Artigo de método

Isolamento de células progenitoras endoteliais de sangue humano do Cordão Umbilical

DOI:

10.3791/56021

⸱

14 de setembro de 2017

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Arkansas

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O objetivo do presente protocolo é isolar as células progenitoras endoteliais do sangue do cordão umbilical. Algumas das aplicações incluem o uso dessas células como um biomarcador para identificar pacientes com risco cardiovascular, tratamento de doenças isquêmicas, e criando engenharia de tecido vascular e coração válvula de construções.

Resumo

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A existência de células progenitoras endoteliais (EPCs) no sangue periférico e sua participação na vasculogenesis foi primeiramente relatada por Ashara e colegas1. Mais tarde, outros documentada a existência de tipos similares de EPCs provenientes da medula óssea2,3. Mais recentemente, Yoder e Ingram mostraram que os EPCs derivado de sangue de cordão umbilical tinham um potencial proliferativo mais elevado em comparação com os isolados de adulto periférico de sangue4,5,6. Além de estar envolvido em vasculogenesis pós-natal, EPCs mostraram também promessa como uma fonte de célula para criar engenharia de tecido vascular e coração válvula construções7,8. Existem vários protocolos de isolamento, alguns dos quais envolvem a classificação de células de células mononucleares (MNCs) derivadas das fontes mencionadas anteriormente, com a ajuda de marcadores endoteliais e hematopoiéticos ou cultivo essas multinacionais com crescimento endotelial especializado médio, ou uma combinação destas técnicas9. Aqui, apresentamos um protocolo para o isolamento e cultura de EPCs usando especializada endotelial suplementado com fatores de crescimento, sem o uso de immunosorting, seguido pela caracterização das células isoladas usando mancha ocidental e immunostaining.

Introdução

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Diversos investigadores estudaram as características e o potencial humano EPCs5,10,11,12,13. EPCs podem ser descritos como circulantes de células que têm a capacidade de aderir ao tecido endotelial em sites de hipóxia, isquemia, lesão ou formação de tumor e contribuir para a formação de novas estruturas vasculares4,14. Seu envolvimento observado em neovascularização, sob a forma de vasculogenesis pós-natal, conduziu a uma compreensão da fisiopatologia destas células e a sua utilização em aplicações terapêuticas4,15, 16. o número de EPCs em um indivíduo foi mostrado para ser correlacionados com patologia cardiovascular9,15,16,17,18,19 ,20. Outros estudos também diferenciadas EPCs em um fenótipo de fibroblasto tipo de válvula e propôs que estas células poderiam ser utilizadas para a engenharia de tecidos coração válvulas7,21.

As moléculas de superfície celular particular precisava isolar EPCs não foram claramente identificadas devido a discrepâncias entre as investigações4. A adesão das multinacionais para uma certa matriz, com a exposição a uma variedade de condições de cultura, foi realizada por vários grupos1,17,22,23, sugerindo que os EPCs putativos pode Exiba Propriedades fenotípicas diferentes. Essas propriedades incluem a falta de capacidade de phagocytotic, formação do tubo em Matrigel e da captação de lipoproteínas de baixa densidade Dil-acetilado. A alta clonogenic e potencial proliferativa são duas propriedades com quais EPCs pode ser hierarquizada5. EPCs podem também formar em vitro túbulos quando cocultured com pulmão fetal humano de fibroblastos4. Estas células são conhecidas para expressar marcadores de superfície de células endoteliais e compartilhar alguns dos marcadores hematopoiéticas13,24,25. Os marcadores positivamente expressos que são amplamente aceitos para fenotipagem EPCs são CD31, CD34, receptor de fator de crescimento vascular endotelial 2 (VEGFR2), von Willebrand (vWF) de fator, CD133, c-Kit e vascular endotelial caderina (VE-caderina)4 , 18. as células que expressam co CD90, CD45, CD14, CD115 ou actina de músculo liso-alfa (α-SMA) não são consideradas ser EPCs devido à sua limitada capacidade potencial, proliferativa de fagocitam bactérias e incapacidade para formar de novo humano vasos na vivo4,7. Este artigo descreve um protocolo modificado para o isolamento de células progenitoras endoteliais humano sangue do cordão umbilical sem necessidade de qualquer célula protocolos de classificação. Neste artigo, usamos CD31, CD34 e VEGFR2 como os marcadores positivos, com α-SMA como o indicador negativo.

