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Artigo de método

Semi automatizados de análise da morfologia do músculo esquelético de rato e composição de fibra-tipo

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DOI:

10.3791/56024

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31 de agosto de 2017

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1Department of Medicine-Cardiology Division, University of Colorado School of Medicine, 2Department of Molecular Physiology and Biophysics, Baylor College of Medicine

Neste artigo

Resumo

Coloração imuno-histoquímica de isoformas de cadeia pesada de miosina emergiu como o discriminador de estado-da-arte do tipo de fibra muscular esquelético (ou seja, tipo I, tipo IIA, tipo IIX, tipo IIB). Aqui, apresentamos um protocolo de coloração juntamente com um algoritmo semi-automático de romance que facilita a rápida avaliação da morfologia do tipo de fibra e fibra.

Resumo

Durante anos, distinções entre os tipos de fibra de músculo esquelético foram melhor visualizadas pela coloração de miosina-ATPase. Mais recentemente, coloração imuno-histoquímica de isoformas de miosina pesada corrente (MyHC) tem emergido como um discriminador mais fino do tipo de fibra. Tipo I, tipo IIA, IIX e tipo IIB fibras agora podem ser identificadas com precisão, com base no seu perfil de MyHC; no entanto, a análise manual desses dados pode ser lento e baixo-direita tedioso. A este respeito, avaliação rápida, exata da composição da fibra-tipo e morfologia é uma ferramenta muito desejável. Aqui, apresentamos um protocolo para coloração imuno-histoquímica estado-da-arte da MyHCs nas seções congeladas obtidas de músculo do membro posterior do mouse em conjunto com um algoritmo semi-automático de romance que acelera a análise da morfologia do tipo de fibra e fibra. Como esperado, o músculo sóleo exibido mancha para tipo I e fibras IIA, mas não para as fibras tipo IIX ou tipo IIB. Por outro lado, o músculo tibial anterior era composto predominantemente de tipo IIX e tipo IIB fibras, uma pequena fração de fibras de tipo IIA e pouco ou nenhum tipo I fibras. Várias transformações de imagem foram utilizadas para gerar mapas de probabilidade, com a finalidade de medir os diferentes aspectos da morfologia das fibras (ou seja, área da seção transversal (CSA), diâmetro de Feret máxima e mínima). Os valores obtidos para estes parâmetros foram então comparados com os valores obtidos manualmente. Não há diferenças significativas foram observadas entre o modo de análise em relação ao CSA, diâmetro de Feret máximo ou mínimo (todos os p > 0,05), indicando a precisão do nosso método. Assim, nosso protocolo de análise de imunocoloração pode ser aplicado para a investigação dos efeitos na composição muscular em muitos modelos de envelhecimento e miopatia.

Introdução

-Já há algum tempo que o músculo esquelético é composto por fibras simples de muitos tipos1. Inicialmente, dois grupos de fibras foram caracterizados com base em suas propriedades contráteis e chamado, apropriadamente, contração lenta (tipo I) e contração rápida (tipo II). Estas categorias eram ainda mais diferenciadas com base no metabolismo de fibra. Desde tipo I fibras são ricas em mitocôndrias e dependente do metabolismo oxidativo, eles foram elucidados por robustamente positivo dinucleótido de nicotinamida e adenina-tetrazólio redutase (NADH-TR) face2 ou Succinato desidrogenase (SDH)3 a coloração. Por outro lado, as fibras do tipo II exibiram menor e graus variáveis de NADH-TR face ou SDH manchando e foram divididos em dois subgrupos de contração rápida (tipo IIA e IIB) um pouco grosseira com base na sua capacidade oxidativa relativa. Essas distinções entre fibras tem sido visualizadas mais eficazmente pela miosina-ATPase coloração onde tipo I fibras mancham escuras depois de uma pré-incubação a pH 4.0 e tipo IIB fibras absorvem precipitada seguir pré-incubação com fibras de tipo IIA pH 10,0 coloração intermediària4.

Mais recentemente, coloração imuno-histoquímica de isoformas de miosina pesada corrente (MyHC) tem emergido como um discriminador mais fino de fibra-tipo5. Tipo I, tipo IIA e tipo IIB fibras podem ser todos identificadas com precisão com base no seu perfil MyHC. Além disso, um outro tipo de rápido-contração muscular metabolicamente intermediário-fibra, tipo IIX, tem sido identificados6. Fibras de híbrido expressar mais do que um MyHC também foram confirmados5,7,8. Algumas espécies como o gato e o babuíno são conhecidos para não expresso tipo IIB MyHCs6. Apesar de imunocoloração MyHC atualmente é a avaliação do estado-da-arte da composição muscular, a análise dos dados obtidos através desta técnica é complicado e demorado sem assistência automatizada. Para este fim, um punhado de métodos semi automatizados para analisar esses dados foram desenvolvidos5,9,10. Aqui, apresentamos um protocolo relativamente padrão para identificação de imuno-histoquímica de fibra muscular tipo5,7,8,10, , juntamente com um romance semi-automático algoritmo que acelera a análise da morfologia do tipo de fibra e fibra com precisão.

