Het kanaal Excretory C. elegans als een Model voor de intracellulaire Lumen genuitdrukking en In Vivo gepolariseerde biogenese van organellen in één cel: labelen door GFP-fusies, RNAi interactie scherm en beeldvorming

Summary

Het uitscheidingsmechanisme kanaal van C. elegans is een uniek eencellige model voor de visuele in vivo analyse van biogenese van DOVO gepolariseerd. Dit protocol beschrijft een combinatie van standaard genetische/RNAi en imaging benaderingen, aanpasbaar voor de identificatie en karakterisering van moleculen eencellige tubulogenesis en apicale membraan en lumen biogenese regisseren.

Abstract

De vier C. elegans uitscheidingsmechanisme grachten zijn smalle buizen uitgebreid door de lengte van het dier uit een enkele cel, met bijna even veel uitgebreide intracellulaire endotubes die bouwen en stabiliseren de lumen met een membraan en submembraneous cytoskelet apicale karakter. De uitscheidingsmechanisme cel breidt haar lengte ongeveer 2.000 keer voor het genereren van deze kanalen, waardoor dit model unieke Voordebeoordeling in vivo van DOVO gepolariseerde biogenese, intracellulaire lumen genuitdrukking en eencellige tubulogenesis. Het hier gepresenteerde protocol laat zien hoe te combineren standaard labelen, winst - en verlies-van-functie genetische of RNA-interferentie (RNAi)-, en microscopische benaderingen gebruiken dit model om te ontleden visueel en functioneel het analyseren van deze processen op een moleculair niveau. Als een voorbeeld van een aanpak van labeling schetst het protocol de generatie transgene dieren met fluorescerende fusion eiwitten voor live analyse van tubulogenesis. Als een voorbeeld van een genetische benadering wijst zij op belangrijke punten van een visuele RNAi gebaseerde interactie scherm ontworpen om te wijzigen van een winst-of-function cystic kanaal fenotype. Zijn er de specifieke methoden beschreven hoe: label en visualiseren van de grachten met het uitspreken van fluorescente proteïnen; bouwen van een gerichte RNAi bibliotheek en strategize RNAi screening voor de moleculaire analyse van kanaal morfogenese; visueel beoordelen van wijzigingen van kanaal fenotypen; Score van hen door de ontrafeling van de fluorescentie microscopie; karakteriseren subcellular kanaal onderdelen met een hogere resolutie van de confocal microscopie; en kwantificeren van de visuele parameters. De aanpak is handig voor de onderzoeker die geïnteresseerd is in het voordeel halen van het uitscheidingsmechanisme C. elegans -kanaal voor de identificatie en karakterisering van genen die betrokken zijn bij de fylogenetisch geconserveerde processen van intracellulaire lumen en eencellige buis morfogenese.

Introduction

Alle interne organen zijn samengesteld uit buizen, cruciaal zijn voor hun vele verschillende functies, zoals het vervoer, de uitwisseling van gassen, vloeistoffen en voedingsstoffen en de uitscheiding van metabolische afval. Hun gepolariseerde karakter, met duidelijke apicale en lumenal membranen, is aangepast aan deze specifieke functies, en gebreken in de biogenese van hun systemen voor endo- en plasmamembraan zijn een frequente oorzaak van ziekten bij de mens^1,2. De meerderheid van de buizen van de therapieën en inwendige organen zijn meercellig en vormen een lumen intercellularly; echter, eencellige buizen, die het lumen intracellulair vormen, kunnen, bijvoorbeeld, zo veel als 30-50% van de menselijke capillair bedden²vertegenwoordigen. De gepolariseerde membranen van multi- en eencellige buizen zijn qua samenstelling, hoewel hun microdomains op basis van de specifieke functie van de buis (bijv., uitscheidingsmechanisme kanaal canaliculi versus intestinale microvilli in Caenorhabditis verschillen kunnen elegans; Zie bijbehorende papier op C. elegans intestinale tubulogenesis)³. Bewaring van de beginselen van biogenese van gepolariseerde en tubulogenesis worden toegepast onder metazoans, en een soortgelijk moleculaire machines dirigeert ze^1,2,4.

