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Artigo de método

Toxicidade do Amyloid-β42 de modelagem e neurodegeneração no cérebro adulto de Zebrafish

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DOI:

10.3791/56014

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25 de outubro de 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1German Centre for Neurodegenerative Diseases (DZNE) Dresden within Helmholtz Association, 2B CUBE, Center for Molecular Bioengineering, Technische Universität Dresden, 3Center for Regenerative Therapies Dresden (CRTD), TU Dresden

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve a síntese, caracterização e injeção de peptídeos monomérico amiloide-β42 para gerar toxicidade amiloide no zebrafish adulto para estabelecer um modelo de doença de Alzheimer, seguido de análise histológica e detecção de agregações.

Resumo

A doença de Alzheimer (AD) é uma debilitante doença neurodegenerativa em que acúmulo de amiloide tóxica-β42 peptídeos (Aβ42) leva à degeneração sináptica, inflamação, morte neuronal e déficits de aprendizagem. Os seres humanos não podem regenerar neurônios perdidos no caso de AD em parte devido à deficiente capacidade proliferativa das células tronco/progenitoras neurais (NSPCs) e neurogênese reduzida. Portanto, terapias regenerativas eficientes também devem aumentar a proliferação e neurogênica capacidade de NSPCs. Zebrafish (Danio rerio) é um organismo regenerativo, e podemos aprender os programas moleculares básicos com o qual nós poderíamos projetar abordagens terapêuticas para combater AD. Por esta razão, a geração de um modelo AD-como no zebrafish era necessária. Usando nossa metodologia, podemos introduzir derivados sintéticos de peptídeo Aβ42 com capacidade de penetração de tecido do cérebro de adultos do zebrafish e analisar a patologia da doença e da resposta regenerativa. A vantagem sobre os métodos existentes ou modelos animais é que aquele zebrafish pode ensinar-nos como um cérebro de vertebrados pode regenerar naturalmente e, assim, ajudar-na tratar melhor as doenças neurodegenerativas humanas pela segmentação NSPCs endógenas. Portanto, o modelo de amiloide-toxicidade estabelecido no cérebro adulto zebrafish pode abrir novos caminhos para a investigação no campo da neurociência e da medicina clínica. Além disso, a simples execução desse método permite a avaliação experimental cost-effective e eficiente. Este manuscrito descreve a síntese e a injeção de Aβ42 peptídeos no cérebro de zebrafish.

Introdução

AD é uma doença progressiva crônica, caracterizada pela perda de neurônios e sinapses no córtex cerebral1,2,3,4,5. As características neuropatológicas clássicas de anúncio são a deposição de amiloides peptídeos e formação do tangles emaranhados (NFTs)6. Placas senis, também conhecido como placas amiloides, são compostas de peptides amyloid-β (Aβ) que formam estruturas de β-plissado no parênquima cerebral5. O acúmulo de Aβ42 em pacientes AD tem um papel inicial e crítico na progressão da doença. AD desencadeia uma cascata de eventos levando a perda neuronal7,8,9,10, plasticidade prejudicada e disfunção sináptica.

O cérebro adulto de teleósteos zebrafish serve como um excelente modelo para estudar o Regulamento de células-tronco plasticidade11,12,13,14,15, 16,17,18,19,20 e várias doenças no sistema nervoso central (CNS), incluindo AD21,22,23 ,24. Devido a uma vasta gama de métodos experimentais disponíveis19,20,25,26,,27,28,29, 30 , 31, estes estudos são informativas e viável. Zebrafish pode reabastecer o CNS13,15,32,33,34,35,36,37,, 38, em parte por meio de programas moleculares ativados após perda neuronal19,39,40,41,42,43, 44. Portanto, estabelecer um modelo de doenças neurodegenerativas no zebrafish pode ajudar a abordar questões romance sobre Biologia regenerativa de capacidade e células-tronco no cérebro de vertebrados.

