Um ensaio de microarrays de sialoglicano pode ser usado para avaliar anticorpos anti-Neu5Gc em soros humanos, tornando-se um possível ensaio de diagnóstico de alto rendimento para câncer e outras doenças crônicas causadas por inflamação mediada por doenças humanas.
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Artigo de método
Perfis Anti-Neu5Gc IgG em Sera Humana com um Ensaio de Microarray de Sialoglicano
Neste artigo
Resumo
Resumo
As células são cobertas com um manto de cadeias de carboidratos (glicanos) que é comumente alterado em câncer e que inclui variações na expressão do ácido siálico (Sia). Estes são os açúcares ácidos que possuem uma espinha dorsal de 9 carbonos e que captam vertebrados de glicanos nas superfícies celulares. Duas das principais formas Sia em mamíferos são o ácido N- acetilneuraminico (Neu5Ac) e sua forma hidroxilada, ácido N- glicolneuraminico (Neu5Gc). Os seres humanos não podem produzir Neu5Gc endógeno devido à inativação do gene que codifica a hidroxilase de cianina 5'-monofosfato-Neu5Ac (CMP-Neu5Ac) (CMAH). O Neu5Gc estrangeiro é adquirido por células humanas através do consumo dietético de carne vermelha e produtos lácteos e, posteriormente, aparece em glicanos diversos na superfície celular, acumulando-se principalmente em carcinomas. Consequentemente, os seres humanos possuem anticorpos anti-Neu5Gc circulantes que desempenham vários papéis no câncer e outras doenças mediadas por inflamação crônica e que estão se tornando potenciais diagnósticos e terapêuticosRgets. Aqui, descrevemos um ensaio de microarrays de sialoglicano de alto rendimento para avaliar esses anticorpos anti-Neu5Gc nos soros humanos. Os glicanos que contêm Neu5Gc e seus pares de controles correspondentes (glicanos contendo Neu5Ac), cada um com uma amina primária do núcleo, estão ligados covalentemente a lâminas de vidro revestidas com epóxi. Nós exemplificamos a impressão de 56 slides em um formato de 16 poços usando uma nano-impressora específica capaz de gerar até 896 arrays por impressão. Cada slide pode ser usado para exibir 16 amostras de soros humanos diferentes para a avaliação da especificidade, intensidade e diversidade de anticorpos anti-Neu5Gc. O protocolo descreve a complexidade desta ferramenta robusta e fornece uma orientação básica para aqueles que visam investigar a resposta ao antígeno de carboidratos dietéticos Neu5Gc em diversas amostras clínicas em um formato de matriz.
Introdução
Sias são açúcares ácidos que cobrem as cadeias de glicano nas glicoproteínas de superfície celular e glicolípidos em vertebrados. A expressão de Sia é modificada em células cancerosas 1 e correlaciona-se com progressão e / ou metástase 2 , 3 . Duas das principais formas Sia em mamíferos são Neu5Ac e sua forma hidroxilada, Neu5Gc 2 . Os seres humanos não podem sintetizar Neu5Gc devido a uma inativação específica do gene que codifica a enzima CMAH. Este Sia não-humano incorpora metabólicamente em células humanas como "auto", provenientes de alimentos ricos em mine....
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Protocolo
Foram obtidas amostras de soros humanos do Banco de sangue israelense e foram utilizadas de acordo com a Declaração de Helsínquia e o Conselho de Revisão Institucional da Universidade de Tel Aviv.
1. Array Fabrication Planning and Layout
- Determine o layout do slide.
NOTA: Cada slide contém 16 sub-arrays divididos em 16 blocos idênticos numerados B1 a B16 ( Figura 1B , Figura Suplementar 1A ). - Determine o layout do pino. Use quatro pinos, cada impressão quatro sub-arrays (blocos) por slide:
O Pin 1 imprime os blocos 1, 2, 9 e 10;
O Pin 2 imprime os blo....
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Resultados
Array Printing, Development and Analysis:
A impressão de um microarray de sialoglicano com múltiplas amostras de glicano e curvas de IgG STD humanas em 16 blocos diferentes requer uma calibração completa para garantir que todas as amostras sejam impressas o mais uniformemente possível em todos os 16 blocos por slide e para todos os slides na mesma execução de impressão. Portanto, são necessários vários experimentos de calibração .......