Het uitscheidingsmechanisme systeem van C. elegans bestaat uit vijf cellen: de uitscheidingsmechanisme-cel (EG), koker cel (DC), porie cel (PC) en twee cellen van de klier. Ablatie van de EG, DC of PC zorgt ervoor dat vocht ophoping in de lichaamsholte en het sterven van de dieren op een vroege larvale stadium⁵. Intrigerend, deze drie eencellige buizen maken hun lumen op drie verschillende manieren: door cel uitholling (EG); cel inwikkeling in combinatie met autocellular junction vorming (PC); en door cel inwikkeling in combinatie met autofusion (DC); verschillende mechanismen van lumen morfogenese die alle fylogenetisch geconserveerde^6,7. De EG, gelegen aan de linker laterale kant van de posterieure faryngaal lamp, stuurt twee zijdelingse extensies uit die de vier grachten uit te breiden anteriorly tak en posteriorly (aan de rechter en linker kant) naar het uiteinde van de van de worm neus en staart , respectievelijk (Figuur 1)^5,6,8. De EG strekt zich uit van ongeveer 1 µm tot 2 x 1.000 µm, waardoor het de grootste cel van het dier. Op een subcellular niveau is het uitscheidingsmechanisme kanaal een eenvoudige buis, gegenereerd op basis van een basale membraan gericht op de pseudocoelom en tunnel door een lumenal membraan (endotube). Het kanaal lumenal membraan verbindt aan de buis lumenal membraan zijn alleen intercellulaire afslag; de grachten zijn anders junctionless langs hun lengte (Figuur 1). Het uitscheidingsmechanisme kanaal lumenal membraan en haar submembraneous cytoskelet zijn apicaal, gedefinieerd door hun moleculaire compositie die lijkt op de samenstelling van de apicale membraan en submembraneous cytoskelet van meercellige buizen, zoals de darm, en van andere epitheel (bijvoorbeeldplat). Cytoplasmatische organellen, met inbegrip van endosomal vesiculaire en andere (bijvoorbeeldGolgi) endomembranes zich langs de lengte van het kanaal bevinden. Daarnaast zijn meerdere canalicular blaasjes - verbonden met het lumenal membraan, en/of onderling verbonden of geïsoleerd - threaded via het kanaal cytoplasma^7,8,9,10 . Deze dynamische plasma-membraan/canalicular verbinding verder van het kanaal membraan systeem breidt en draagt bij aan beide lumen genuitdrukking en osmoregulatie¹⁰. Het uitscheidingsmechanisme kanaal bestaat dus bijna volledig van endo- en plasma membranen, bieden een uitstekend model voor de analyse van gepolariseerde biogenese en de regulering van de endo-aan plasmamembraan interface. De dramatische uitbreiding van de apicale membraan tijdens kanaal morfogenese - in dit samenvallen met lumen extensie – eencellige-systeem maakt het ook mogelijk om te analyseren de architecturale problemen die ontstaan door de noodzaak te stabiliseren en centreren van een intracellulaire lumenal membraan . Dit protocol is gericht op de analyse van de kanaal buis van en lumen van structurele genuitdrukking en de dynamiek van de intracellulaire membraan vereist voor dit proces in plaats van op de signalen die direct van de bewegingen van de cel die het genereren van de EG positie in de uitscheidingsmechanisme systeem en de ingewikkelde verbindingen met andere cellulaire elementen (herzien in⁶) op te bouwen.

