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Artigo de método

Grânulo baseado Multiplex ensaio para análise de perfis de citocinas lágrima

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DOI:

10.3791/55993

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13 de outubro de 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1National Healthcare Group Eye Institute, Tan Tock Seng Hospital, 2Singapore Eye Research Institute (SERI), 3Institute of Molecular and Cell Biology, A*STAR, 4GROW Research Laboratory, Narayana Nethralaya Foundation, 5Vimta Labs Limited

Neste artigo

Resumo

Análise do filme lacrimal citocinas ajuda no estudo de várias doenças oculares. Grânulo baseado multiplex ensaios são simples e sensível e permitem o teste de alvos múltiplos em amostras com volumes pequenos. Aqui descrevemos um protocolo para lágrima filme cytokine perfis usando o um grânulo baseado multiplex do ensaio.

Resumo

Filme lacrimal é uma mistura complexa de lipídeos, proteínas e minerais que cobre a superfície externa do olho, proporcionando assim a lubrificação, nutrição e proteção para as células subjacentes. Análise de lágrimas é uma área emergente para a identificação de biomarcadores para a predição, diagnóstico e prognóstico de diversas doenças oculares. As lágrimas são facilmente acessíveis e sua coleção é não-invasivo. Portanto, avanço de tecnologias estão ganhando destaque para identificação dos vários analitos em lágrimas para estudar alterações na composição da proteína ou metabólito e sua associação com condições patológicas. Lágrima de citocinas são biomarcadores ideais para estudar a saúde da superfície ocular e também ajudam na compreensão dos mecanismos de diferentes transtornos de superfície ocular como doença de olho seco e conjuntivite vernal. Ensaios de multiplex do grânulo com base têm a capacidade de detectar analitos múltiplos em uma pequena quantidade da amostra com uma maior sensibilidade. Aqui descrevemos um protocolo padronizado de coleta de amostra de lágrima, extração e análise de citocinas perfil usando uma conta com base em ensaio multiplex.

Introdução

As lágrimas são produzidas pela glândula lacrimal e glândulas acessórias e revestir a superfície externa do olho. Filme lacrimal é composto por uma camada lipídica externa e uma camada interna aquosa que inclui proteínas solúveis, mucins e membrana limite mucins. Lágrimas impedem invasão microbiana, fornecem nutrientes e fornecem a lubrificação da superfície ocular. Lágrimas agir como interface entre o ar e o tecido para o transporte de oxigênio para a córnea. 1 filme lacrimal é composto por proteínas, carboidratos, lipídios e eletrólitos. A associação entre proteínas da lágrima com doenças sistêmicas e oculares como glaucoma, doença de olho seco, conjuntivite vernal, diabetes mellitus, câncer e Orbitopatia associada a tiroide foi identificada em vários estudos. 2 , 3 , 4 amostras de lágrima podem ser recolhidas por conta de tubos ou lágrima fluxo tiras (tiras de Schirmer). Além disso, o teste de Schirmer é um procedimento padrão realizado na córnea e clínicas de cirurgia refrativa, cujos resultados podem ser usados para ensaios de análise de citocinas. Coleta de amostra não-invasivos, acessibilidade do bio-espécime e a associação de lágrima composição com várias condições fisiológicas e patológicas certifique-se de rasgar a película uma fonte potencial de biomarcadores para diversas doenças oculares e sistêmicas. 4 , 5 , 6