Recentemente, desenvolvemos um modelo de toxicidade amiloide no cérebro adulto zebrafish injetando sintético Aβ42 peptídeos (tabela 1)39. Esta injeção causou neurodegeneração fenótipos reminiscentes de patologia do cérebro humano (por exemplo, morte celular, ativação microglial, degeneração sináptica e défices de memória), indicando o zebrafish pode ser usada para suscitar Neurodegeneração no cérebro de zebrafish, Aβ42 peptídeos podem ser detectados com colorações imuno-histoquímica e mecanismos moleculares de regeneração no zebrafish adulto que CNS pode ser identificado39. Neste protocolo, demonstramos a injeção de peptídeos sintéticos amiloides no cérebro de zebrafish usando um cerebroventricular injeção (CVMI) método27,39,,45,46 para imitar a deposição de amiloide (Figura 1). CVMI fornece uma nova maneira de entregar os peptídeos, que agregam mediante injeção como estruturas de β-folha e exercem a toxicidade. Os peptídeos são distribuídos uniformemente em todo o cérebro, direcionando a área ventricular ao longo do eixo rostro-caudal inteira45. Além disso, este método permite para analisar a resposta morfológica e molecular das NSPCs no cérebro adulto zebrafish inclusões amiloides a seguir. Tais estudos nos fornecerá uma visão para o reparo de cérebro bem sucedida em mamíferos. Nosso método pode ser usado para entender o mecanismo molecular necessário de uma resposta de regeneração bem sucedida após sintomas de AD para induzir reconstituição dos neurônios perdidos e recuperação funcional.

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Protocolo

este protocolo é um procedimento padrão sugerido por directrizes da União Europeia (2010/63) e da sociedade europeia de modelos de peixe em biologia e medicina (EuFishBioMed) em Karlsruhe Insitute de tecnologia (KIT). Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pela Comissão de ética (Landesdirektion Dresden; número TVV-52/2015).

1. preparação do peptídeo Aβ42

  1. Synthesize peptídeos (ver quadro 1) usando a química padrão 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) com 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3- tetramethyluronoiumhexafluorphosphate (HBTU) como o reagente de acoplamento em um peptídeo de fase sólida automatizado sintetizador 52. A escala da síntese foi 100 µmol.
  2. Carregar o sintetizador de peptídeo automatizado com 500 mg de resina Fmoc-protegido como fase sólida (capacidade de 0,2 mmol/g de carregamento). Carregar os ácidos aminados protegido Fmoc dissolvidos numa concentração de 0,5 M no volume necessário e calculados para o respectivo sintetizador.
    Nota: Os cálculos são feitos para permitir o acoplamento de cada aminoácido Fmoc-protegido duas vezes com excesso de 5 vezes de cada bloco de construção para a resina 47.
  3. Dissolver os reagentes necessários para a síntese do peptide em dimethlyformamide (DMF). Por exemplo, preparar o ativador, HBTU, em uma concentração de 0,48 M, 45% v/v N-Methylmorpholine (NMM) (base) e 5% v/v anidrido acético (mistura de nivelamento) para tampar os grupos aminoácidos não reagidos.
  4. Decompor todos os peptídeos da resina, misturando continuamente o apoio sólido, utilizando um agitador em uma mistura de clivagem recentemente preparada, consistindo de ácido trifluoroacético (TFA): Triisopropylsilane(TIS): água: ditiotreitol (DTT) em 90 (v/v): 5 (v/v): 2.5 (v/v): 2,5 (m/v), para 4 h. usar 10 mL para a escala de síntese de 100 µmol.
  5. Precipitar o produto clivado adicionando a mistura de clivagem para 100 mL de éter dietílico gelada. Passar através de uma unidade de filtração que contém um filtro de politetrafluoretileno (PTFE) com um tamanho de poro de 0,45 µm e lavar com 20 mL de éter dietílico gelada.
  6. Recolher o filtrado do peptide do papel de filtro e dissolver 100 mg de peptídeo precipitado em 5 mL água destilada deionizada: acetonitrilo em 1:1.
  7. Purify através do reverso-fase cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) em uma semipreparativa para HPLC equipada com uma coluna de divinilbenzeno porosas de poliestireno de grânulo tamanho 10 µm.
    1. Pré-aquecer a coluna e manter a 50 ° C, utilizando uma dispositivo de aquecimento de coluna. Recolher todas as frações principais usando um coletor de fração automatizada através da aplicação de um gradiente de 5% para 100% solvente B mais 25 min a 4 mL/min.
      Nota: A solvente é 0.1% TFA em água e solvente B é 0.1% TFA em acetonitrilo 52.
    2. Monitorar o cromatograma em 220 nm, coletar os picos apropriados e analisar usando o LC-MS.
  8. Confirmar a pureza por reverso analítica fase ultra alta pressão líquida cromatografia (UPLC) em 220 nm, monitorando com um Detector de UV ao passar a amostra através de uma coluna C18 analítica (grânulo tamanho 1,7 µm). Confirmar o produto peptídeo por espectrometria de massa.
    Nota: O UPLC é acoplado a um electrospray espectrometria de massa de ionização (ESI-MS) e Detector de quadrupolo Tandem.
  9. Lyophilize as frações corretas do peptide desejado num balão de fundo redondo, aplicando-se um vácuo de 0.052 mbar, de um pó macio. Acoplar a bomba de vácuo para uma unidade de congela mantida a-78 º C. loja a-80 ° C, por tempo indeterminado.
  10. Usar o peptídeo liofilizado para preparar uma solução stock de 1 mM em uma mistura de acetonitrila: DMF: água de qualidade analítica em 1:1:1 para os experimentos. Esta solução pode ser armazenada pelo menos 6 meses, como os peptídeos não agregam nesta solução.

