Artigo de método

Perfis Anti-Neu5Gc IgG em Sera Humana com um Ensaio de Microarray de Sialoglicano

DOI:

10.3791/56094

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13 de julho de 2017

 ,  ,  , 
1Department of Cell Research and Immunology, Tel Aviv University, 2Department of Chemistry, University of California-Davis

Neste artigo

Resumo

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Um ensaio de microarrays de sialoglicano pode ser usado para avaliar anticorpos anti-Neu5Gc em soros humanos, tornando-se um possível ensaio de diagnóstico de alto rendimento para câncer e outras doenças crônicas causadas por inflamação mediada por doenças humanas.

Resumo

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As células são cobertas com um manto de cadeias de carboidratos (glicanos) que é comumente alterado em câncer e que inclui variações na expressão do ácido siálico (Sia). Estes são os açúcares ácidos que possuem uma espinha dorsal de 9 carbonos e que captam vertebrados de glicanos nas superfícies celulares. Duas das principais formas Sia em mamíferos são o ácido N- acetilneuraminico (Neu5Ac) e sua forma hidroxilada, ácido N- glicolneuraminico (Neu5Gc). Os seres humanos não podem produzir Neu5Gc endógeno devido à inativação do gene que codifica a hidroxilase de cianina 5'-monofosfato-Neu5Ac (CMP-Neu5Ac) (CMAH). O Neu5Gc estrangeiro é adquirido por células humanas através do consumo dietético de carne vermelha e produtos lácteos e, posteriormente, aparece em glicanos diversos na superfície celular, acumulando-se principalmente em carcinomas. Consequentemente, os seres humanos possuem anticorpos anti-Neu5Gc circulantes que desempenham vários papéis no câncer e outras doenças mediadas por inflamação crônica e que estão se tornando potenciais diagnósticos e terapêuticosRgets. Aqui, descrevemos um ensaio de microarrays de sialoglicano de alto rendimento para avaliar esses anticorpos anti-Neu5Gc nos soros humanos. Os glicanos que contêm Neu5Gc e seus pares de controles correspondentes (glicanos contendo Neu5Ac), cada um com uma amina primária do núcleo, estão ligados covalentemente a lâminas de vidro revestidas com epóxi. Nós exemplificamos a impressão de 56 slides em um formato de 16 poços usando uma nano-impressora específica capaz de gerar até 896 arrays por impressão. Cada slide pode ser usado para exibir 16 amostras de soros humanos diferentes para a avaliação da especificidade, intensidade e diversidade de anticorpos anti-Neu5Gc. O protocolo descreve a complexidade desta ferramenta robusta e fornece uma orientação básica para aqueles que visam investigar a resposta ao antígeno de carboidratos dietéticos Neu5Gc em diversas amostras clínicas em um formato de matriz.

Introdução

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Sias são açúcares ácidos que cobrem as cadeias de glicano nas glicoproteínas de superfície celular e glicolípidos em vertebrados. A expressão de Sia é modificada em células cancerosas 1 e correlaciona-se com progressão e / ou metástase 2 , 3 . Duas das principais formas Sia em mamíferos são Neu5Ac e sua forma hidroxilada, Neu5Gc 2 . Os seres humanos não podem sintetizar Neu5Gc devido a uma inativação específica do gene que codifica a enzima CMAH. Este Sia não-humano incorpora metabólicamente em células humanas como "auto", provenientes de alimentos ricos em minerais Neu5Gc ( por exemplo, carne vermelha) 4 , 5 . Neu5Gc está presente em níveis baixos nas superfícies celulares do epitélio humano e do endotélio, mas especialmente se acumula em carcinomas. Neu5Gc é reconhecido como estrangeiro pelo sistema imunológico humoral humano 2 , 6 .A complexidade antigênica de Neu5Gc-glycan pode surgir em vários níveis, incluindo modificação de Neu5Gc, ligação, glicanos subjacentes e andaimes e sua densidade, tudo refletido pela complexidade da resposta de anticorpos anti-Neu5Gc em seres humanos 6 . Alguns desses anticorpos servem como biomarcadores de carcinoma e potencial imunoterapêuticos 7 . O advento da síntese quimiomenzima de diferentes sialoglicanos 8 abriu caminho para a análise mais aprofundada de tais anticorpos, facilitada pelo uso de tecnologia de microarray de glicano 9 , 10 . Assim, com a preparação e manipulação facilitadas de grandes bibliotecas de carboidratos naturais e sintéticos, as microarrays de glicano tornaram-se uma poderosa tecnologia de alto débito para investigar as interações de carboidratos com uma miríade de biomoléculas 10 , 11 , 12 , 13 . Em um formato de matriz, são utilizadas quantidades mínimas de materiais e esta exibição multivalente de glicanos biologicamente relevantes permite a investigação de milhares de interações de ligação em um único experimento. Importante, esta tecnologia também pode ser aplicada à descoberta de biomarcadores e ao monitoramento de respostas imunes em várias amostras 7 , 12 .