Lágrima de citocinas desempenha um papel importante no estudo da saúde de superfície ocular e condições inflamatórias de várias doenças oculares. 7 concentrações anormais de várias citocinas em lágrima amostras foram relatadas para ser associado com a doença de olho seco, ceratoconjuntivite vernal (VKC), ceratoconjuntivite atópica (AKC), conjuntivite alérgica sazonal e uveíte. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 proteínas de lágrima podem ser analisadas por métodos tradicionais, como a espectrometria de massa, mancha ocidental e ensaios imunoenzimático (ELISA). 14 , 15 no entanto, as limitações destes métodos são pobre sensibilidade e um maior volume de amostra necessário para a análise de várias citocinas de lágrima em cada paciente. 16 , 17 ensaios multiplex do grânulo baseado foram desenvolvidos para analisar vários analitos em amostras de mistura complexa e aplicados com sucesso em amostras de lágrima para analisar várias citocinas em doenças diferentes. 6 , 18 A combinação de sanduíche ELISA e técnicas de citometria de fluxo permitem que estes ensaios tornar-se mais sensível que o ELISA para a quantificação de analitos múltiplos em uma única amostra. 19 . este método pode ser aplicado em uma variedade de amostras clínicas e sobrenadantes de cultura de células e ajuda no estudo das respostas imunes em várias condições fisiopatológicas. 20 , 21 , 22 , 23 , 24

Existem vários estudos comparando multiplex do grânulo com base em ensaios com ELISA e relataram uma correlação entre os métodos. Grânulo de Loo et al . em comparação com base ensaio multiplex com ELISA convencional para a detecção de adiponectina, resistina, leptina e grelina em amostras de soro ou plasma humanas e relatou uma forte correlação (r > 0.9) entre os ensaios. 25 . Dupont et al relataram uma forte correlação entre ensaios multiplex do grânulo baseado e ELISA para a detecção de IL-1 β, IL-4, IL-5, IL-6, em Fitohemaglutinina e lipopolissacarídeo de TNF-α, IL-10 e IFN-ϒ estimularam sangue total coletados de mulheres grávidas. 26 . Pickering et al relataram outro forte correlação entre ensaio multiplex do grânulo baseado e ELISA para a detecção de anticorpos de soro de polissacarídeo de Haemophilus influenzae tipo b (r = 0,96), toxoides de Clostridium tetani (r = 0,96) e Corynebacterium diphtheriae (r = 0,91). 27 . Biagini et al relataram uma alta correlação positiva (r = 0.852) entre ensaio multiplex do grânulo baseado e ELISA para a deteção do Bacillus anthracis anti-PA IgG em amostras de soro. 28 . Wang et al relataram uma correlação entre ensaio multiplex do grânulo baseado e ELISA para a detecção de doença de Alzheimer biomarcadores amiloide-β 42 (r = 0,77), tau total (r = 0,94) e tau fosforilada em aminoácido 181 (r = 0,82) em amostras de líquido cefalorraquidiano. 29 estes estudos demonstraram que a aplicabilidade do grânulo baseado multiplex ensaios numa variedade de amostras clínicas, menores requisitos do volume da amostra e uma correlação com ELISA padrão, que fazem ensaios multiplex do grânulo com base em um promissor alternativa aos métodos tradicionais de ELISA para a detecção de vários analitos em diferentes tipos de amostras em fenótipos diferentes doenças. Aqui descrevemos um protocolo padronizado para ensaio multiplex de grânulo com base para perfil de citocinas para 41 analitos em lágrima amostras coletadas de indivíduos saudáveis, usando tiras de Schirmer.

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Protocolo

os protocolos utilizados neste estudo foram aprovados pelo Conselho de revisão institucional do Tan Tock Seng Hospital, Singapore.