Een ander voordeel van de C. elegans eencellige kanaal systeem voor de analyse van gepolariseerde membraan en intracellulaire lumen biogenese is haar vermogen om te scheiden, door de ontwikkelings tijd, de generatie van verschillende onderdelen van de membranen en kruispunten. De EG is geboren op het moment van sluiting van de ventrale en regelt ventro-lateraal van de keelholte tijdens mid embryogenese^5,6,8, waarin verlenging van de laterale kanaal en vertakking voordoet. Dit wordt gevolgd door anterior-posterior kanaal extensie tijdens late embryogenese, een proces dat in de L1-larvale stadium (Figuur 1 blijft). In een onlangs uitgekomen larve, de tip van achterste kanaal bereikt ongeveer het midden van de worm, samen met de worm⁸volledig uit te breiden tot de staart aan het einde van de etappe van L1, waarna het kanaal kieuwopeningenvorm. Actieve kanaal groei op een maximumsnelheid van meer dan die van de groei van het dier dus eindigt bij het eerste larvale stadium, echter, verdere groei gebeurt parallel met de groei van het hele dier tijdens de extra larvale stadia (L2-4). Deze instelling biedt de mogelijkheid om te analyseren verschillende stappen van DOVO gepolariseerde biogenese onafhankelijk van gepolariseerde celdeling of migratie. Bovendien, het maakt het mogelijk de scheiding van dit proces van de vergadering van kruispunten (die voorkomen in het embryo voordat lumen Inleiding); hun exacte behoefte in membraan polarisatie is nog steeds een open vraag op het gebied van de polariteit. Ten slotte, het unieke scheidt apicale van basale membraan expansie, het laatste proces voorafgaat aan de voormalige in de uitscheidingsmechanisme grachten¹⁰. De C. elegans uitscheidingsmechanisme kanaal model is dan ook een bijzonder informatief aanvulling op de intestinale model dat deelt een aantal van deze voordelen voor de analyse van gepolariseerde biogenese maar wordt het uitgevoerd in een meercellig instelling (Zie het begeleidende document op intestinale tubulogenesis³).

Hoewel wild-type kanalen uiterst dunne buisjes in deze kleine worm zijn, kunnen hun lumen visualized direct door Nomarski optica in dit transparante dier. Mutant cystic kanaal morphologies kunnen in feite worden gekarakteriseerd in labelloze dieren met behulp van lage vergroting ontrafeling van microscopie, die te groot effect in voorwaartse genetische schermen is gebruikt om genen die betrokken zijn bij tubulogenesis¹¹te identificeren. Verbeterde visualisatie van de morfologie van grachten en onderscheid van hun gepolariseerde membranen, cytoskeletal onderdelen, verschillende intracellulaire organellen en andere subcellular structuren, echter, vereist labeling en hoger macht TL ontleden en confocal microscopie. Hoewel de grachten fijne structuur een aantal moeilijkheden voor het benoemen en microscopie vormt, membranen en subcellular onderdelen via de specifieke moleculen die uniek zijn voor elk compartiment kunnen worden onderscheiden, en dieren kunnen worden veilig gemonteerd voor microscopie als bepaalde voorzorgsmaatregelen worden genomen om te voorkomen dat de invoering van artefacten (Zie Protocol en discussie). Etikettering kan worden gedaan door immunohistochemistry in vaste specimens, of door het genereren van transgene wormen uiting van fluorescerende fusion eiwitten onder de controle van hun eigen of uitscheidingsmechanisme kanaal-specifieke initiatiefnemers voor in vivo imaging. Dit protocol beschrijft de laatste labeling techniek (Zie het begeleidende document op intestinale tubulogenesis voor antilichaam³kleuring).