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Protocolo

todos os procedimentos envolvendo ratos foram aprovados pelo Comitê de uso e Universidade do Colorado-Anschutz Medical Campus institucional Animal Care (91813(05)1D).

1. dia 1: primária (1°) imunocoloração com bloqueio de albumina de soro bovino (BSA)

  1. ar seco seções congeladas do músculo do membro posterior de rato (por exemplo, tibial anterior, sóleo) montagem em slides carregados para ~ 30 min 11. desenhar uma borda ao redor as seções usando uma barreira hidrofóbica PAP caneta.
  2. Lugar ~ 250 µ l de soro de 5% BSA/tampão de fosfato (BSA/PBS) em cada slide para bloquear a ligação do anticorpo específico. Incubar em temperatura ambiente por 1 h.
  3. Enquanto bloqueia, 01:50 de preparar diluições do anticorpo 1 ° sobrenadante em 5% BSA/PBS (todos são anticorpos monoclonais de rato, ver tabela 1 6 , 12); preparar 250 µ l de solução por slide. Manter estoques de anticorpo de 1° e diluições na Ice.

figure-protocol-1
tabela 1: os anticorpos primários usados para distinguir MyHCs.

  1. após a aspiração da solução bloqueio 5% BSA/PBS, adicionar 250 µ l da diluição do anticorpo de 1° para os slides adequados. Adicionar 250 µ l de 5% BSA/PBS para controlo de negativo somente anticorpo secundário (2°) slides.
  2. Incubar a 4 ° C por 24-48 h em um ambiente úmido.
    Nota: Um prato de Petri coberto com folha de alumínio com papel de filtro umedecido pode servir como uma câmara de incubação adequado.

2. Dia 2:2 ° imunocoloração com anticorpos fluorescentes

  1. aspirar solução de anticorpo 1° ou 5% BSA/PBS solução de controle. Lave todos os slides três vezes, 10 min com 5% BSA.
  2. Durante a lavagem, preparar diluições de 1: 200 dos anticorpos purificado, fluoróforo conjugado 2 ° em 5% BSA/PBS (ver tabela 2, todos são anti-rato cabra). Prepare 250 µ l de solução por slide. Manter anticorpos fluoróforo conjugado de 2° às escuras na Ice.

figure-protocol-2
tabela 2: anticorpos secundarios conjugados fluoróforo usado para visualizar de primária do anticorpo reconhecimento do MyHCs.

  1. após aspiração da terceira aplicação da solução a 5% BSA/PBS bloqueio, adicionar 250 µ l da diluição do anticorpo de 2° a todos os slides. Incubar durante 90 min à temperatura ambiente em um ambiente escuro, úmido.
  2. Solução de anticorpo 2° aspirado. Lave todos os slides três vezes, 10 min com 5% BSA/PBS.
  3. Lavagem com PBS. Seca durante 10 min.
  4. Montar a lamela com um meio de não-permanentes, baixa viscosidade montagem aquoso.
  5. Quando seco, selar as bordas de slide com as unhas pintadas. Secar e armazenar em um escuro slidebox.

3. Slides com microscopia de epifluorescência de imagem

  1. limpar os slides com uma pequena, 70% etanol-embebido laboratório-limpeza.
  2. Obter imagens digitais das seções de músculo immunostained usando um microscópio de epifluorescência, equipado com um aparelho fotográfico (consulte a Tabela de materiais).
    1. Selecione uma área de aproximadamente 1 mm 2 (objetivo de 10 X, at 1.4).
      2. Filtro de passa-tempo
    2. Vista fluorescência de anticorpos conjugados a Alexa 488 2° através de um 505 nm. Ver os a fluorescência gerada pela excitação dos anticorpos conjugados a Alexa 594 2° através de um filtro de passa-tempo 595 nm. Digitalize imagens com um computador PC equipado com um software de imagem compatível. Incluem a barra de escala da imaging software para análise posterior.

4. Análise de imagens com Fiji

Nota: antes de prosseguir com a análise, Fiji (disponível livremente o National Institutes of Health, Bethesda, MD) deve ser instalado através de https://imagej.net/Fiji/Downloads. Além disso, a macro usada neste processo é fornecida no Arquivo suplementar. Coloque o arquivo de macro em um diretório acessível.