A fabricação bem-sucedida de microarray de glicano requer a consideração de três aspectos importantes: o tipo de robô de impressora, química de conjugação de glicano e ótica de detecção. Quanto à consideração do instrumento de impressão, duas técnicas estão disponíveis: impressoras de contato e sem contato. Em impressão de contato, os pinos de aço 1-48 são mergulhados em uma placa de fonte de vários poços contendo solução de glicano e são manchados em lâminas de vidro funcionalizadas, contactando diretamente a superfície deslizante de vidro. A quantidade da solução é deO fator do slide é uma função da duração persistente na superfície deslizante. Geralmente, as amostras são primeiro pré-manchadas em um bloco de vidro (para alcançar manchas homogêneas) antes de serem impressas na superfície deslizante. Em impressoras sem contato ( por exemplo, a impressora piezoelétrica), os glicanos são impressos a partir de um capilar de vidro usando sinais elétricos controlados. O sinal elétrico pode ser finamente calibrado para obter uma impressão mais precisa em relação à impressão de contato. O tamanho e a morfologia das manchas também são relativamente mais homogêneas. Uma vantagem adicional é a reciclagem da amostra de volta para a placa de origem após a impressão. No entanto, a principal desvantagem das impressoras piezoelétricas é a limitação da tipagem de impressão (4 ou 8), resultando em uma duração de impressão muito longa, o que requer atenção especial para a estabilidade do slide, a temperatura, a umidade e a evaporação da amostra. A impressora a jato de tinta sem contato requer volumes de amostra maiores 14 .

Em contraste com as opções disponíveis limitadas para métodos de impressão, a química de conjugação de glicano é uma consideração mais complexa, com muitas opções para escolher. A química de imobilização selecionada deve explicar os grupos ativos nos glicanos e a reatividade da superfície deslizante. Os glicanos a serem imobilizados sobre uma superfície de microarrays específica, sinteticamente sintetizada ou naturalmente isolada, exigem um grupo reativo idêntico. Além disso, os glicanos precisam ser puros e homogêneos. Por outro lado, a superfície de imobilização e a química devem proporcionar reprodutibilidade e densidade de ligação confiável. Múltiplos métodos de imobilização foram desenvolvidos com a inclusão covalente ou não covalente (absorção física) 10 , 11 , 12 , 13 . Para obter informações altamente detalhadas sobre a tecnologia impressa de microarray de glicano para os não iniciadosInvestigador, consulte estas excelentes críticas 13 , 15 . Importante, as informações mínimas recentes exigidas para uma iniciativa Glycomics Experiment (MIRAGE) descrevem diretrizes para a preparação de amostras 16 e para relatar dados de análises de microarrays de glicanos 17 para melhorar os padrões neste campo em crescimento.

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para a fabricação de microarrays de sialoglicano usando uma nano-impressora de contato específico em um formato de 16 poços. Cada um dos glicanos possui uma amina primária que medeia a sua ligação covalente para lâminas de vidro activadas com epóxi. Também descrevemos o desenvolvimento e a análise de um slide usando várias amostras de soros humanos, anticorpos e lectinas de plantas vinculativas de Sia. Os ensaios de microarrays de Sialoglycan envolvem várias etapas principais que incluem fabricação, processamento, desenvolvimento e análise de matrizes. A fabricação de matrizes exige planejar o arLayout de raios, preparando os glicanos e a placa fonte, programando a nano-impressora e imprimindo as lâminas. Posteriormente, os slides são processados, desenvolvidos e analisados ​​( Figura 1 ).

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Protocolo

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Foram obtidas amostras de soros humanos do Banco de sangue israelense e foram utilizadas de acordo com a Declaração de Helsínquia e o Conselho de Revisão Institucional da Universidade de Tel Aviv.

1. Array Fabrication Planning and Layout

  1. Determine o layout do slide.
    NOTA: Cada slide contém 16 sub-arrays divididos em 16 blocos idênticos numerados B1 a B16 ( Figura 1B , Figura Suplementar 1A ).
  2. Determine o layout do pino. Use quatro pinos, cada impressão quatro sub-arrays (blocos) por slide:
    O Pin 1 imprime os blocos 1, 2, 9 e 10;
    O Pin 2 imprime os blocos 3, 4, 11 e 12;
    O Pin 3 imprime os blocos 5, 6, 13 e 14; e
    O Pin 4 imprime os blocos 7, 8, 15 e 16 ( Figura 1A suplementar ).
  3. Determine o bloco e o layout da placa de 384 poços.
    NOTA: O pedido em que os glicanos aparecem em cada bloco requer um planejamento cuidadoso. Neste exemplo, arrAy, imprima cada amostra em quatro repetições, projete manchas de marcadores fluorescentes para estar localizado no canto inferior direito (para facilitar a análise do ponto) e imprima os pontos de IgG de curva padrão (DST) em seis concentrações crescentes ( Figura 1B suplementar ).
    1. Para cada ponto impresso, primeiro distribua o material em quatro poços (um para cada pino) em uma placa de 384 poços.
      NOTA: A ordem dos materiais na placa de 384 cavidades depende do layout do bloco projetado ( Figura suplementar 1B-C ).