2. Preparação da mistura de injeção

  1. preparar o tampão fosfato salino (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 2mm KH 2 PO 4, pH 7,4) para diluir os peptídeos liofilizados.
  2. Dissolver o peptídeo para uma concentração final de 20 µM em PBS. Prepare esta solução fresca. Misture bem e guarde no gelo até a injeção. Não exceda 30 min para evitar agregação em solução.

3. Anestesia

sistema
  1. Prepare a solução-mãe dos anestésicos, 0,1%-m-aminobenzoato de etilo methanesulphonate (MESAB), as águas peixes regular a circulação. Preparar a solução de anaesthetization para uma concentração final de 0,0025% (v/v).
  2. Remover o número desejado de peixe de seus tanques em um recipiente de transporte com 5 L de água do sistema.
  3. Meia-encha um prato de Petri (90 mm) com anestésicos de 40 mL de plástico. Use este prato para injeções.
  4. Incubar o peixe com os anestésicos locais, até que cessou o movimento odontódios.

4. Microinjeção de Cerebroventricular

  1. preparação dos aparelhos de injeção
    1. preparar o vidro capilares de injeção usando um extrator de agulha com os seguintes parâmetros: ciclo, 537; puxando o ciclo, 250; velocidade de aquecimento 1.5 s; tempo, 80 ms.
    2. trazer a pressão de regulação na fonte de pressão de 25 psi.
    3. Definir os parâmetros de microinjector para o seguinte: Mantenha pressão psi 20; ejetar pressão 10psi; período valor 2,5; associada MS. valor 100
    4. Carregar o capilar de vidro com a solução de injeção. Introduza o capilar de vidro no suporte de microinjeção. Ajustar o ângulo de injeção de 45°.
      Nota: Os protocolos mais detalhados podem ser encontrados conforme descrito em referências 27 , 46.
  2. Peixes de um lugar para uma nova placa de Petri preenchida com solução de anaesthetization (como na etapa 3.3).
  3. Segurar o peixe com o fórceps e o Oriente para injeção.
  4. Gerar um corte usando a ponta de uma agulha 30G no crânio sobre a óptica tectum, onde se encontram as duas placas laterais. Não introduza a ponta do tecido cerebral, isto poderia causar sangramento e danos. Ver referências 27 ,, 45 , 46 para obter detalhes adicionais.
  5. Inserir o capilar de vidro na fenda.
    1. Use apenas a ponta da agulha e não penetrar mais de 1 mm, através do crânio. Continue segurando o peixe e insira a ponta do vidro capilar através do local de incisão.
    2. Orientar a ponta do vidro capilar para o telencéfalo em um ângulo de 45°. Injete 1 µ l da solução. O líquido se dispersa imediatamente após a injeção.

5. Recuperação

  1. lugar o peixe de volta para um recipiente de transporte até que se recupere. Conectar o recipiente para a água de peixes regularmente circulação para garantir a qualidade da água ideal.
    Nota: A recuperação deve normalmente leva 1 min. Se leva mais tempo, os peixes devem ser mantidos com os anestésicos locais por um tempo mais curto (isso precisa ser otimizada pelo experimentador).