De mogelijkheid om te combineren in vivo - of winst-van-verliesfunctie studies met in vivo imaging analyse op de eencellige niveau in de gehele ontwikkeling maakt het uitscheidingsmechanisme kanaal van C. elegans een bijzonder sterke model voor de moleculaire en cellulaire analyse van eencellige tubulogenesis. Forward of reverse genetische schermen kunnen worden uitgevoerd vanaf een wild-type of gelabelde transgene dieren te identificeren kanaal morfogenese fenotypen (bijvoorbeeld cysten) en hun onderliggende genetische defecten. Als alternatief, dergelijke schermen kunnen beginnen met een mutant fenotype (bijvoorbeeld, een cystic kanaal) en identificeren van suppressors of versterkers van dit fenotype ter identificatie van genen die functioneel interactie met de gen veroorzaakt het mutant fenotype. Het genetische gebrek dat veroorzaakt het mutant fenotype een verlies (bijvoorbeeld, via de schrapping van de gene) of een winst kan veroorzaken (bijvoorbeeld via een activerend mutatie of via de invoering van overtollige gene kopieën) van de onderzochte functie. Voorwaartse mutagenese of systematische RNAi schermen zijn zonder vooroordelen op genfunctie en toestaan dat de onbevooroordeelde identificatie van genen die betrokken zijn in de functie van belang. Gezien de beschikbaarheid van genoom-brede RNAi voederen van Bibliotheken, kan bijna elk gen worden gemakkelijk neergeslagen door RNAi in C. elegans, zodanig dat enkel gen van belang of een andere groep van genen (bijvoorbeeldin gerichte schermen) kan ook worden snel gesondeerd voor hun effect in de benadering van een omgekeerde genetica. Om aan te tonen een mogelijke combinatie van benaderingen, hier beschrijven we een gerichte RNAi interactie scherm, beginnend met een winst-of-function cystic uitscheidingsmechanisme kanaal mutant, aangeduid met de cytoplasmatische kanaal groen fluorescente proteïne (GFP). De mutant fenotype werd gegenereerd door overexpressie van erm-1, een zeer geconserveerde C. elegans ortholog uit de linker membraan-actine Ezrin-Radixin-Moesin (ERM), die is betrokken bij lumen genuitdrukking en membraan organisatie in vele soorten¹². C. elegans ERM-1 lokaliseert te lumenal membranen van inwendige organen, zoals de uitscheidingsmechanisme kanaal en de darm, en is vereist voor lumen vorming in beide¹³. ERM-1 overexpressie werft overtollige actine en blaasjes aan de gracht lumenal membraan, verhoging van de flux in de lumen en het genereren van een kort cystic kanaal en een gekruld lumenal membraan met verdikte actine ondervacht⁹. Het protocol wordt beschreven hoe u voor het genereren van transgene variëteiten met uitscheidingsmechanisme-kanaal-uitgedrukt label fusion eiwitten (of andere eiwitten); het uitvoeren van gerichte RNAi schermen beginnen met dergelijke stammen, te identificeren van de parameters van het fenotype van een kanaal; en hoe te visueel analyseren de resultaten van dergelijke schermen door fluorescentie ontleden en confocal microscopie, met inbegrip van eenvoudige manieren om te kwantificeren informatieve tubulogenesis fenotypen. Alternatief labeling technieken en de details van RNAi, aangepast aan de vaak dodelijke tubulogenesis genen, kan worden gevonden in het begeleidende document op intestinale tubulogenesis³. Alle methoden kunnen worden gebruikt in verschillende combinaties voor het onderzoek van andere vragen over kanaal tubulogenesis.

Protocol

1. het C. elegans Excretory kanaal labeling door fluorescerende Fusion eiwitten ¹⁴

Opmerking: Zie het begeleidende document op intestinale tubulogenesis ³ voor het labelen door in situ antilichaam kleuring procedures aan te passen aan het uitscheidingsmechanisme kanaal. Zie tabel 1 voor voorbeelden van moleculen bewezen nuttig voor het visualiseren van C. elegans uitscheidingsmechanisme kanaal endo- en plasma membranen, tabel 2 voor voorbeelden van expressie rijden naar het uitscheidingsmechanisme kanaal, initiatiefnemers en Tabel 3 voor middelen voor meer uitgebreide collecties van markeringen en initiatiefnemers, met inbegrip van verwijzingen bespreken de selectie van verschillende fluorophores.