2. Preparação de Glicanos e da Placa de Origem

  1. Preparar tampão de impressão de glicano (50 mL de tampão de fosfato 300 mM, pH 8,4). Pesar 58,5 mg de mono-hidrato de fosfato monossódico (NaH 2 PO 4 de 1H 2 O) e 3,9 g de hepta-hidrato de fosfato de dissódio (Na 2 HPO 4 .7H 2 O) em 40 mL de água desionizada (DIW). Titular para pH 8,4 usando NaOH 4 M. Ajuste o volume para 50 mL eD filtra através de uma membrana de 0,2 μm para esterilização.
  2. Preparar tampão marcador (50 mL de tampão fosfato 187 mM, pH 5). Pesar 289 mg de mono-hidrato de fosfato monossódico (NaH 2 PO 4 de 1H 2 O) e 1,94 g de hepta-hidrato de fosfato de dissódio (Na 2 HPO 4 .7H 2 O) em 40 mL de DIW. Titrar para pH 5 usando HCl 1 M. Ajuste o volume para 50 mL e filtre através de uma membrana de 0,2 μm para esterilização.
  3. Preparar o tampão da curva STD (50 mL de PBS-glicerol: solução salina tamponada com fosfato, pH 7,4, suplementado com 10% de glicerol a partir de um estoque de glicerol a 100%) e filtrá-lo através de uma membrana de 0,2 μm para esterilização.
  4. Prepare cada solução de reserva de glicano a 10 mM em DIW. Verifique as concentrações de glicano sialilado por detecção de fluorescência na análise de cromatografia líquida de alta pressão em fase inversa 18 .
  5. Diluir cada glicano a 100 μM num volume total de 100 μL de tampão de impressão de glicanoEm tubos de microcentrífuga.
  6. Prepare uma mistura de corante fluorescente contendo amina primária. Solubilizar Alexa 555-hidrazida para 1 mg / mL com tampão marcador e depois diluir para 1 μg / mL em um volume total de 1 mL.
    NOTA: Qualquer outro corante contendo amina primária pode ser usado com um comprimento de onda apropriado de acordo com o scanner deslizante.
    NOTA: Os pontos do marcador facilitam o alinhamento da grade em cada bloco durante a análise.
  7. Preparar diluições da curva de DST de IgG humana: preparar 0,5 mL de uma solução de reserva de IgG humana a 160 ng / μL em tampão de curva STD. Diluir em série o estoque 1: 1 seis vezes para obter 80, 40, 20, 10, 5 e 2,5 ng / μL, tudo em tampão de curva STD em um volume total de 200 μL cada.
    NOTA: Outros isotipos de Ig podem ser utilizados se adequados para o experimento ( por exemplo, IgA humana, IgM, IgE ou uma Ig de um organismo diferente).
  8. Coloque a placa de 384 poços no gelo. Usando uma multi-pipeta eletrônica, uma alíquota de 7 μL de cada glicano, marcador e curva de STD IgG-quatro replicadosS de cada um - de acordo com o layout da placa ( Figura suplementar 1C ). Para uma melhor precisão, carregue 35 μL de cada amostra e uma alíquota de 7 μL em cada um dos quatro poços da amostra. Coloque novamente os 7 μL restantes de cada glicano no tubo original.
  9. Cubra a placa com parafilme e gire durante 2 min a 250 g e 12 ° C. Coloque a placa à temperatura ambiente (RT), protegida da luz. Não descubra a placa antes da umidade na sala atingir 60-70%.