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Discussão
Uma fabricação de microarrays de glicano bem-sucedida requer um planejamento cuidadoso e inclui várias etapas importantes no protocolo. Estes incluem: (1) planejar os layouts de blocos e placas que definem todos os parâmetros subseqüentes ( por exemplo, distâncias, espaçamento, quantidade de amostras e impressão); (2) limpar os pinos e garantir a integridade do pino, o que é crítico para controlar a homogeneidade do ponto; (3) mantendo alta umidade durante a impressão, crítica para evitar a evaporação da amostr.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado, em parte, por um Prêmio de Pesquisa de Desenvolvimento de Carreira do Israel Cancer Research Fund, uma concessão da Iniciativa Nacional de Nanotecnologia de Israel e Helmsley Charitable Trust para uma Área de Tecnologia Focal em Nanomedicines para Teranostics Personalizados (VP-K) e National Institutos de saúde concedem R01GM076360 (para XC).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Amina primária contendo sialoglycans | Glycohub, Inc., Davis, CA, EUA (http://www.glycohub.com/services) | Entre em contato info@glycohubusa.com para solicitações de compostos | Glicanos impressos |
| Fosfato monossódico monohidratado | Sigma | S9638 | Componente tampão de impressão |
| Fosfato dissódico heptahidratado | Sigma | S9390 | Componente tampão de impressão |
| Fosfato solução salina tamponada | Hy-Labs | BP-507/500D | Tampão de impressão/incubação/tampão de lavagem |
| Tris-base | Sigma | T1503 | Reagente bloqueador de lâminas |
| Glicerol | Sigma G-7893 | Componente tampão de impressão | |
| Etanolamina | Thermo-Fisher Scientific | 0700/08 | Reagente bloqueador de lâminas |
| Ovalbumina (Grau V) | Sigma | A5503 | Proteína de bloqueio de slides |
| Tween-20 | Sigma | P7949 | Detergente de lavagem deslizante |
| Alexa 555-Hydrazide | Thermo-Fisher Scientific | A20501MP | Marcador na matriz |
| ChromPure Human IgG, molécula inteira | Jackson Immunoresearch | 009-000-003 | Componente de impressão |
| Biotinilado- SNA | Vector Laboratories | B-1305 | Lectina vegetal – ligação Sia-alpha2– 6-linked |
| Biotinylated-MALII | Vector Laboratories | B-1265 | Plant Lectin – binding Sia-alpha2– 3-linked |
| Chicken-anti Neu5Gc IgY | BioLegend | 146903 | Detecção primária |
| Cy3-Streptavidin | Jackson Immunoresearch | 016-160-0848 | Ligação à biotina |
| Cy3-anti Human IgG | Jackson Immunoresearch | 109-165-088 | Detecção secundária contra IgG humano |
| Cy3-anti Chicken IgY | Jackson Immunoresearch | 703-165-155 | Secundário detecção contra amostras de soro humano IgY de frango |
| Banco de | israelense Detecção primária | ||
| Nitrogênio comprimido (Grau 5) | Ferramenta geral de espanagem/secagem | ||
| Lâminas revestidas com epóxi | Corning | 40044 | Lâminas |
| Revestidas com epóxi | PolyAn | 2D 104-00-221 | Slides. Neste tipo de lâminas, a superfície é mais hidrofóbica (em comparação com as lâminas de retirada do núcleo), portanto, o tampão de impressão de glicanos precisaria ser complementado com 0,005% de Tween-20 para obter 100 µ Manchas de tamanho M. |
| Placa de microtitulação de 384 poços | Genetix | 2070 | Placa de impressão |
| Marcador de laboratório VWR | VWR | 52877-310 | Etiquetagem de lâminas |
| Matriz de tubos de coloração | MST | Ferramenta de revelação de lâminas | |
| Banho de coloração | VWR | 25608-904 | Ferramenta de revelação de lâminas |
| Suportes de vidro de lâminas | VWR | 631-9321 | Ferramenta |
| de revelação de lâminasGenePix Scanner | Dispositivos moleculares | 4000B | Scanner de slides |
| LM-60 NanoPrinter | ArrayIt | LM-60 | Array impressora |
| Pins | ArrayIt | 946MP3 | Pinos de impressão |
| ProPlate Module | Grace Bio-Labs | P37004 | Módulo de desenvolvimento de slides |
| Água destilada | Bio-Lab | 2321020500 | Necessário para arrayer e umidificador |
| Multi Pippete eletrônico, 8 canais, faixa de volume 2-125 μ L | Thermo-Fisher Scientific (Matrix) | MA-2131 Impact2 Equalizer 384 | Multi pippete para descarte de amostras em placa de 384 poços |
Referências
- Padler-Karavani, V. Aiming at the sweet side of cancer: Aberrant glycosylation as possible target for personalized-medicine. Cancer Lett. 352 (1), 102-112 (2014).
- Amon, R., Reuven, E. M., Leviatan Ben-Arye,, Padler-Karavani, S., V, Glycans in immune recognition and resp....
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Reimpressões e permissões