  1. Carga brightfield uma imagem de uma seção selecionada em Fiji. Navegue até Plugins → segmentação → segmentação Weka Trainable.
  2. a fim de estipular as áreas celulares da seção, desenhar uma linha em uma fibra e clique em " adicionar a classe 1 ". Em seguida, desenhe uma linha no espaço entre as fibras e clique " adicionar a classe 2 " para marcar os domínios extracelulares. Repita até que há 5-10 etiquetas em cada classe. Classificador de trem clique
    1. . Sobre a sobreposição resultante de vermelha e verde, adicionar rótulos mais manualmente (consulte a etapa 4.2) incorretamente segmentado pedaços da imagem, se necessário. Repita até fibras (vermelho) são separadas adequadamente o espaço entre as fibras (verde).
  3. Clique " probabilidade de obter " e salvar a imagem em uma pasta recém rotulada.
  4. Repita o procedimento acima (passos 4.2-4.3) com a imagem fluorescente tirada do mesmo campo. Rotular as fibras immunostained como " classe 1 " e todas as regiões não-fluorescente como " classe 2 ". Salvar o mapa resultante de probabilidade para a mesma pasta onde a imagem processada brightfield é armazenada.
  5. Abrir um dos mapas probabilidade salvo anteriormente em Fiji. Desenhe uma linha reta na barra de escala fornecida pelo software da imagem latente. Vá para analisar → definir escala. Altere os parâmetros (ou seja, distância conhecida, unidade de comprimento) para seus valores apropriados como determinado pela barra de escala e, em seguida, verificar o " Global " caixa para padronizar a escala para cada imagem.
  6. Navegar para Plugins → Macros → executar → Tyagi et al fibra quantificação macro.ijm (consulte o Arquivo suplementar). Imediatamente, um painel de navegação irá aparecer. Abra a imagem ' pasta do host s; uma caixa de diálogo será exibida. Para cada caixa de diálogo, alterar o " fundo " valor de lista suspensa para " luz. "
    Nota: A pasta agora será preenchida com imagens dos contornos da fibra e arquivos de software de planilha dos resultados (diâmetro CSA e Ferrari são mais pertinentes ao quantificar a morfologia das fibras; parâmetros medidos podem ser ajustados em analisar medidas de conjunto). Dados de morfologia de fibra gerados pela função dos poros-análise de Fiji serão automaticamente transferidos para arquivos de software de planilha para ambas as imagens fluorescentes e brilhante campo.
  7. Calcular a fração de fibras expressando um determinado MyHC em um campo, dividindo o número de fibras fluorescentes no campo com o número de fibras totais na imagem correspondente campo claro.

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Resultados

Músculos do membro posterior (ou seja, tibial anterior, sóleo) dissecados de um rato masculino de C57BL/6 de idade desconhecida foram flash congelado pelo afundamento de um molde de plástico que contém o músculo em OCT composto em isopentano arrefecido a nitrogênio líquido. Em seguida, usando um cryotome, 8-10 µm serial seções foram cortadas a-20 ° C e transferidas para lâminas de vidro carregado positivamente diferentes12.

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Discussão

Aqui, nós fornecemos orientação útil para a identificação dos tipos de fibra de músculo esquelético. Ao fazê-lo, descrevemos um novo algoritmo para análise dos dados.

Desde que nossos resultados, em grande parte, confirmam os anteriores relatórios5,8,10 e refletem nossa própria medição manual, o algoritmo aparece ser exato. Ainda, encontramos algumas armadilhas experimentais infrequentes, incluindo bo...

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Divulgações

Os autores têm sem interesses conflitantes para divulgar.

Agradecimentos

Estamos gratos à Fundação Boettcher e a associação de esclerose Lateral amiotrófica (#17-II-344) pelo apoio da pesquisa.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Albumina de soro bovinoSigma AldrichA9418-100G5% em PBS
Barreira hidrofóbica Pap PenScientific Device Laboratory9804-02
Lâminas de microscópioGlobe Scientific1358W
CoverglassFisher Scientific12-544-E
ImmumountThermo Scientific9990402
EsmalteL'Oreal
Nikon Eclipse TE-200 Microscópio de Fluorescência Invertida e Campo ClaroDescontinuado
SPOT RT/KESPOT Imaging SolutionsRT940
Dell Optiplex
BA-F8 EstudosPrimário Banco de Hibridoma na Universidade de Iowacamundongo monoclonal IgG2b; 1:50
SC-71 Estudos de Desenvolvimento de Anticorpos PrimáriosBanco de Hibridoma na Universidade de Iowacamundongo monclonal IgG1; 1:50
BF-F3 Estudos de Desenvolvimento de Anticorpos PrimáriosBanco de Hibridoma na Universidade de Iowacamundongo monoclonal IgGM; 1:50
6H1 EstudosDesenvolvimento de Anticorpos Primários Banco de Hibridoma na Universidade de Iowacamundongo monoclonal IgGM; 1:50
Alexa Fluor 594 anti-IgG2bInvitrogenA21145cabra anti-mouse; 1:200
Alexa Fluor 488 anti-IgG1InvitrogenA21121cabra anti-mouse; 1:200
Alexa Fluor 594 anti-IgGMInvitrogenA21044cabra anti-mouse; 1:200
OUTSakura Finetek4583
isopentanoFisher ScientificO3551-4frio com nitrogênio liguid
PBSFisher BioreagentsBP665-110x, diluir para 1x
lenços umedecidos KimKimberly-Clark06-666A
de Desenvolvimento de Anticorpo de

Referências

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