3. Programar a Nano-impressora

  1. Abra o software "Microarray Manager". Use a janela "Propriedades do método".
  2. Configure o layout da tabela de trabalho: escolha a "configuração do slide 56".
    NOTA: Esta é uma configuração predefinida que permite a impressão de 56 slides. Calibre para cada tipo de placa, pino e formato de impressão ( Figura 2 , passo 1).
  3. Selecione "Pin Configuration"| "Pin Tool 1x4 9 mm".
    NOTA: Esta é uma configuração predefinida para usar quatro pinos ( Figura 2 , etapa 2) suplementares .
  4. Defina o "tipo Pin". Calcule e crie o tipo de pino que é adequado para a impressão.
    NOTA: Esta etapa define quantos pontos um pino imprimir antes de re-imersão no poço da amostra 384 e deve ser otimizado para os diferentes tipos de pino e química da superfície deslizante.
    NOTA: Ao usar os pinos 946MP3, considere dois problemas importantes: 1) cada pino pode imprimir até 140 pontos homogêneos e 2) o pré-mancha é essencial para drenar o excesso de líquido da ponta do pino antes de imprimir nos slides. Portanto, programe cada pino para imprimir 20 pre-spots em um bloco de pré-impressão (otimizado para pinos de 946MP3 em slides revestidos com epóxi).
    1. Calcule o número total de manchas impressas por amostra.
      NOTA: Aqui, cada pino imprime 4 pontos por sub-matriz (bloco); Um total de 4 sub-arrays por slides = 16 spots / slIde. Após 7 slides, cada pin imprime 16 x 7 = 112 pontos. Além disso, 20 pré-manchas antes da impressão dão 132 pontos / mergulho. Portanto, o tipo de pino é definido como "946MP3-132 spots" (4 pontos por amostra por bloco x 4 blocos x 7 slides + 20 pré-pontos = 132).
    2. Crie o "tipo Pin" ( Figura 2 suplementar , passo 3). Pressione "Configuração" (painel esquerdo do software) | "Micro detecção Pins" | "Novo Nome" (pontos 946MP3-132). Defina o número de pontos por mergulho (132), o diâmetro do ponto (100 μm), a absorção (0,25 μL), a entrega (0,7 nL) e o espaçamento mínimo do ponto (100 μm). Pressione "OK" | "ESTÁ BEM."
    3. Na janela "Propriedades do método", selecione o tipo de pino criado: "946MP3-132 spots".
  5. Defina as condições de lavagem. Coloque o "Lavar antes de iniciar" e "Lavar após o acabamento" para "Lavagem normal" ( Figura 2 , etapa 4).
  6. Defina a "Lista de pratos".
    NOTA: Este é o padrão de amostragem da placa (a ordem dos mergulhos da placa de 384 poços) de acordo com o layout da placa. Para carregar a placa na lista de placas, configure um padrão de amostragem de placa.
    1. Crie a placa "Padrão de amostragem". Vá para "Modelos" ( Figura 3 suplementar ) | "Padrões de amostragem". Dê um novo nome ( por exemplo, matriz JoVE) e selecione "Inserir" | "Preencha a parte superior inferior" | "Pin Tool 1 x4 9 mm." Selecione a ordem dos coletores de poço de acordo com o layout da placa pré-definido ( Figura 1A ). Pressione "OK" | "ESTÁ BEM."
    2. Carregue o padrão de amostragem da placa. Clique no lado direito da célula "Lista de placas" ( Figura 3 suplementar ) | "Adicionar placa" e selecione o padrão de amostragem da placa correta (a "matriz JoVE" descrita no passo 3.6.1). Selecione "Lavagem normal". pressione"OK" | "ESTÁ BEM."
  7. Vá para as "Placas de amostra" e altere o deslocamento da posição para 1 (que determina onde a placa está localizada no deck do arrayer).
    NOTA: A posição de deslocamento de 0 está mais próxima do banho sonicador.
  8. Define o "Design de impressão de microarray". Calcule as distâncias de bloqueio a bloco e o espaçamento.
    1. Considere as dimensões da ferramenta de desenvolvimento que divide o slide em 16 poços de 7 x 7 mm, com espaços de 2 mm entre sub-arrays (um total de 9 mm entre blocos, Figura suplementar 4 ).
    2. Considere as dimensões da sub-matriz.
      NOTA: O espaçamento entre pontos é de 0,275 mm e há 12 colunas e 18 linhas neste design de impressão; As dimensões totais são: largura (11 x 0,275 mm = 3,025 mm) e altura (17 x 0,275 mm = 4,675 mm). Calcule o espaçamento horizontal: 9 mm - (11 0,275) = 5,97 mm. Calcule o espaçamento vertical: 9 mm - (17 x 0,275) = 4,325 mm. Calcule dDo lado esquerdo do slide: 4,43 mm + 1,07 mm = 5,5 mm. Calcule a distância do lado superior do slide: 2,95 mm + 0,55 mm = 3,5 mm ( Figura 4 suplementar ).
    3. Defina os "Projetos de impressão" ( Figura complementar 5 ). Selecione "Modelos" | "Projetos de impressão" | "Novo."
      1. Selecione "Pin Setup" | "Pin Tool 1 x 4 9 mm" | "Pin - 946MP3-132 spots". Na guia "Geral", altere o "Nome da Microarray Print" ( ou seja, "matriz JoVE"). Selecione "Velocidade do ponto" | "Número de réplicas" (4) | "Altura do ponto de toque" (0 mm) | "Altura Soft Touch" (3 mm) | "Imprimir em todas as posições disponíveis" ( Figura 5A suplementar ).
      2. Na guia "Microarray", escolha o espaçamento horizontal e vertical (5,9 mm e 4,325 mm da etapa 3.8.2) eo número de microarrays horizontais e verticais (2). Selecione "ImprimirMicroarray Horizontalmente "|" Imprimir Microarray Duplicado "( Figura 5B Suplementar ).
      3. Na guia sub-matriz, escolha o número máximo de colunas (12), o número máximo de linhas (18) e a distância entre as colunas e as linhas (275 μm) ( Figura 5C suplementar ).
      4. Na guia de medições, escolha a distância do lado esquerdo do slide (5,5 mm), a distância da parte superior do slide (3,5 mm, calculada no passo 3.8.2), a largura do slide de impressão (25 mm) E a altura do slide de impressão (75 mm) ( Figura 5D suplementar ). Pressione "OK" | "ESTÁ BEM."
  9. Clique no lado direito da célula "Microarray Print Designs" e selecione o design definido (a "matriz JoVE" da etapa 3.8.3, Figura 6 suplementar ).
  10. Defina a "Contagem de slides" (56) e altere a "Deslocação de posição" (0). Isso determina o poDo primeiro slide a ser impresso no deck do arrayer ( Figura 6 suplementar ).
  11. Define o "Projeto de pré-impressão de microarray" ( Figura 6 suplementar ). Selecione "Bloco de vidro" | "Pré-impressão 1 x 4 mm Pin ferramenta."
    NOTA: Esta configuração de espaçamento local permite 46.464 pré-manchas (para todos os 4 pinos) no bloco de vidro, assim 46.464 / 4 = 11.616 pré-pontos por pino. Quando o espaço no bloco de pré-impressão foi utilizado, a impressora irá parar e o bloco precisará ser virado.
    NOTA: Para calcular após quantas amostras o bloco de pré-impressão está cheio, considere o seguinte: cada amostra será tomada por 8 pingos na placa de 384 poços para completar 56 lâminas (7 lâminas por imersão) e cada mergulho Tem 20 pré-manchas adicionais, dando um total de 160 pré-manchas por amostra. Portanto, 11.616 / 160 = 72,6 amostras. Assim, o bloco de vidro de pré-impressão precisaria ser virado após 72 amostras (para avaliar o tempo de folga, medir hPor muito tempo, leva uma amostra para completar uma execução completa em 56 slides e, em seguida, multiplique por 72).
  12. Selecione "Use PrePrint Design" | "Sim" | "Scan Barcodes" (Não) | "Imprimir replicação única" (Não) ( Figura 6 suplementar ).
  13. Clique em "Validar" ( Figura 6 ).
  14. Clique em "Salvar" e salve o método como um arquivo arr ( por exemplo, "JoVE array.arr", Figura 6 suplementar ).