6. Preparação do tecido e Set Sectioning

  1. espera por um período desejado antes de sacrificar o peixe.
    Nota: Isto depende da pergunta experimental. Deposição de amiloide pode ser vista logo em 1 dia após a injeção.
  2. Sacrificar o peixe usando o método apropriado dependendo dos regulamentos éticos (por exemplo, tratar o peixe com 0,1 M MESAB).
  3. Abrir o crânio acima o tectum óptica usando pinça pontiaguda no lado dorsal e dissecar a cabeça, logo atrás da barbatana peitoral usando um bisturi.
  4. Corrigir as cabeças usando 2% paraformaldeído (PFA) durante a noite a 4 ° C. uso 3 mL de PFA per capita em um tubo de plástico com uma tampa de parafuso.
    Atenção: Usar o equipamento de protecção adequado ao manusear PFA.
  5. Para cryoprotection e descalcificação, lavar a cabeça três vezes em 0.1M tampão fosfato (pH 7,4), depois transferi-los para a solução de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 20% sucrose/20% e incubar durante a noite a 4 ° C.
  6. Para incorporar o tecido para secionar a resina, congelar as cabeças em 7,5% gelatin/20% solução de sacarose em moldes de plástico histologia em gelo seco (aproximadamente 3-5 min para congelar um bloco). Armazenar as amostras a-80 ° C ou continuar para a próxima etapa (cryosectioning).
  7. Seção as cabeças em 12 µm de espessura cryosections usando um criostato como descrito 28 ,, 42. Transferir o cryosections diretamente sobre lâminas de vidro e armazenar a-20 ° C para o uso a longo prazo.

7. Coloração imuno-histoquímica e microscopia

Nota: executar todas as etapas de incubação em uma câmara umidificada. E, todas as etapas de lavagem são para 10 min cada.

  1. Secar as seções por 30 min à temperatura ambiente. Após o descongelamento, lave as seções duas vezes em PBS e uma vez em PBSTx (PBS com 0,03% Triton X-100).
  2. Incubar com o anticorpo primário (anticorpo anti-Aβ42; diluição de 1: 500 em PBSTx) em 4 ° C durante a noite. após dia, lave uma vez em PBS e duas vezes em PBSTx.
  3. Incubar as secções com o anticorpo secundário (deteção de fluorescência acoplados, diluição de 1: 500) juntamente com DAPI (1 μg/mL) em PBSTx para 2 h à temperatura ambiente.
  4. Lavagem três vezes em PBSTx. Após a lavagem final, montar as lâminas com uma lamela usando 100 μL 70% glicerol.
  5. Adquirir imagens fluorescentes usando um microscópio confocal (por exemplo com o objetivo de 20 X PL APO N.A. 0,7 com 488 gama de excitação e um filtro verde padrão; a Figura 2) 39.

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Resultados

HPLC era usada para purificar o peptídeo sintetizado e espectrometria de massa tem sido utilizada para caracterizar os peptídeos β amiloide purificada. A coluna HPLC foi aquecida a 50 ° C, para melhorar a separação dos peptides Aβ e todas as frações foram coletadas. Para identificar o peptídeo sintetizado corretamente, realizou-se análise de espectroscopia de massa para todas as frações. O cromatograma UPLC mostra a pureza do composto. A fração HPLC que rendeu um pico sobre o UPLC (ou...

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Discussão

Os peptídeos de amiloide podem ser modificados para incluir variações de sequência ou várias marcas. Por exemplo, um peptídeo de amiloide mexido pode ser gerado, e os peptídeos podem ser rotulados com etiquetas fluorescentes no N-terminal da extremidade do peptide ou marcados com transportadora peptídeos39. Da mesma forma, no presente protocolo, o peptídeo de transportadora é o célula-penetrante peptídeo TR por causa de sua eficácia para transporte de carga profunda para o tecido de cérebro