1. Bouw van weefsel specifieke fluorescerende marker plasmiden door restrictie-enzym gebaseerd klonen ¹⁵
   Opmerking: Zie de discussie voor alternatieve technieken van de bouw fluorescerende fusie-eiwitten.
   1. Bepalen dat u de volgorde van de promotor (voor transcriptionele fusies) of van het hele gen van belang met haar promotor (voor translationeel fusies) in het WormBase ⁴⁴.
      Opmerking: voor de initiatiefnemers, ongeveer 1 – 3 kilobase (kb) is voldoende voor de meeste C. elegans genen. Translationeel fusion eiwitten kunnen ook worden geconstrueerd door het plaatsen van een gen van belang onder een specifieke promotor van uitscheidingsmechanisme kanaal (Zie tabel 2).
   2. Ontwerpen voorwaartse en omgekeerde inleidingen voor versterking van de promotor (voor transcriptionele fusies) en/of een volledige gen met promotor (voor translationeel fusies). Restrictie-enzym linkers toevoegen op de 5 ’ en 3 ’ einden van de inleidingen.
      Opmerking: Kies de enzymen van de beperking die aanwezig in de vector plasmide (bijvoorbeeld, pPD95.79) ^{16 zijn}. Voor translationeel fusies, de 3 ’ linker moet zo zijn ontworpen dat na de spijsvertering van het beperkingsenzym en Afbinding met de vector, het invoegen codon frame continu met de codonen van de fluorophore, bijvoorbeeld, GFP zullen. Een wellicht 1 of 2 meer honken toevoegen aan de typische restrictie-enzym linkers ¹⁴; Wees voorzichtig niet te maken van een stop codon.
   3. Uitvoeren polymerase-kettingreactie (PCR) om aan te vullen van de promotor of full-length gen met behulp van levende wormen of wild-type genomic DNA of cDNA als sjabloon ¹⁵.
      Opmerking: Bij gebruik van wormen als sjabloon, lyse eerst wormen van lysis buffer (PCR-buffer plus proteïnase K) ¹⁷. Gemengde fase wormen kunnen worden gebruikt als sjabloon. Uitgehongerd wormen kunnen worden gebruikt om te voorkomen dat besmetting met bacteriële DNA.
   4. Uitvoeren agarose (1%) gel electroforese van PCR producten te identificeren van de juiste grootte van versterkte product.
      Opmerking: Als band maat juist is, gaat u verder met de volgende stap. Als meerdere banden worden gegenereerd, te verbeteren versterking voor de productie van één band. Als dit niet werkt, knip de juiste band uit de gel zuiveren van DNA door standaardmethoden ¹⁵ en ga vervolgens verder met de volgende stap.
   5. Uitvoeren beperking digest op het PCR product en de vector-plasmide dat de fluorophore (bijvoorbeeld, pPD95.79) in afzonderlijke buizen door standaardmethoden ^{15 bevat}.
   6. Scheiden van de ANI van het verteerd door gelelektroforese en elueer het PCR product en vector DNA bands in afzonderlijke buizen.
   7. Zuiveren de ANI van gel segmenten door standaardmethoden ¹⁵. Meten van DNA concentratie door spectrofotometer.
   8. Afbinden van het PCR product en vector DNA door standaardmethoden en transformeren van de recombinante ANI in bevoegde cellen met standaardmethoden ¹⁵.
   9. Verspreid 10 μL, 50 μl en 100 μl van de getransformeerde cellen op drie afzonderlijke Luria Bouillon (LB) platen aangevuld met 50 μg/mL ampicilline.
      Opmerking: Verspreid verschillende hoeveelheden cellen op verschillende platen voor een spectrum van transformatie efficiencyverbeteringen. Bijvoorbeeld ook dichtbevolkte plating niet mogelijk is de isolatie van de kolonies als transformatie efficiënt is.
   10. Incubeer de platen bij 37 ° C's nachts. Volgende ochtend nemen de platen uit de incubator.
       Opmerking: Als de kolonies zeer klein zijn, Incubeer gedurende verscheidene meer uren.
   11. Voorbereiden plasmide ANI van één kolonies met standaardmethoden ¹⁵. Meng sjabloon DNA en inleidingen en afgeven voor het rangschikken (meestal uitgevoerd in een core servicecenter).
   12. Lezen van de sequenties en verifiëren van de integriteit van de constructie van de fusie.
       Opmerking: kritische: bevestigen de juiste codon frame tussen ingevoegde gen en fluorescerende marker gene voor vertaling fusies. Ideaal, het volgnummer van het hele gen om te bevestigen dat geen mutatie werd geïntroduceerd tijdens de PCR en Afbinding procedures.
   13. Genereren meer plasmide DNA (met behulp van stap 1.1.11) voor injectie voor stap 1.2.
2. Generatie transgene dieren door microinjection van DNA voor germline transformatie ¹⁸
   Opmerking: Zie de discussie voor alternatieve technieken voor de invoering van transgenen. De geschetste procedures kunnen worden gebruikt voor het genereren van transgene dieren die een fusieproteïne fluorescentie of elke andere proteïne van belang dragen. Bijvoorbeeld, kan een exogene eiwit nieuw geïntroduceerde (bijvoorbeeld een heteroloog ortholog) of een endogene eiwit kan worden (bijvoorbeeld in de overeenkomstige germline mutant voor redding) weer binnengebracht of overexpressie voor het genereren van een fenotype (bijvoorbeeld injectie voor erm-1 werd gebruikt voor het genereren van de overexpressie cystic kanaal fenotype dat als de doelstelling voor wijziging fungeert door het RNAi interactie scherm hieronder beschreven).