4. Impressão de Arrays projetados

NOTA: Todas as etapas devem ser realizadas em uma sala limpa com umidade de 60-70% e com luvas e roupas apropriadas para proteção

  1. Ligue a máquina de nano-impressora e o umidificador.
  2. Para o tampão de lavagem e humidificação, encha com água DI. Esvazie o frasco de lavagem (drenagem) e o carburador da armadilha de umidificação ( Figura 7A suplementar ).
  3. Coloque o umidificador para70% de umidade e começar a humidificação.
  4. Limpe todos os pinos antes de imprimir. Prepare 50 ml de solução de limpeza com ponta de ponta quente (65 ° C) (15 g de reagente de limpeza de ponta e 50 mL de água a 65 ° C, misturada até que o reagente sólido se dissolva completamente).
    1. Aplique a solução de limpeza em cada ponta do pino mergulhando a escova da ponta (fina) na solução de limpeza da ponta e escovando a superfície de cada ponta do pino.
      NOTA: A solução de limpeza de ponta é corrosiva e tóxica. Certifique-se de usar luvas e óculos de segurança em todos os momentos ao usar esta solução. Os pinos de imersão na solução de limpeza da ponta por mais de alguns minutos podem resultar em danos permanentes no pin.
    2. Encha o banho de ultra-sons com 1 L de água destilada e coloque os pinos em uma cremalheira de limpeza de pinos flutuante no banho. Sonicate por 5 min e remova os pinos. Deixe secar e esfregue suavemente com toalhetes especiais da sala limpa.
  5. Abra o "Microarray Manager" imprimirSoftware er; Após a conexão, a luz da impressora liga-se (vermelho / verde). Pressione "Parar" | "Limpar" | "Init" ( figura complementar 7B , etapas 1-3); O braço da cabeça de impressão irá redefinir os alinhamentos X, Y, Z.
  6. Para carregar os pinos na cabeça de impressão, pressione "Carregar" ( Figura 7B suplementar , etapa 4) e coloque os pinos no cabeçote de impressão de acordo com a configuração definida do layout da ferramenta de impressão / pino ( figura suplementar 7C ); Este layout usa 4 pinos, cada impressão de 4 sub-arrays em cada slide para obter o total de 16 sub-arrays por slide ( Figura 1A ). Depois de colocar os pinos, pressione "Init" novamente.
  7. Monte os slides no deck do arrayer. Abra a caixa deslizante e limpe cada lâmina soprando gás nitrogênio de ultra-alta pureza. Coloque o número desejado de slides na plataforma da matriz. Segure os slides com dois dedos nos cantos inferiores e, em seguida, coloque o slide em suaposição. Segure os dois cantos direitos e empurre os cantos esquerdos suavemente até que o slide fique bem na sua posição. Empurre suavemente para o canto inferior esquerdo para garantir um ajuste apertado ( Figura 7D suplementar ).
  8. Limpe o vidro pré-bloqueio com água destilada, 70% de etanol e 100% de etanol e deixe secar ao ar (use apenas toalhetes de sala limpa dedicados). Coloque o vidro pré-bloco na sua posição no convés.
  9. Preencha um banho sonicador ( Figura 7B suplementar ). Pressione em "Preencher" por 55 s e pressione "OK". Diminue o sonicador clicando em "Drenar" por 20 s e depois pressionando "OK". Repita o preenchimento e drenagem mais uma vez e depois preencha novamente por 55 s.
  10. Preencha o banho de lavagem ( Figura 7B suplementar ): pressione "Prime" por 40 s e depois pressione "OK".
  11. Posicione a placa de 384 poços com amostras alíquotas em sua localização no arrayer deck e remova a tampa parafilm.
  12. Inicie a impressão.
  13. Quando a impressão estiver completa, drene o banho do sonicador ( Figura 7B suplementar ) e desligue o umidificador.
  14. Deixe as lâminas secar no deck do arrayer por 16-24 h sem humidificação.
  15. Numerar os slides com uma caneta de marcação resistente ao álcool / solvente e armazená-los em uma caixa vazada no escuro.