1. análise de Cytokine rasgar

  1. coleção de lágrimas:
    1. pedir o assunto para sentar-se confortavelmente em uma cadeira de exame e coloque sua cabeça contra o encosto de cabeça.
    2. Pedir o assunto para olhar para cima, com cuidado abra as tiras de Schirmer (feitas de papel de filtro Whatman n. 41) e coloque a extremidade arredondada da tira sobre o fórnice inferior do olho e instruir o sujeito a fechar os olhos por 5 min. Ao coletar as lágrimas tomar muito cuidado para minimizar o contato de superfície ocular. 30
    3. pedir o assunto para abrir seu olhos e retire a tira e coloque-o em um tubo de microcentrifugadora estéril 1,5 mL. Transferir imediatamente o tubo ao laboratório ou loja-80 o C até testes para perfil de citocinas.
  2. Eluição da amostra lágrima lágrima faixa de fluxo:
    1. corte a tira de fluxo de lágrima a um comprimento de 0,5 cm (para padronizar a quantidade de lágrimas para ser testado) e coloque-o em um tubo de microcentrifugadora estéril 1,5 mL.
    2. Adicionar 30 µ l de tampão de ensaios e incubar a temperatura ambiente por 5 min, seguido de centrifugação do tubo a 14.000 x g por 1 min.
    3. Transferir o sobrenadante para outro tubo de microcentrifuga de 1,5 mL e descarte a tira. Colocar a amostra contendo o tubo no gelo e usar o exemplo de lágrima eluted imediatamente para perfil de citocinas.
  3. Preparação dos reagentes:
    Nota: os analitos de quarenta e um a ser testado em cada amostra por ensaio multiplex do grânulo com base são interleucina (IL)-1 α, IL-1 β, IL-Rα, Il-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, P40 IL-12, p70 de IL-12, IL-13, IL-15, IL-17A, interferon alfa (IFN-α) 2, IFN-γ, IFN-gama induzida proteína 10 (IP-10, CXCL10), derivado de macrófago chemokine (MDC), proteína inflamatória de macrófagos (MIP)-1 α e MIP-1 β, monócitos proteína quimioatraente (MCP) -1, MCP-3, fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α), TNF-β, crescimento-regulada do oncogene (GRO), alfa do fator de crescimento de tumor (TGF-α), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), fator de crescimento epidérmico (EGF), fibroblastos fator de crescimento (FGF) -2, (PDGF) do fator de crescimento derivado de plaquetas-AA, PDGF-AB/BB, fator estimulante de colônia de granulócitos (G-CSF), fator de colônia-estimulante de granulócitos macrófagos (GM-CSF), flunisolida, fractalkine, solúvel ligante CD40 (sCD40L), Fms, como ligante de tirosina quinase 3 (Flt - 3L) e regulada após a ativação, normal de célula T expressa e secretada proteína (RANTES).
    1. Trazer os frascos de solução (50 X) de grânulo de anticorpo à temperatura ambiente (20-25 o C) e o vórtice os frascos de 1 min.
    2. Contar o número de poços necessários para o ensaio e calcular a quantidade de solução anticorpo total de grânulo cocktail (25 µ l por alvéolo) e cada solução de grânulo de anticorpo (50 X) necessária para o ensaio.
    3. Preparar a coquetel solução adicionando a quantidade calculada de cada solução de anticorpo do grânulo e preenchimento para o volume final desejado, adicionando a quantidade restante de grânulo de diluente. Certifique-se de que a concentração final de cada anticorpo do coquetel é 1 X. Sempre preparar pelo menos 20% extra volume de solução de cocktail em caso de erros de pipetagem.
      Nota: Como exemplo, para um ensaio de 96 poços preparar 3000 µ l da solução de cocktail anticorpo do grânulo. A quantidade necessária de cada solução de grânulo de anticorpo = 3000/estoque concentração de cada solução de grânulo de anticorpo; 3000/50 = 60 µ l de cada solução de grânulo de anticorpo
      1. Adicionar 60 µ l de cada uma das soluções do grânulo 41 anticorpo (60 X 41 = 2460 µ l) em um coquetel do frasco e adicione 540 µ l de solução diluente de grânulo à mistura de grânulo de anticorpo tornar 3000 µ l da final solução de trabalho (1. X).
      2. Antes de usar, misture a solução de cocktail do grânulo corretamente. Após o ensaio de armazenar o volume restante em 2-8 o C por até 30 dias.
    4. Preparar os controlos de qualidade (QC) pela adição de 250 µ l de água deionizada água aos estoques 1 QC e QC 2.
    5. Misturar corretamente por invertendo as garrafas várias vezes e vórtice para transferência s. 10 a solução para devidamente identificada microcentrifuga polipropileno tubos e armazenar o restante da solução a-20 ° C, que pode ser usado por até 30 dias.