   1. Mix construct DNA (1 – 50 ng/μl) met marker plasmide DNA (meestal 100 ng/μl), bijvoorbeeld de dominante marker rol-6 (su1006) (zie 1.2.3 voor markeringsopties).
      Opmerking: kritische: concentratie van ingespoten DNA empirisch moet worden bepaald om te voorkomen dat invoering van artefactual fenotypen (extensie gebreken, cysten, letaliteit) als uiting van genen in de uitscheidingsmechanisme grachten die bijzonder zijn gevoelig voor de expressie van transgenen. Men kan, bijvoorbeeld, maken verschillende mengsels van plasmiden in concentraties van 1 ng/μl, 10 ng/μl, 50 ng/l en 100 ng/μL met 100 ng/μL rol-6(su1006) voor het testen van een aantal uiteenlopende concentraties voor de generatie van een levensvatbare stam met de gewenste expressie of fenotype (hoge concentraties zijn waarschijnlijk niet-specifiek toxisch voor kanaal genuitdrukking en mogelijk dodelijke).
   2. Filtreer het DNA mengsel door een 0,22-μm (micrometer) porie grootte spin-x centrifuge buis filter.
      Opmerking: Niet verlaten het deksel van de buis open om te voorkomen dat stof die de naalden van microinjection blokkeren kan.
   3. Microinject recombinante plasmiden in de gonaden van wild-type of mutant wormen door standaardmethoden voor germline transformatie (zie referentie ¹⁸ voor details van de procedure).
      Opmerking: Standaard marker plasmiden zijn, bijvoorbeeld: rol-6(su1006), dpy-20, unc-119, pha-1. Dominante transgenen als rol-6(su1006) worden ingevoerd in wild type wormen, overwegende dat redden transgenen in hun respectieve mutanten worden binnengebracht. Marker plasmiden zijn mede ingespoten voor eenvoudig onderhoud van de transgene lijnen omdat extrachromosomal transgenen willekeurig verloren tijdens de celdeling (zie 1.2.8). Bij het injecteren van genen coderend voor fusies van fluorophore, kan men ook gebruiken de fluorophore, GFP, zelf als marker. rol-6 induceert wormen te rollen rond zelf die vaak voordelig zijn voor de evaluatie van de morfogenese fenotypen.
   4. Overdracht geïnjecteerd wormen op Escherichia coli ontpit Nematode groei Medium (NGM) platen (bijv., 5 wormen/plaat) (zie verwijzing ¹⁹ voor standaard C. elegans cultuur-en onderhoudsprocedures en Tabel van materialen).
   5. Incubeer de platen en laat ontwikkelen bij 20 ° C gedurende ongeveer 3 nakomelingen overleden
   6. Onderzoeken van de nakomelingen van de F1 onder de ontleden Microscoop voor Rol (rollend) wormen (of enige andere specifieke injectie marker, bijvoorbeeld GFP) en kies rollen to afzonderlijke platen.
   7. Selecteer platen met glooiende F2 dieren en aanwezigheid van fluorescentie onder een ontleden fluorescentie Microscoop bevestigen (meestal alle roller dieren zijn positieve GFP).
      Opmerking: F2 rollen geven de succesvolle generatie van een transgene lijn. Afzonderlijke regels afwijken, bijvoorbeeld met betrekking tot transgenic transmissiesnelheid. Daarom is het nuttig om te handhaven en het opslaan van meerdere regels.
   8. Behouden de transgene lijnen door nieuwe platen voor marker-positieve dieren verrijken.
      Opmerking: De ingespoten DNA is opgenomen in de kiemcellen als een extrachromosomal matrix. Transmissiesnelheden voor extrachromosomal arrays zijn variabel maar in het algemeen rond ~ 50%. Om te verliezen niet de spanning, het is daarom cruciaal om te lijnen handmatig te verrijken met dominante markers (bijv., lijnen niet beveiligd door negatieve selectie).
   9. Bevriezen transgene lijnen door bevriezing standaardtechnieken voor lange termijn opslag bij-80 ° C ¹⁹.
      Opmerking: Transgenen op extrachromosomal arrays kunnen ook worden geïntegreerd, in de kiemcellen door UV-bestraling in een extra stap moeten opleveren van homogene regels ¹⁸. Bijvoorbeeld, erm-1 werd geïntegreerd in de kiemcellen door UV-bestraling te verkrijgen van de stam ERM-1 [++] fgIs2[erm-1p::erm-1;rol-6p::rol-6(su1006)] waar elk dier draagt de transgenic, een vereiste voor het gebruik ervan in de gebaseerde RNAi interactie scherm hieronder beschreven. Deze soort werd bovendien het label door cytoplasmatische uitscheidingsmechanisme kanaal GFP via kruising bij een stam met een vha-1 p:: GFP transgenic (gegenereerd door dezelfde procedures, zoals hierboven beschreven; zie referentie ²⁰ voor basic genetische procedures, zoals kruizen) en wordt aangeduid als ERM-1 [++]; VHA-1 p:: GFP stam hieronder.