Neste artigo, propomos um método de isolamento e cultivo de células progenitoras endoteliais do sangue do cordão umbilical sem célula classificação usando especializadas suplementado de crescimento endoteliais com fatores de crescimento (EGM). Este EGM contém fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e fator de crescimento fibroblástico (FGF), que realçam a sobrevivência, proliferação e migração de células endoteliais26. Ele também inclui o ácido ascórbico, que é responsável por manter a morfologia de paralelepípedos de células; insulin-como fator de crescimento-1 (IGF-1), que fornece angiogênico e função migratória; e heparina, que faz com que a melhor estabilidade a longo prazo dos fatores de crescimento no médio26. Outros fatores de crescimento adicionados ao meio de cultura de células endoteliais inclui suplementação com fator de crescimento epidérmico (EGF), que ajuda na proliferação de célula estimulante e diferenciação e hidrocortisona, que sensibiliza as células para EGF26 . Nós mostramos que o uso deste meio de crescimento específico produz maior número de EPCs comparados ao meio basal endotelial (EBM) ou médio de Eagle modificado (DMEM de Dulbecco).

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Protocolo

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esta pesquisa foi realizada com a aprovação da Universidade de Arkansas institucional Review Board (número de aprovação de 16-04-722). Unidades de sangue de cordão umbilical foram coletadas em solução de citrato fosfato dextrose (CPD) no banco de sangue de cordão de Arkansas, e as unidades que não cumprem o requisito de armazenamento foram doadas para pesquisa. Unidades de sangue de cordão foram enviadas ao laboratório dentro de 24 h de coleção à temperatura ambiente.