    6. Preparar o tampão de lavagem adicionando 270 mL de água desionizada para 30 mL de 10 X solução tampão de lavagem e misture bem (antes da diluição, levar o buffer X 10 à temperatura e dissolver todo sal precipitados pela mistura). Armazenar o tampão de lavagem não utilizados (1 X) 2-8 ° c, que pode ser usado por até 30 dias.
    7. Preparar o estoque padrão de citocina humana (10.000 pg/mL de todos os analitos) por adição de 250 µ l de água deionizada água para o frasco de estoque. Misture bem por inversão várias vezes e vórtice do frasco para 10 s. deixe-a repousar durante 10 min e transferir a solução para devidamente identificada microcentrifuga polipropileno tubos. Após o ensaio, armazenar o restante da solução a-20 ° C, que pode ser usado por até 30 dias.
    8. Preparar os padrões a citocina humana por 5-fold diluições em série (50 µ l - > 200 µ l) com buffer de ensaio para obter 2000, 400, 80, 16 e 3,2 pg/mL.
    9. Após preparação padrão, use os padrões de trabalho no prazo de 60 min e usar o buffer de ensaio como em branco/fundo (-pg/mL).
  4. Perfil de citocinas por grânulo baseado multiplex do ensaio:
    1. trazer todos os reagentes à temperatura ambiente e vortex durante 5-10 segundos antes de adicioná-los à placa de microtitulação de 96 poços. Se as amostras de lágrima eluted são armazenadas no -80 o C antes do ensaio, descongelar os extratos de lágrima congelado no gelo e centrifugar a 1000 X g por 5 min.
    2. Preparar uma folha de trabalho de ensaio em uma configuração vertical para trabalhar padrões de citocina humana [0 (em branco), 3.2, 16, 80, 400, 2.000 e 10.000 pg/mL], QC1, amostras e QC2.
    3. Adicionar 200 µ l de 1x tampão de lavagem a cada bem da placa, selá-lo com selador de placa e mantê-lo num agitador de placa à temperatura ambiente (20-25 o C) durante 10 min.
    4. Decantar o tampão de lavagem 1 X invertendo-se o prato e bata-o para absorventes várias vezes para remover a qualquer quantidade residual de tampão de lavagem dos poços.
    5. Adicionar 25 µ l de cada trabalho humano citocina padrão, QC1, QC2, em branco (buffer de ensaio) e amostras nos poços apropriados.
    6. Adicionar 25 µ l de tampão de ensaio para cada poço.
    7. Adicionar 25 µ l de 1 X anticorpo grânulo cocktail solução em cada poço. Como a solução de grânulo de anticorpo é sensível à luz, selar a placa com aferidor de prato e cubra com papel alumínio para protegê-lo contra a luz durante o ensaio.
    8. Incubar a placa a 4 o C durante a noite num agitador.
    9. Coloque a placa sobre a cremalheira de placa de uma máquina de lavar automática placa magnética. Deixe descansar por 1 minuto acertar as esferas magnéticas no fundo do poço e aspirar o conteúdo bem. Adicionar 200 µ l de tampão de lavagem por bem e deixe descansar por 1 minuto e em seguida, Aspire o conteúdo bem. Repetir a lavagem mais uma vez (para lavar prato, siga o fabricante do kit ' instruções de s).
    10. Adicionar 25 µ l de solução de anticorpos deteção em cada bem, selar a placa, cubra com papel alumínio e incubar a temperatura ambiente por 60 min em um shaker.
    11. Adicione 25 µ l de Streptavidin-ficoeritrina solução em cada poço, selar a placa, cubra com papel alumínio e incubar a temperatura ambiente por 30 min em um shaker.
    12. Coloque a placa sobre uma máquina de lavar prato magnético. Deixe descansar por 1 min e depois aspirar o conteúdo bem. Adicione 200 µ l de tampão de lavagem por bem. Deixe descansar por 1 min e depois aspirar o conteúdo bem. Repetir a lavagem mais uma vez.
    13. Adicionar 150 µ l de fluido de bainha a cada bem e coloque a placa de um agitador durante 5 min à temperatura ambiente para Ressuspender os grânulos anticorpo.
    14. Ler a placa imediatamente usando o talão com base de leitor de placa de ensaio multiplex e analisar as concentrações de citocinas, usando um algoritmo de curva-encaixe 5-parâmetro. Um diagrama de fluxo esquemático de lágrima citocinas perfil é mostrado na Figura 1.
  5. Ler a placa de ensaio (instrumento instituído) e análise de dados:
    1. Switch na esfera baseado leitor ensaio multiplex e pré-aquecer o laser de 30 min.
    2. Lançar o software de ensaio multiplex do grânulo com base. Sob o ' manutenção automatizada ' guia, selecione o ' verificação de calibração ' opção. Vórtice cada reagente frasco dos grânulos de calibração e verificação de 30 s. lugar 5 gotas de cada reagente nos poços designados. Encha os reservatórios designados com etanol água e 70% desionisada.
    3. Criar um novo protocolo
      1. abrir o ' protocolos ' página e depois o ' protocolos ' Tab. clique " criar nova ProtocolŔ a ' configurações ' guia abrirá.