5. Processando e desenvolvendo os arrays

  1. Retire um slide da caixa selada a vácuo e coloque-a em um capô químico por 5 min, matriz voltada para cima, para evaporar o excesso de líquido.
  2. Digitalize o slide com o maior ganho (950 PMT) para garantir que todos os pontos foram impressos.
  3. Proceda com o bloqueio químico de grupos epóxi no slide
    1. Preparar 50 mL de solução bloqueadora de etanolamina (Tris-HCl 0,1 M, pH 8 e etanolamina 0,05 M). Misture 140 mL de DIW com 8,8 mL de Tris-HCl (1,7 M, pH 8) e 0,45 mL de etanolamina (16,6 M). Transferir para um 5Tubo de coloração de 0 mL ( Figura 8A ) e aquecer até 50 ° C.
    2. Hidrate o slide. Coloque o slide em um tubo de coloração cheio de DIW, cubra-o com papel alumínio e incube durante 5 min com agitação suave e lenta à temperatura ambiente.
    3. Bloqueie os grupos de epoxi reativos no slide. Mergulhe a corrediça no tubo de coloração de 50 ml preenchido com solução pré-aquecida de bloqueio de etanolamina, cubra com papel alumínio e incube durante 30 minutos com agitação suave e lenta à temperatura ambiente.
    4. Descarte a solução de bloqueio de etanolamina no recipiente de lixo biológico apropriado e coloque a corrediça em um novo tubo de coloração limpo, cheio com 50 ° C de DIW. Cubra com papel alumínio e incube durante 10 minutos com agitação suave e lenta à temperatura ambiente.
    5. Descarte a água e transfira as lâminas para um suporte de coloração de vidro ( Figura 8B suplementar ). Coloque o suporte de coloração de vidro em um suporte de placa de balanço e centrifugar secar o slide por 5 min a 200 xg e RT.
  4. Configure um divisor e continue com o bloqueio biológico.
    1. Coloque o slide sobre um divisor de 16 poços ( Figura 8C suplementar ).
    2. Preparar solução de lavagem de PBST: 50 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,4 + 0,1% de Tween-20.
    3. Preparar solução de bloqueio biológico (PBS-OVA): 5 mL de PBS, pH 7,4 + 1% de ovalbumina de frango (10 mg / mL).
      NOTA: A escolha do reagente de bloqueio é fundamental para o sucesso da detecção de anticorpos anti-Neu5Gc. A ovalbumina é feita em galinhas que, como os humanos, não conseguem sintetizar Neu5Gc, causando uma falta de expressão desse Sia. Para a detecção de Neu5Gc, mesmo os menores contaminantes podem reduzir drasticamente a sensibilidade do ensaio, às vezes até não detectar qualquer reatividade anti-Neu5Gc. Por exemplo, o reagente de bloqueio mais utilizado, a albumina de soro bovino (BSA), embora não glicosilado por si só, contém contaminantes de IgG bovinos que carregam porções Neu5Gc e, portanto, competem wCom glicanos impressos quando se liga à amostra com anticorpos anti-Neu5Gc 19 , 20 .
    4. Prewet os poços. Usando uma multi-pipeta, alíquotas 200 μL de PBST nos poços deslizantes, coloque-os em uma câmara úmida coberta e agite durante 5 min.
      NOTA: A câmara de umidade é uma bandeja de vidro com um papel de toalha molhado, coberto com papel de nylon e papel alumínio para proteger as amostras da luz.
    5. Remova o PBST, acendendo e tocando suavemente sobre uma toalha de papel limpa e uma alíquota de 200 μL de tampão de bloqueio de PBS-OVA em cada poço. Coloque em uma câmara úmida e incube durante 1 h à temperatura ambiente com agitação suave.
  5. Prepare a detecção primária diluída no tampão de bloqueio de PBS-OVA, conforme listado na Tabela 2 .
    NOTA: Para avaliação de controle de qualidade (QC) deste microarray de sialoglicano, use várias proteínas de ligação de Sia: a lectina Sambucus nigra (SNA), isolada da casca de sabugueiro, deve reconhecer a Sia &# 945; 26; Maackia Amurensis Lectin II (MALII) deve reconhecer Siaα23; E anti-Neu5Gc IgY de frango é esperado reconhecer todos os sialoglicanos contendo Neu5Gc. Além disso, use várias amostras de soros humanos para perfil de resposta anti-Neu5Gc IgG. A concentração de lectinas / anticorpos / soros deve ser calibrada experimentalmente.
  6. Tire o tampão de bloqueio PBS-OVA seco e adicione 200 μL de anticorpo primário por poço (volume mínimo por poço: 70 μL), incube em uma câmara úmida durante 2 h.
  7. Desligue a detecção primária e lave 4 vezes com PBST (entre a 3ª e a 4ª lavagem, incube a corrediça no PBST durante 5 min na câmara úmida). Lave uma vez com PBS.
  8. Prepare o anticorpo secundário em PBS, conforme listado na Tabela 2 .
  9. Seque o PBS e adicione 200 μL de anticorpo secundário. Incubar durante 1 h à RT com agitação.
  10. Seque o anticorpo secundário e lave quatro vezes com PBST (entre os 3Rd e 4ª lavagem, incubar a corrediça no PBST durante 5 minutos na câmara úmida).
  11. Retire cuidadosamente o quadro e coloque os slides em um tubo de coloração de deslizamento de 50 mL preenchido com PBS e agite durante 5 min.
  12. Encha dois banhos de limpeza de lâminas ( Figura 8D suplementar ) com DIW, coloque o slide no porta deslizante e mergulhe-o dentro do banho. Diminua rapidamente 10 vezes e depois transfira para o segundo banho e mergulhe mais 10 vezes. Incube durante 10 minutos à RT com agitação.
  13. Descarte a água e transfira a corrediça para um suporte de coloração de vidro ( Figura 8B suplementar , deixe a corrediça secar ao ar). Coloque o suporte de coloração de vidro em um suporte de placa de balanço e centrifugue a secagem do slide durante 5 min a 200 g e RT.
  14. Digitalize o slide e depois guarde-o em uma caixa vazia no escuro.