1. isolamento de progenitoras endoteliais células do sangue do cordão

  1. preparação dos reagentes.
    1. EGM preparar adicionando meio basal endotelial (EBM) a 10% de soro fetal bovino (FBS) suplementado com 20 ng/mL de fator de crescimento semelhante à insulina (IGF), 1 µ g/mL de ácido ascórbico, 5 ng/mL recombinante humano fator de crescimento epidérmico (rhEGF), 22,5 µ g/mL heparina e 0,5 ng/mL vascular fator de crescimento endotelial (VEGF), juntamente com 10 ng/mL de recombinante humano fator de crescimento B (rhFGF-B), 0,2 µ g/mL hidrocortisona e 2% penicilina-estreptomicina-glutamina. Esterilizar o meio de cultura usando um filtro de 0,2 µm polietersulfona (PES) membrana vácuo.
    2. Preparar rato eu cauda solução de colágeno em uma concentração de 50 µ g/mL usando 0,02 N de ácido acético. Esterilizar esta solução usando um filtro de seringa 0,2 µm.
      3. Placas de 6 boas
    3. pré-revestimento com 2 mL de rato preparado eu cauda solução de colágeno para cada poço. Colocá-los numa incubadora mantida em 5% de CO 2 e 37 ° C, durante pelo menos 1 h antes da semeadura.
    4. Diluir cerca de 25 mL de sangue do cordão umbilical com Hanks equilibrado sal solução (HBSS) numa concentração de 1:1.
    5. Preparar precipitação de rádio-imuno ensaio (RIPA) Buffer usando cloreto de sódio de 150 mM, 1% Triton X-100, 0,5% de sódio Deoxycholate do, β-glicerofosfato de 1mm, 0,1% SDS e 50 mM Tris (pH 8.0).
  2. Isolamento de células progenitoras endoteliais.
    1. Tudo quente preparado reagentes em banho-maria a 37 ° C antes do isolamento.
    2. Adicionar 20 mL de reagente de médio gradiente de densidade para um tubo de centrífuga de 50 mL.
    3. Camada cuidadosamente 20 mL de sangue do cordão umbilical diluídos em tubo de centrífuga contendo meio de gradiente de densidade sem quebrar essa camada apontando a pipeta para as paredes laterais do tubo.
    4. Separar os componentes de sangue com base em suas densidades ( Figura 1) por centrifugação a 800 x g durante 30 min à temperatura ambiente, com o freio do rotor da centrífuga. Não perturbe as diferentes camadas.
    5. Remover a camada de plasma pipetando cuidadosamente la fora do tubo sem perturbar outras células da camada camadas até que a ponta da pipeta é capaz de atingir o MNC (ver Figura 1). Descartar o plasma removido.
      Nota: Enquanto estiver usando pontas de pipetas para remover o plasma, deixar uma pequena camada de plasma acima da camada MNC ( Figura 1) para reduzir as perturbações.
    6. Recolher o casaco buffy que contém as MNCs usando uma seringa equipada com uma agulha de calibre 18 e transferi-lo para um tubo de centrifugação fresco.
    7. Adicionar um volume igual de EBM para centrífuga coletados MNCs. estes tubos 500 x g durante 10 minutos no 4 ° C. descartar o sobrenadante.
      Nota: O centrifugado aparecerá vermelho por causa da presença de glóbulos vermelhos/eritrócitos.
    8. Adicionar 5 mL de solução de cloreto de amónio para lisar células vermelhas do sangue. Incubar o tubo no gelo por 5-10 min, agitando ocasionalmente.
      Nota: Devem ser tomadas precauções durante esta etapa para não exceder o tempo de duração, como pode ser prejudicial para as MNCs.
    9. Centrifugar os tubos a 500 x g durante 10 minutos a 4 ° C e descartar o sobrenadante. Se hemácias persistirem, repita as etapas 1.2.8 e 1.2.9 até sem cor vermelha é observada em pelota.
    10. Resuspenda o pellet em EGM preparado e usar o hemocytometer para contar as MNCs.
    11. Aspirado o rato eu cauda colágeno-revestido 6 placa (da etapa 1.1.3) e lavar os poços três vezes com 1x tampão fosfato salino (PBS).
    12. Sementes a pelota MNC resuspended na EGM para a placa de colágeno em uma concentração de 1 x 10 7 MNCs em cada poço. Coloque-o na 37 ° C, 5% CO 2 incubadora.
    13. Após 24 h, Aspire o meio e lavar os poços uma vez com EGM. Adicionar 3 mL de meio EGM a cada poço e colocá-lo na 37 ° C, 5% CO 2 incubadora.
    14. Repor a placa com meio EGM fresco todos os dias durante 7 dias. Após 7 dias, alterar o meio EGM cada outro dia.
    15. Usando um microscópio de campo claro, tirar imagens da placa 6-bem todos os dias para controlar a progressão das colônias de células endoteliais. Marcar a placa onde surgem as colônias de acompanhar o seu crescimento.
      Nota: Normalmente demora entre 5 e 9 dias para as colônias que aparecem na cultura.
  3. Expansão de células progenitoras endoteliais.
    1. Casaco do frasco de cultura T-25 com rato eu cauda colágeno (50 µ g/mL) e colocá-lo na 37 ° C, 5% CO 2 incubadora de pelo menos 60 min. aspirar e lavar o frasco de cultura de células T-25 três vezes com PBS 1x antes da semeadura das células.
    2. Trypsinize as colônias de células endoteliais, quando atingem cerca de 3 mm de tamanho usando 150 µ l de solução de tripsina-EDTA 0,05% em cada poço. Colocar a placa de 6 volta a 37 ° C, 5% CO 2 incubadora para 2-3 min.
    3. Bata levemente a placa de 6 para desalojar as células anexadas. Imediatamente adicione 2 mL de EGM e recuperar as células em um tubo de centrífuga de 15 mL.
    4. Contar as células usando um hemocytometer e calcular a densidade de semeadura inicial.
      5. Tubos de
    5. rotação da centrífuga de 15 mL a 400 x g, durante 5 min. Ressuspender as células em EGM e o balão de T-25 com ~ 500.000 células da semente. Marque este frasco como passagem 1 e colocar o balão de T-25 volta a 37 ° C, 5% CO 2 incubadora.
      Nota: As células podem ser chapeadas no EBM e DMEM para comparar o crescimento com EGM.
    6. Para mais passagens, quando o frasco atinge 90% confluência, siga os passos 1.3.1 - 1.3.5 e propagar novamente as células de 10 4 células/cm 2 em frascos de cultura de células T-75 ou T-175. Prossiga para a caracterização das células isoladas (etapas 2 e 3).

2. Caracterização de células isoladas usando Western Bloting

  1. Adicionar 50-100 µ l do lysis buffer em cada passagem quando seguindo os passos de expansão para caracterizar as células isoladas. Recolher proteínas de aproximadamente 500.000 ou mais células.
  2. Pipetar acima e para baixo vigorosamente para romper as células e liberar as proteínas. Coletar e transferir a reserva para um tubo de microcentrifugadora.
  3. Girar o tubo microcentrifuga a 500 x g e transfira cuidadosamente o sobrenadante para um novo tubo de microcentrifugadora. Rotular e armazenar os tubos a-80 ° C para armazenamento a longo prazo.
  4. Quantificar a quantidade de proteínas em cada tubo utilizando qualquer Bradford ' s ou BCA do ensaio de 28 , de 27 , 29.
  5. Realizar a mancha usando os procedimentos padrão de 28 , de 27 , 29 ocidental. Analise a 5 µ g de proteína total para a expressão de CD34 CD31, VEGFR2 e α-SMA. Use o α-tubulina para normalizar os dados.