      2. No ' nome ' caixa, digite o nome do protocolo.
      3. Digite uma descrição na caixa à direita da ' nome ' caixa.
      4. No ' versão ' caixa, digite a versão do protocolo.
      5. No ' fabricante ' caixa, digite as informações do fabricante para o protocolo.
      6. Definir configurações no ' configurações de aquisição ' seção da seguinte maneira. Conjunto ' Volume ': 100 µ l, ' Timeout ': 60 s; ' Retenção de DD ': 8.000 a 15.000; ' Repórter ganho ': PGTO padrão; ' Talão tipo ': grânulo magnético.
      7. Definir configurações no ' configurações de análise ' ponto, seleccionar ' quantitativa ' como o tipo de análise. Conjunto ' número de normas ': 6; ' Número de controles ': 0; Escala o ' dizer de Replica ' caixa;
        Escala do ' analisar resultados enquanto adquirir amostras ' caixa.
      8. Clique em " NextŔ o ' analitos ' guia abre, clique nos analitos desejados (talão ID) na grade numerada analito.
      9. Clique e digite nome do analito correspondente no ' nome ' coluna à direita da grade de analito (analitos ' nomes e seus detalhes de região correspondente do grânulo foram mencionadas na tabela 1).
      10. Clique e digite a unidade desejada de medida (ou seja, pg/mL) no ' unidades ' caixa à esquerda do ' se aplicam a todos os ' botão. Clique em " se aplicam a todos os ".
      11. Clique e tipo o talão desejado contam para cada analito (ou seja, 50) no ' Conde ' caixa. Clique em " se aplicam a todos os ".
      12. Clique " NextŔ abre a guia Layout da placa. Destacar os poços para os padrões e selecione " 2 " abaixo dos replicar a contagem e clique sobre o " S " botão padrão. Repita esta etapa para o fundo " B " e amostras " U " poços.
      13. Clique em " salvar ".
    4. Criar lotes de novos padrões/controle
      1. aberto o ' protocolos ' página e depois o ' normas & controles ' Tab. clique " criar novos lotes padrão/controle ".
      2. Abrir o ' selecione protocolo ' caixa. Selecione o protocolo que foi criado na etapa 1.5.3.
      3. -Chave na informação das normas em conformidade: Std/Ctrl do kit Std/Ctrl nome kit, de validade e fabricante.
      4. Chave no valor de mais alto padrão para cada analito (ou seja, 10000 pg/mL). Chave em 5 sob diluição e clique em " se aplicam a todos os " para gerar automaticamente as concentrações esperadas para o resto das normas.
      5. Clique em " salvar ".
    5. Criar um novo lote de um protocolo existente
      1. aberto o ' lotes ' página e clique em " criar uma guia de novo lote de um protocolo existente ".
      2. Digite o nome de lote no ' nome de lote ' caixa e digite uma descrição sobre o lote no ' digite descrição opcional ' caixa.
      3. Clique no protocolo gerado anteriormente (na etapa 1.5.3).
      4. Clique " NextŔ é a próxima guia que abre o ' DST & Ctrls ' Tab exibir os detalhes das normas de ensaio e selecione " próximo ".
      5. No ' Layout de placa ' guia, atribuir comandos bem para este lote e clique em " salvar " salvar informações de lote para o ' lote pendente ' lista.
      6. Carregar a placa para o leitor de placa de ensaio multiplex grânulo baseado, agitá-lo durante 5 min e executar o lote da lista pendente em lote. Dados adquiridos serão salvos no formato de arquivo. csv.
  6. Análise de dados
    1. converter o arquivo CSV gerado a partir do software de ensaio multiplex do grânulo com base para o formato de arquivo (arquivo de dados de resultados) .rbx usando o software de conversão de rbx. Inicie o software de conversão, selecione o arquivo CSV sob xPONENT Selecionar arquivo (s) e clique sobre o " gerar " botão; o arquivo .rbx será salvo na pasta de saída selecionado.
    2. Lançar o software de análise e abra o arquivo .rbx.
    3. Otimizar as curvas padrão utilizando a curva de 4PL/5PL caber.
      1. Selecione o seguinte no ' curva padrão ' guia: ' tipo de regressão ': ' logística-5PLƆ ' transformação de eixo ': ' log - Linear (y) escala Ɔ a ' mostrar linhas de gama Conc ' caixa; assinale o ' mostrar desconhecido Amostras ' caixa; Escala o ' mostrar amostras de controlo de ' da caixa; Escala o ' aplicar através de todos os analitos ' caixa; escala o ' Mostrar relatório após otimização ' caixa.
      2. Clique o " otimizar " botão para otimização automática.
    4. Rotular as identidades de amostra sob ' inserir informação de amostra ' Tab
    5. Obter as concentrações observadas no ' relatório tabela ' guia e clique no " exportar relatório tabela " para gerar os dados em um arquivo de planilha para posterior análise.

