Este protocolo descreve a síntese, caracterização e injeção de peptídeos monomérico amiloide-β42 para gerar toxicidade amiloide no zebrafish adulto para estabelecer um modelo de doença de Alzheimer, seguido de análise histológica e detecção de agregações.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Toxicidade do Amyloid-β42 de modelagem e neurodegeneração no cérebro adulto de Zebrafish
Neste artigo
Resumo
Resumo
A doença de Alzheimer (AD) é uma debilitante doença neurodegenerativa em que acúmulo de amiloide tóxica-β42 peptídeos (Aβ42) leva à degeneração sináptica, inflamação, morte neuronal e déficits de aprendizagem. Os seres humanos não podem regenerar neurônios perdidos no caso de AD em parte devido à deficiente capacidade proliferativa das células tronco/progenitoras neurais (NSPCs) e neurogênese reduzida. Portanto, terapias regenerativas eficientes também devem aumentar a proliferação e neurogênica capacidade de NSPCs. Zebrafish (Danio rerio) é um organismo regenerativo, e podemos aprender os programas moleculares básicos com o qual nós poderíamos projetar abordagens terapêuticas para combater AD. Por esta razão, a geração de um modelo AD-como no zebrafish era necessária. Usando nossa metodologia, podemos introduzir derivados sintéticos de peptídeo Aβ42 com capacidade de penetração de tecido do cérebro de adultos do zebrafish e analisar a patologia da doença e da resposta regenerativa. A vantagem sobre os métodos existentes ou modelos animais é que aquele zebrafish pode ensinar-nos como um cérebro de vertebrados pode regenerar naturalmente e, assim, ajudar-na tratar melhor as doenças neurodegenerativas humanas pela segmentação NSPCs endógenas. Portanto, o modelo de amiloide-toxicidade estabelecido no cérebro adulto zebrafish pode abrir novos caminhos para a investigação no campo da neurociência e da medicina clínica. Além disso, a simples execução desse método permite a avaliação experimental cost-effective e eficiente. Este manuscrito descreve a síntese e a injeção de Aβ42 peptídeos no cérebro de zebrafish.
Introdução
AD é uma doença progressiva crônica, caracterizada pela perda de neurônios e sinapses no córtex cerebral1,2,3,4,5. As características neuropatológicas clássicas de anúncio são a deposição de amiloides peptídeos e formação do tangles emaranhados (NFTs)6. Placas senis, também conhecido como placas amiloides, são compostas de peptides amyloid-β (Aβ) que formam estruturas de β-plissado no parênquima cerebral5. O acúmulo de Aβ42 em pacientes AD tem um papel inicial....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
este protocolo é um procedimento padrão sugerido por directrizes da União Europeia (2010/63) e da sociedade europeia de modelos de peixe em biologia e medicina (EuFishBioMed) em Karlsruhe Insitute de tecnologia (KIT). Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pela Comissão de ética (Landesdirektion Dresden; número TVV-52/2015).
1. preparação do peptídeo Aβ42
- Synthesize peptídeos (ver quadro 1) usando a química padrão 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) com 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3- tetramethyluronoiumhexafluorphosphate (HBTU) como o reagente de acoplamento em um peptídeo de fase sólida automatizado s....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
HPLC era usada para purificar o peptídeo sintetizado e espectrometria de massa tem sido utilizada para caracterizar os peptídeos β amiloide purificada. A coluna HPLC foi aquecida a 50 ° C, para melhorar a separação dos peptides Aβ e todas as frações foram coletadas. Para identificar o peptídeo sintetizado corretamente, realizou-se análise de espectroscopia de massa para todas as frações. O cromatograma UPLC mostra a pureza do composto. A fração HPLC que rendeu um pico sobre o UPLC (ou.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Os peptídeos de amiloide podem ser modificados para incluir variações de sequência ou várias marcas. Por exemplo, um peptídeo de amiloide mexido pode ser gerado, e os peptídeos podem ser rotulados com etiquetas fluorescentes no N-terminal da extremidade do peptide ou marcados com transportadora peptídeos39. Da mesma forma, no presente protocolo, o peptídeo de transportadora é o célula-penetrante peptídeo TR por causa de sua eficácia para transporte de carga profunda para o tecido de cérebro
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelo DZNE e Associação Helmholtz (VH-NG-1021), poucos, TU Dresden (FZ-111, 043_261518) e DFG (KI1524/6) (CK); e pela Associação de Leibniz (Serra-2011-IPF-2) e BMBF (BioLithoMorphie 03Z2E512) (Y.Z.). Gostaríamos também de agradecer Ulrike Hofmann para síntese do peptide e Nandini Asokan, Prayag Murawala e Elly Tanaka ajuda durante as filmagens do procedimento.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Aminoácidos protegidos contra Fmoc | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Alemanha) | Aminoácidos à base de Fmoc para síntese de peptídeos em fase sólida (SPPS) | |
