Artigo de método

Preparação da amostra para identificação de espectrometria de massa-baseada das regiões de ligação de RNA

DOI:

10.3791/56004

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28 de setembro de 2017

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1Epigenetics Institute, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine, 2Department of Cell and Developmental Biology, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine, 3Department of Biochemistry and Biophysics, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine, 4Graduate Group in Biochemistry and Biophysics, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine

Neste artigo

Resumo

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Descreveremos um protocolo para identificar proteínas RNA-obrigatórias e mapear suas regiões de ligação de RNA em células vivas, usando photocrosslinking UV-mediada e espectrometria de massa.

Resumo

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RNA não-codificante desempenham papéis importantes em diversos processos nucleares, incluindo a regulação da expressão gênica, estrutura da cromatina e reparação do DNA. Na maioria dos casos, a ação de RNA não-codificante é mediada por proteínas que por sua vez, cujas funções são regulamentadas por essas interações com RNA não-codificante. Consistente com este, um número crescente de proteínas envolvidas em funções nucleares têm sido relatado para vincular o RNA e em alguns casos as regiões de RNA-ligação destas proteínas foram mapeadas, muitas vezes através de métodos laboriosos, baseado no candidato.

Aqui, nós relatamos um protocolo detalhado para realizar uma identificação imparcial elevado-throughput, proteoma-largo de RNA-proteínas e suas regiões de RNA-obrigatórias. A metodologia baseia-se na incorporação de uma uridina fotorreativas analógica no RNA celular, seguido de reticulação de RNA-proteína mediada por UV e análises de espectrometria de massa para revelar o RNA-quitosana péptidos dentro do proteoma. Embora nós descrevemos o procedimento para as células estaminais embrionárias de rato, o protocolo deve ser facilmente adaptado a uma variedade de culturas de células.

Introdução

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O objetivo do método RBR-ID é identificar novas proteínas RNA-obrigatórias (RBPs) e mapear as regiões de RNA-obrigatórias (RBRs) com resolução de peptídeo-nível para facilitar o design de mutantes de RNA-obrigatórias e a investigação da biológicas e bioquímicas funções de interações proteína-RNA.

O RNA é único entre biomoléculas pode atuar como um mensageiro carregando informação genética e também dobrar em estruturas tridimensionais complexas com funções bioquímicas mais parecidas com as de proteínas1,2. Um corpo crescente de evidências sugere que o RNA não-codificante (ncRNAs) des....

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Protocolo

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1. cultura e expansão de mESCs

Nota: as células estaminais embrionárias de rato são fáceis de cultura e pode ser expandidas rapidamente para os grandes números exigidos pelo bioquímicas experiências graças a seu tempo de ciclagem rápida. MESCs saudáveis dobrar a cada 12 h.

  1. MESCs expandir para o número desejado em placas gelatinizadas no mESC médio (veja abaixo) em uma incubadora de cultura de tecidos mantido a 37 ° C, 5% de CO 2, e > 95% de umidade.
    Nota: Suficiente placas devem estar preparadas para 3-5 repetições biológicas para o + 4SU amostra e controle a - 4SU. Uma placa de 10 cm (ou seja, 5 m....

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Resultados

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A Figura 1 mostra o fluxo de trabalho RBR-ID. Devido a reticulação relativamente baixa eficiência dessa técnica, é muito importante levar em consideração tanto a nível de esgotamento e a consistência do efeito observado (P -valor) através de réplicas biológicas. A Figura 2 mostra uma trama de vulcão de resultado RBR-ID. Peptídeos que sobrepostas domínio de motivo (RRM) de reconhecimento de RNA mostram nível de esgotament.......

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Discussão

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Descreveremos um protocolo experimental pormenorizado para executar RBR-ID em mESCs e, com modificações apropriadas, em qualquer célula que pode incorporar 4SU em RNA. Outros tipos de células podem exigir a otimização da abordagem para garantir um suficiente sinal à relação de ruído. Além disso, enquanto o protocolo descrito neste documento concentra-se no exame do RBPs nucleares, a tecnologia de RBR-ID deve ser facilmente adaptada para diferentes compartimentos celulares, como o citoplasma ou organelas específicas, pelo.......

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Divulgações

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Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

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R.B. foi apoiada pelo programa de estudiosos de Searle, Fundação Smith W.W. (C1404) e a marcha de Dimes Foundation (1-FY-15-344). B.A.G reconhece que o apoio do NIH concede R01GM110174 e NIH R01AI118891, bem como DOD conceder BC123187P1. R.W. '-T. foi apoiada pelo subsídio de formação de NIH T32GM008216.

....

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
KnockOut DMEMFisher Scientific10829018
Soro fetal bovino, qualificado, origem americanaFisher Scientific26140079
solução de L-Glutamina 200mM SigmaG7513
Solução de penicilina-estreptomicinaSigmaP0781
MEM Solução de aminoácidos não essenciais (100 vezes;)SigmaM7145
2-MercaptoetanolSigmaM3148
ESGRO Fator Inibidor de Leucemia (LIF)EMD MilliporeESG1106
CHIR99021Tocris4423
PD0325901SigmaPZ0162
Solução de gelatina, 2% em águaSigmaG1393
4-tiouridinaSigmaT450950 mM estoque em água
Spectrolinker XL-1500Fisher Scientific11-992-90
Fluoreto de fenilmetanossulfonilSigma78830
IGEPAL CO-630Sigma542334Forma comercial de octil-fenoxi-polietoxi-etanol detergente
IodoacetamidaSigmaI6125
Tripsina, grau de sequenciamentoPromegaV5111
Empore disco de extração em fase sólida3M66883
OLIGO R3 Invertido - Resina de FaseFisher Scientific1133903
BenzonaseSigmaE8263Nuclease de alta pureza
Sonic Dismembrator Modelo 100Fisher Scientificdescontinuadoatualizado com FB505110
Acetonitrila de grau HPLCFisher ChemicalA955-4
Água de grau HPLCFisher ScientificW6 4
TFAFisher ScientificA11650
Bicarbonato de amônioSigmaA6141
Ácido acéticoSigma49199
Ácido fórmicoSigmaF0507
ReproSil-Pur 18-AQDr. Maisch GmbH HPLCr13.aq.0003Material de embalagem para coluna de HPLC
Capilar para nano colunas (75 µ m)Molex1068150017
software MaxQuantInstituto Max Planck de BioquímicaPode realizar o alinhamento cromatográfico de várias execuções de MS

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bonasio, R., Shiekhattar, R. Regulation of transcription by long noncoding RNAs. Annu Rev Genet. 48, 433-455 (2014).
  2. Bonasio, R. Emerging topics in epigenetics: ants, brains, and noncoding RNAs. Ann N Y Acad Sci. 1260, 14-23 (2012).
  3. Rinn, J. L., Chang,....

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