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Resultados

Rasgo as amostras foram coletadas de 8 olhos de 4 indivíduos saudáveis usando tiras de fluxo de lágrima e níveis de citocinas foram analisados usando o protocolo acima mencionado. Todos os indivíduos eram do sexo masculinos e a idade dos quatro temas foi 36, 42, 44 e 52 anos respectivamente. Saúde de superfície ocular e olho seco doença foi avaliada por meio de ensaios clínicos (lágrima filme acabar tempo, Schirmer teste, coloração da córnea, a coloração da conjuntiva, exame de glândula m...

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Discussão

Citocinas são pequenas proteínas secretadas celulares e potentes imunes moduladores regulando respostas imunes. 32 os perfis de expressão de diversas citocinas em lágrima amostras estão relacionadas a diversas condições patológicas do olho e estudos sobre cytokine perfis ajudam a compreender os mecanismos da patogênese da doença, determinar o estado de saúde ocular, severidade da doença, diagnóstico e progressão. 2 , 5 concentrações de pro...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar. Sem interesse financeiro ou conflito de interesses.

Agradecimentos

O trabalho de pesquisa foi apoiado pela subvenção centro de Tan Tock Seng Hospital personalizado semente financiamento programa 2015; Singapore Eye Research Institute piloto Grant e Tan Tock Seng Hospital passo fundo para concedem.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Painel de contas magnéticas de citocinas / quimiocinas humanas Milliplex MAP -1 kitMerck, USAHCYTOMAG-60K-41
Flexmap 3D luminex instrument Luminex Corp, Austin, TX, EUA
xPonent software Luminex Corp, Austin, TX, EUA
RBXGenerator softwareBIO-RAD, França
Bio-Plex Manager 6.1BIO-RAD, França
Agitador de placasCorning, EUA
TECAN Microplate WasherTecan, SuíçaHydroSpeed
Vortex Genie 2Scientific Industries inc, EUAG560E
PipetasMettler Toledo, CA, EUA
Tubo de microcentrífuga de 1,5 mlAxygen, EUAMCT-150-C
Tira de teste de fluxo lacrimal SchirmerEye Care and Cure, EUA101657
calibração 3D FlexmapLuminex Corp, Austin, TX, EUA40-028
Kit de verificação 3D FlexmapLuminex Corp, Austin, TX, EUA40-029
de exame ocular
Kit de Cadeira

Referências

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