6. Análise de Array e Análise de Dados

  1. Abra o scanner deslizante fluorescente e deixe aquecer durante 5 min. Abra oDigitalização e análise de software.
  2. Defina os parâmetros de varredura ( Figura 9A ): escaneie a 532 nm e 100% de potência com um ganho de 350 PMT, com uma linha a média e uma posição de foco de 0 μm. Use uma resolução de tamanho de pixel de 10,0 μm.
    NOTA: Os parâmetros de digitalização podem ser ajustados para diferentes tipos de slide, fluorescência e resolução.
  3. Digitalize o slide desenvolvido. Abra a porta do scanner e coloque o slide dentro, matriz voltada para baixo. Comece a digitalizar (botão verde "Reproduzir" no menu do painel de navegação do software, Figura suplementar 9B ).
  4. Salve os slides digitalizados como um arquivo tiff.
  5. Prepare slide para análise. Selecione "Carregar lista de matriz" e faça o upload do arquivo GAL apropriado que mapeia os arrays em cada bloco no slide ( Figura 9C suplementar ).
    NOTA: O arquivo GAL contém informações sobre a identidade e localização (X, Y) de cada ponto no slide. Este arquivo pode ser criadoPelo software da impressora exportando um arquivo de texto delimitado por tabulação com base em identidades de amostras na placa de fonte de 384 poços e no design de impressão definido.
  6. Defina os parâmetros de alinhamento e análise. Pressione o botão "Opção" no menu do painel de navegação do software ( Figura complementar 10 ).
  7. Defina os parâmetros de alinhamento. Encontre recursos circulares, redimensione os recursos durante o alinhamento em 50 - 350%, limite o movimento do recurso para uma tradução máxima de 40 μm, recursos não flacidez que falham o limite de fundo (limiar de CPI 0), estimar o envolvimento e a rotação ao encontrar blocos e automatizar o registro de imagens (10 pixels) ( Figura complementar 10 ).
  8. Defina os parâmetros de análise: relação W1 / 532, desvio padrão normal, análise de recursos ausentes e subtração de fundo. Clique em "selecionar" e depois em "Fundo local de fundo médio" e defina 2 pixels para excluir e uma largura de fundo de 3 pixels. Pressione OK." SeT o nível de saturação do scanner para o padrão ( Figura complementar 10 ).
    NOTA: O método de subtração de fundo depende do design experimental e pode ser modificado de acordo com as necessidades específicas.
  9. Alinhe os mapas de recursos. Configure o programa no modo de bloco (pressione "B"), selecione todos os blocos (Ctrl + A), posicione as grelhas do mapa da matriz e alinhe todos os blocos (Alt + Shift + F7) ( Figura 11 ).
  10. Refinar o alinhamento de recursos em cada bloco. Zoom (pressione "Z" para entrar no modo de zoom) no bloco superior esquerdo, pressione novamente "B" (modo bloco) e pressione a grade deste bloco. Mova apenas a grade deste bloco até que ele alinhe perfeitamente com os pontos do bloco e pressione F5 para alinhar os recursos neste bloco selecionado. Repita o movimento da grade e o alinhamento F5 até que os pontos estejam perfeitamente circundados. Faça o mesmo por cada um dos 16 blocos até que todas as redes estejam no lugar.
  11. Analise e salve os dados. Selecione todos os blocos (Crtl +A) e depois analise os dados (Alt + A). Salve os resultados da análise (Ctrl + U) como um arquivo .gpr.
  12. Abra o arquivo .gpr salvo em um programa de planilha e analise a intensidade de cada ponto com base na fluorescência após a subtração de fundo local (F532-B532).