3. Imunofluorescência indireta

  1. proceda à sonicação as lamelas de vidro 18mm em etanol a 50% e secá-las. Deixar as lamelas limpas em uma placa de 12 durante a noite de biossegurança capuz com um UV acesa para esterilizá-los.
  2. Casaco as lamelas com 50 & #181; g/mL de rato eu cauda colágeno e transferir a placa para a 37 ° C, 5% CO 2 incubadora pelo menos 60 min.
  3. Aspire o colágeno e adicionar 1 mL de 1X PBS para a placa de 12 para lavar as lamelas. Aspire a PBS 1x e repita duas vezes.
  4. 250.000 sementes cultivadas EPCs em cada poço e lugá-los de volta a 37 ° C, 5% CO 2 incubadora durante pelo menos 3 dias antes de efectuar immunostaining.
  5. Lavar a placa 3 vezes com PBS 1x. Adicione 1 mL de metanol gelada a cada poço e incubar a temperatura ambiente por 15 min consertar as células.
  6. Realizar immunostaining usando um protocolo padrão de 27 , 28 , 29. Usar os anticorpos em suas diluições apropriadas (por exemplo, CD31 (01:20), CD34 (01:50), α-SMA (1: 100) e VEGFR2 (01:50)).
  7. Imagens das lamelas de immunostained usando um microscópio de epifluorescência.

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Resultados

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Isolamento e expansão de células progenitoras endoteliais:
Um esquema (Figura 1) é fornecido retratando o protocolo geral. As camadas de componente de sangue diferentes foram observadas após centrifugação gradiente de densidade do sangue de cordão humano com médio gradiente de densidade. Após semeadura MNCs nas chapas de colágeno-tratados, a consequência natural das colônias foi observado pela primeira vez entre os dias 5 e 7(

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Discussão

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Como mencionado anteriormente, o aderente EPCs possuem uma morfologia de paralelepípedos. Nossas MNCs isoladas progrediam de uma colônia de células fusiformes (Figura 2A-2D) nas fases iniciais de uma colônia de paralelepípedos (Figura 2E-2F) durante um período de dez dias em cultura. EPCs foram chamadas diferentemente por grupos de pesquisa diferentes, ou seja, como tarde células progenitoras endoteliais10

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Divulgações

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Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

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Este material é baseado em trabalho, apoiado pela Fundação Nacional de ciência sob Grant no. CMMI-1452943 e pelo Colégio de honras da Universidade de Arkansas. Também gostaríamos de reconhecer o banco de sangue de cordão de Arkansas nos fornecer unidades de sangue de cordão.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
A) Para isolamento e cultura
EGM-2 BulletKitLonzaCC-3162Este produto vem com todos os fatores de crescimento necessários para fazer o Meio de Crescimento Endotelial
Fetal Soro BovinoThermofisher Scientific26140079
Pencillin-Estreptomicina-Glutamina (100x)Thermofisher Scientific10378016
Ficoll-PaqueGE Heatlhcare17-1440-02
Solução de Sal Balanceada Hank'sThermofisher Scientific14170-112
Células-TroncoCloreto de Amônio7850
1x Tampão de Fosfato SalinoThermofisher Scientific14190250
Cauda de Rato I ColágenoCorning354236
Ácido Acético GlacialAmresco0714-500ML
0,05% Tripsina-EDTAThermofisher Scientific25300054
tampão HEPESThermofisher Scientific15630080
Dulbecco's Modified Eagle's MediumThermofisher Scientific10566-016
B) Anticorpos e lisados celulares
CD31 Abcamab28364diluição 1:250  para Western blotting
CD34Santa Cruz Biotechnologysc-7045diluição 1:100 para Western blotting
α-SMAabcam ab5694diluição 1:100 para Western blotting
α-tubulinabcamab7291diluição 1:2,500 para Western blotting
VEGFR2abcamsc504Diluição 1:100 para Western blotting
Lisado de células endoteliais da veia umbilical humanaSanta Cruz Biotechnologysc24709 
células intersticiais de válvulaLinha celular primária cultivada em laboratório próprio e lisada com tampão RIPA
C) Western blotting e imunocoloração
10x tampão Tris/Glicina/SDSBiorad161-0772Usado como tampão de corrida
10x tampão Tris/GlicinaBiorad161-0771Usado como tampão de transferência
Membrana de transferência Immobilon-FLMerck MilliporeIPFL0010Esta é uma membrana de transferência de PVDF que tem 45 µ m tamanho dos poros e é mencionado no protocolo como membrana western blot
4x tampão de amostra LaemmliBiorad161-0747
2-mercaptoetanolBiorad161-0710
10% Criterion TGX gel pré-moldadoBiorad5671033
Prolong Gold antifadeThermofisher ScientificP36930Usado para montar lamínulas imunocoradas para armazenamento a longo prazo
MetanolVWR AnalyticalBDH1135-4LP
Tecnologias de deLisado de

Referências

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