...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela nacional do coração, pulmão e sangue Instituto concede R01088554, T32HL007284 e American Heart Association 14PRE20420024 de bolsa de doutoramento. Agradecemos especialmente a St Jude celular Imaging compartilhado pesquisa núcleo, incluindo Randall Wakefield e Linda Horner para as imagens de microscopia eletrônica, Adam Straub para obter assistência com imagens representativas da imunofluorescência e Pooneh Bagher por ela Comentários valiosos sobre o protocolo de manuscrito.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
24 mm de diâmetro, 0,4 µ m Transwell Poliéster membrana de membrana de inserçãoCorning3450Esta é uma placa de 6 poços de inserções
225 cm frascoCorning431082
6 placas de poços (sem inserções de filtro)Corning3506
Células endoteliais primárias da artéria coronária humanaLonzaCC-2585
Células musculares lisas da artéria coronária humana primáriaLonzaCC-2583
EBM-2 EC Meios basaisLonzaCC-3156
EC Fatores de crescimento (EGM2 MV Cotas únicas)LonzaCC-4147Adicionar aos meios basais antes de usar
SmBM SMC meios basaisLonzaCC-3181
SMC fatores de crescimento (SmGM-2 SingleQuot)LonzaCC-4149Adicionar aos meios basais antes de usar
0,5% Tripsina-EDTA 10XGibco15400-054Diluir para 2X com Hemocitômetro dPBS estéril
VWR15170-208
placas de Petri grandes para SMC Plating (150mm)Corning353025
Gelatina bovinaSigmaG-9382
Fibronectina humanaCorning3560085µ g/ml de fibronectina e armazenar a -20
10x Hanks' Buffered salt solution (HBSS)Gibco14065-056Diluir a 1x com água estéril
10x Dulbecco's Phosphate tamponed salina (dPBS)Gibco14200-075Diluir a 1x com água estéril
Bisturi curvo descartável (borda de corte de 30mm) com alçaAmazonMDS15210
ForcepsFisher17-467-201
Elevador de célulasCorning3008
Raspador de célulasBD Falcon353085
tubo cônico de 50 mLCorning352070
Placas de Petri de 10 mmFalcon35-1008
Rneasy mini kitQiagen74104
Reagente de lise de RNAQiagen79306
ParaformaldeídoSigma158127Faça a solução a 4% com dPBS
70% de etanolFisher04-355-305
Desinfetante de cavicidaFisher131000
Tampão de lise de proteína RIPASigmaR0278
Desmembranador sônicoFisherModelo 50
1x PBS para colheita EC/SMC e imunocitoquímicaGibco 10010023não precisa ser estéril
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Incorporação/Seccionamento/Coloração
ParafinaFisherP31-500
Processadora de tecidos automatizadaExcelsiorES
Estação de incorporação + placa friaLeicaHistoCore Arcadia
Tissue Tek Accu-Edge Lâmina de micrótomoVWR25608-961 ou 25608-964
Lâminas de microscópioThermo Fisher22-230-900
LamínulasThermo Fisher12-548-5E
Prolongar o meio de montagem GoldThermo FisherP36931
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Outras soluções**Execute todas as etapas em condições estéreis se estiver usando a solução em células vivas
Água estéril da autoclave dPBSpara esterilizar. Usando a água estéril, faça DPBS (450mL de água estéril: 50mL 10X DPBS), misture e filtre e esterilize (0,2µ m filtro).
Concentração final: 1X
estéril em autoclave HBSSpara esterilizar. Usando a água estéril, faça HBSS (450mL de água estéril: 50mL 10X HBSS), misture e filtre e esterilize (0,2µ m filtro).
Concentração final: 1X
estoque de fibronectinaUse 50mL de água estéril para fibronectina para fazer estoque de alíquotas de 1mL, depois congele até que seja necessário
Concentração final: 100µ g/mL
de fibronectina para revestir o lado SMC do VCCC, descongele uma alíquota e adicione 1mL de fibronectina (100µ g/mL) a 19mLs de 1X HBSS para atingir uma concentração final de 5µ g/mL.
Concentração final: 5µ g/mL
2x soluçãoDiluir o 10X 0,5% de tripsina-EDTA para 2X com 1X dPBS (40mL DPBS: 10mL 10X tripsina) .
Concentração final: 2X
Solução(9mL 1X PBS, 25mL Triton X100, 50mg de albumina de soro bovino, 500mL de soro normal)
Gelatina bovina para revestir EC VCCCMisture 0,5g de gelatina bovina em 100mL de água destilada. Autoclave antes do primeiro uso e armazene em temperatura ambiente. Manter em condições estéreis.
Concentração final: 0,50%
1x PBS para a colheita de célulasnão precisa ser estéril
águasolução de tripsina EDTA de bloqueio/anticorpo

Referências

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