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Resultados

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Array Printing, Development and Analysis:

A impressão de um microarray de sialoglicano com múltiplas amostras de glicano e curvas de IgG STD humanas em 16 blocos diferentes requer uma calibração completa para garantir que todas as amostras sejam impressas o mais uniformemente possível em todos os 16 blocos por slide e para todos os slides na mesma execução de impressão. Portanto, são necessários vários experimentos de calibração ...

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Discussão

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Uma fabricação de microarrays de glicano bem-sucedida requer um planejamento cuidadoso e inclui várias etapas importantes no protocolo. Estes incluem: (1) planejar os layouts de blocos e placas que definem todos os parâmetros subseqüentes ( por exemplo, distâncias, espaçamento, quantidade de amostras e impressão); (2) limpar os pinos e garantir a integridade do pino, o que é crítico para controlar a homogeneidade do ponto; (3) mantendo alta umidade durante a impressão, crítica para evitar a evaporação da amostr...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado, em parte, por um Prêmio de Pesquisa de Desenvolvimento de Carreira do Israel Cancer Research Fund, uma concessão da Iniciativa Nacional de Nanotecnologia de Israel e Helmsley Charitable Trust para uma Área de Tecnologia Focal em Nanomedicines para Teranostics Personalizados (VP-K) e National Institutos de saúde concedem R01GM076360 (para XC).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Amina primária contendo sialoglycansGlycohub, Inc., Davis, CA, EUA (http://www.glycohub.com/services)Entre em contato info@glycohubusa.com para solicitações de compostosGlicanos impressos
Fosfato monossódico monohidratadoSigmaS9638Componente tampão de impressão
Fosfato dissódico heptahidratadoSigmaS9390Componente tampão de impressão
Fosfato solução salina tamponadaHy-LabsBP-507/500DTampão de impressão/incubação/tampão de lavagem
Tris-baseSigmaT1503Reagente bloqueador de lâminas
GlicerolSigma G-7893Componente tampão de impressão
EtanolaminaThermo-Fisher Scientific0700/08Reagente bloqueador de lâminas
Ovalbumina (Grau V)SigmaA5503Proteína de bloqueio de slides
Tween-20SigmaP7949Detergente de lavagem deslizante
Alexa 555-HydrazideThermo-Fisher ScientificA20501MPMarcador na matriz
ChromPure Human IgG, molécula inteiraJackson Immunoresearch009-000-003Componente de impressão
Biotinilado- SNAVector LaboratoriesB-1305Lectina vegetal – ligação Sia-alpha2– 6-linked
Biotinylated-MALIIVector LaboratoriesB-1265Plant Lectin – binding Sia-alpha2– 3-linked
Chicken-anti Neu5Gc IgYBioLegend146903Detecção primária
Cy3-StreptavidinJackson Immunoresearch016-160-0848Ligação à biotina
Cy3-anti Human IgGJackson Immunoresearch109-165-088Detecção secundária contra IgG humano
Cy3-anti Chicken IgYJackson Immunoresearch703-165-155Secundário detecção contra amostras de soro humano IgY de frango
Banco deisraelense Detecção primária
Nitrogênio comprimido (Grau 5)Ferramenta geral de espanagem/secagem
Lâminas revestidas com epóxiCorning40044Lâminas
Revestidas com epóxiPolyAn2D 104-00-221Slides. Neste tipo de lâminas, a superfície é mais hidrofóbica (em comparação com as lâminas de retirada do núcleo), portanto, o tampão de impressão de glicanos precisaria ser complementado com 0,005% de Tween-20 para obter 100 µ Manchas de tamanho M.
Placa de microtitulação de 384 poçosGenetix2070Placa de impressão
Marcador de laboratório VWRVWR52877-310Etiquetagem de lâminas
Matriz de tubos de coloraçãoMSTFerramenta de revelação de lâminas
Banho de coloraçãoVWR25608-904Ferramenta de revelação de lâminas
Suportes de vidro de lâminasVWR631-9321Ferramenta
de revelação de lâminasGenePix ScannerDispositivos moleculares4000BScanner de slides
LM-60 NanoPrinterArrayItLM-60Array impressora
PinsArrayIt946MP3Pinos de impressão
ProPlate ModuleGrace Bio-LabsP37004Módulo de desenvolvimento de slides
Água destiladaBio-Lab2321020500Necessário para arrayer e umidificador
Multi Pippete eletrônico, 8 canais, faixa de volume 2-125 μ LThermo-Fisher Scientific (Matrix)MA-2131 Impact2 Equalizer 384Multi pippete para descarte de amostras em placa de 384 poços
sangue

Referências

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