| N,N,N′,N′-Tetrametil-O-(1H-benzotriazol-1-il)hexafluorofosfato de urônio (HBTU) | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Alemanha) | RL-1030 | Ativador |
| Oxyma | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Alemanha) | RL-1180 | Supressor de racemização |
| N,N-Diisopropiletilamina | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Alemanha) | SOL-003 | Base |
| Dimetilformamida | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Alemanha) | SOL-004 | Solvente |
| N-Metilmorfolina | Thermo Fisher (Kandel) GmbH, Alemanha | A12158 | Base |
| 1-Hidroxibenzotriazol hidrato (HOBT) | Sigma-Aldrich Co. LLC. ( St. Louis, MO, EUA) | 157260 ALDRICH | Activator |
| Piperidina | MERCK KGaA (Darmstadt, Alemanha) | 822299 | Reagente de desproteção Fmoc |
| Diclormetano (DCM) | MERCK KGaA (Darmstadt, Alemanha) | 106050 | Solvente |
| Ácido fórmico (FA) | MERCK KGaA (Darmstadt, Alemanha) | 100264 | Componente tampão para HPLC |
| Ácido trifluoroacético (TFA) | MERCK KGaA ( Darmstadt, Alemanha) | 808260 | Reagente de mistura de levagem |
| Triisopropilsilano(TIS) | MERCK KGaA (Darmstadt, Alemanha) | 233781 ALDRICH | Reagente de mistura de levagem |
| Acetonitrila (para UPLC/LCMS) | Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH | 34967-1L | Solvente |
| Acetonitrila (para HPLC) | VWR International Ltd, Inglaterra | 83639.320 | Solvente |
| Diethylether | VWR International Ltd, Inglaterra | 23811.326 | Solvente para precipitação de peptídeos |
| Ditiotritol (DTT) | VWR International Ltd, Inglaterra | 0281-25G | Reagente de mistura de levagem |
| TentaGel S RAM Fmoc resina de amida de pista | Rapp Polymere GmbH (Tuebingen, Alemanha) | S30023 | Fase sólida para SPPS |
| Síntese de peptídeos Seringas de 5 ml com filtros incluídos | Intavis AG (Colónia, Alemanha) | 34.274 | Tubo de reação para SPPS e para clivagem do filtro de |
| politetrafluoretileno (PTFE) | Sartorius Stedtim (Aubagne, França) | 11806-50-N | Filtração de peptídeos precipitados |
| Filtro de seringa de fluoreto de polivinilideno (PVDF) | Carl Roth GmbH + Co. KG Karlsruhe | KC78.1 | Pré-filtragem para |
| sintetizador de peptídeos | Intavis, Colônia, Alemanha | ResPep SL | Sintetizador de peptídeos de fase sólida automatizado |
| Water Alliance HPLC | Waters, Milford Massachusetts, EUA | Waters 2998, Waters e2695 | Cromatografia líquida de alta pressão de fase reversa semi-preparativa (HPLC) |
| PolymerX, tamanho da conta 10μ m, 250x10 mm | Phenomenex Ltd. Alemanha | 00G-4328-N0 | Coluna de HPLC de poliestireno poroso divinilbenzeno |
| Milli-Q Advantage A10, com um filtro Milli-Q | EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, EUA | LCPAK0001 | Sistema de purificação de água |
| Unidade de filtragem | Sartorius Stedtim (Aubagne, França) | 16307 | Unidade de filtração para precipitação de peptídeos |
| UPLC Aquity com detector | UVWaters, Milford Massachusetts, EUA | M09UPA 664M | Analítica ultra HPLC de fase reversa para LC-MS |
| ACQUITY UPLC BEH C18, tamanho do cordão 1,7 μ m, 50x2,1 mm | Waters, Milford Massachusetts, EUA | 186002350 | coluna analítica C18 |
| ACQUITY TQ Detector | Waters, Milford Massachusetts, EUA | QBB908 | Espectrometria de massa de ionização por eletrospray (ESI-MS) |
| CHRIST ALPHA 2-4 LD plus + vacuubrand RZ6 | Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Alemanha | 16706, 101542 | Liofilizador com bomba de vácuo |
| Leitor de placas Paradigm | Beckman Coulter | ||
| MESAB (etil-m-aminobenzoato de metanossulfonato) | Placas de Petri Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Sarstedt | 821.472 | ||
| Solução salina tamponada com fosfato | Life Technologies, GIBCO | 10010-056 | |
| Agulha | Becton-Dickinson | 305178 | |
| Microscópio de dissecação | Olympus, Leica, Zeiss | Varia de acordo com o fabricante | |
| Dumont Pinças | World Precision Instruments | 501985 | |
| Gillies Pinças de Dissecção | World Precision Instruments | 501265 | |
| Capilares de injeção de vidro | World Precision Instruments | TWF10 | |
| PicoNozzle | World Precision Instruments | 5430-12 | |
| Iluminador pneumático do | dos instrumentos SYS-PV820 | da precisão do mundo | |
| ; Guia de Luz de Anel | Parkland Scientific | ILL-RLG | |
| Cryostat | Leica | CM1950 |
Referências
- LaFerla, F. M., Green, K. N. Animal models of Alzheimer disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (11), (2012).
- Selkoe, D. J. Alzheimer's disease: genes, proteins, and therapy. Physiol Rev. 81 (2), 741-766 (2001).
- Serpell, L. C.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