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pelo DZNE e Associação Helmholtz (VH-NG-1021), poucos, TU Dresden (FZ-111, 043_261518) e DFG (KI1524/6) (CK); e pela Associação de Leibniz (Serra-2011-IPF-2) e BMBF (BioLithoMorphie 03Z2E512) (Y.Z.). Gostaríamos também de agradecer Ulrike Hofmann para síntese do peptide e Nandini Asokan, Prayag Murawala e Elly Tanaka ajuda durante as filmagens do procedimento.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Aminoácidos protegidos contra FmocIRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Alemanha)Aminoácidos à base de Fmoc para síntese de peptídeos em fase sólida (SPPS)
N,N,N′,N′-Tetrametil-O-(1H-benzotriazol-1-il)hexafluorofosfato de urônio (HBTU)IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Alemanha)RL-1030Ativador
OxymaIRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Alemanha)RL-1180Supressor de racemização
N,N-DiisopropiletilaminaIRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Alemanha)SOL-003Base
DimetilformamidaIRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Alemanha)SOL-004Solvente
N-MetilmorfolinaThermo Fisher (Kandel) GmbH, AlemanhaA12158Base
1-Hidroxibenzotriazol hidrato (HOBT)Sigma-Aldrich Co. LLC. ( St. Louis, MO, EUA)157260 ALDRICHActivator
PiperidinaMERCK KGaA (Darmstadt, Alemanha)822299Reagente de desproteção Fmoc
Diclormetano (DCM)MERCK KGaA (Darmstadt, Alemanha)106050Solvente
Ácido fórmico (FA)MERCK KGaA (Darmstadt, Alemanha)100264Componente tampão para HPLC
Ácido trifluoroacético (TFA)MERCK KGaA ( Darmstadt, Alemanha)808260Reagente de mistura de levagem
Triisopropilsilano(TIS)MERCK KGaA (Darmstadt, Alemanha)233781 ALDRICHReagente de mistura de levagem
Acetonitrila (para UPLC/LCMS)Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH34967-1LSolvente
Acetonitrila (para HPLC)VWR International Ltd, Inglaterra83639.320Solvente
DiethyletherVWR International Ltd, Inglaterra23811.326Solvente para precipitação de peptídeos
Ditiotritol (DTT)VWR International Ltd, Inglaterra0281-25GReagente de mistura de levagem
TentaGel S RAM Fmoc resina de amida de pistaRapp Polymere GmbH (Tuebingen, Alemanha)S30023Fase sólida para SPPS
Síntese de peptídeos Seringas de 5 ml com filtros incluídosIntavis AG (Colónia, Alemanha)34.274Tubo de reação para SPPS e para clivagem do filtro de
politetrafluoretileno (PTFE)Sartorius Stedtim (Aubagne, França)11806-50-NFiltração de peptídeos precipitados
Filtro de seringa de fluoreto de polivinilideno (PVDF)Carl Roth GmbH + Co. KG KarlsruheKC78.1Pré-filtragem para
sintetizador de peptídeosIntavis, Colônia, AlemanhaResPep SLSintetizador de peptídeos de fase sólida automatizado
Water Alliance HPLCWaters, Milford Massachusetts, EUAWaters 2998, Waters e2695Cromatografia líquida de alta pressão de fase reversa semi-preparativa (HPLC)
PolymerX, tamanho da conta 10μ m, 250x10 mmPhenomenex Ltd. Alemanha00G-4328-N0Coluna de HPLC de poliestireno poroso divinilbenzeno
Milli-Q Advantage A10, com um filtro Milli-QEMD Millipore Corporation, Billerica, MA, EUALCPAK0001Sistema de purificação de água
Unidade de filtragemSartorius Stedtim (Aubagne, França)16307Unidade de filtração para precipitação de peptídeos
UPLC Aquity com detectorUVWaters, Milford Massachusetts, EUAM09UPA 664MAnalítica ultra HPLC de fase reversa para LC-MS
ACQUITY UPLC BEH C18, tamanho do cordão 1,7 μ m, 50x2,1 mmWaters, Milford Massachusetts, EUA186002350coluna analítica C18
ACQUITY TQ DetectorWaters, Milford Massachusetts, EUAQBB908Espectrometria de massa de ionização por eletrospray (ESI-MS)
CHRIST ALPHA 2-4 LD plus + vacuubrand RZ6Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Alemanha16706, 101542Liofilizador com bomba de vácuo
Leitor de placas ParadigmBeckman Coulter
MESAB (etil-m-aminobenzoato de metanossulfonato)Placas de Petri Sigma-AldrichA5040
Sarstedt821.472
Solução salina tamponada com fosfatoLife Technologies, GIBCO10010-056
AgulhaBecton-Dickinson305178
Microscópio de dissecaçãoOlympus, Leica, ZeissVaria de acordo com o fabricante
Dumont PinçasWorld Precision Instruments501985
Gillies Pinças de DissecçãoWorld Precision Instruments501265
Capilares de injeção de vidroWorld Precision InstrumentsTWF10
PicoNozzleWorld Precision Instruments5430-12
Iluminador pneumático dodos instrumentos SYS-PV820da precisão do mundo
; Guia de Luz de AnelParkland ScientificILL-RLG
CryostatLeicaCM1950
de fase sólida HPLC anel de PicoPump

Referências

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