2. Bouw van een gerichte RNAi bibliotheek en het ontwerp van een scherm van RNAi interactie met het fenotype van een kanaal wijzigen

Opmerking: een gerichte RNAi gebaseerde genetische interactie scherm wordt beschreven die gebruikmaakt van een overexpressie cystic kanaal fenotype te Zoek interactie uitscheidingsmechanisme canal morfogenese genen. De ERM-1 [++] stam dient (zie stap 1.2.9) als voorbeeld ⁹. Deze aanpak vormt slechts één van vele mogelijke benaderingen voor de genetische analyse van uitscheidingsmechanisme kanaal lumen morfogenese (Zie Inleiding en discussie voor een andere genetische aanpak). Zie het begeleidende document op intestinale tubulogenesis ³ en verwijzingen ^{17 , 21 , 22} voor achtergrondinformatie over RNAi, details van RNAi procedures, modulatie van RNAi sterkte (aangepast aan de vaak dodelijke tubulogenesis genen) en bespreking van de technische problemen op aangesloten RNAi Zie referentie ¹⁹ voor standaard worm cultuur en onderhoud en Inhoudsopgave materialen.

Zoekt ERM-1 (of andere gen van belang) interactie moleculen in databases en gepubliceerde artikelen

.
Opmerking: Potentiële ERM-1 interactors zou omvatten alle moleculen die werd experimenteel aangetoond dat functioneel, genetisch of fysiek ermee ERM eiwitten in alle soorten en/of waren voorspeld te doen door een in silico, hoge doorvoer of Systeembiologie aanpak (Zie tabel 3 voor voorbeelden van databases en middelen).
1. Genereren van een lijst van alle genen en vinden van C. elegans homologen eventueel.
   Opmerking: Overwegen uitbreiding van de lijst van geïdentificeerde genen aan gene klassen, die rekening houden met de functie van het gen van belang en verruimt het net voor het identificeren van de interactors (bijvoorbeeld voor de membraan-actine linker ERM-1, selecteert u alle actins en actin-gerelateerde moleculen).
2. Identificeren de overeenkomstige RNAi bacteriële voederen klonen in de handel verkrijgbare genoom-brede bacteriële RNAi bibliotheken voor alle genen (b.v. Ahringer genomic C. elegans RNAi voederen bibliotheek ²¹; Tabel van materialen)
3. Genereren een spreadsheet voor alle genen en hun overeenkomstige RNAi plaat en goed nummer.
4. Plukken en strijk ~ 50 RNAi klonen op LB/ampicilline/tetracycline platen (keuze van het antibioticum wordt bepaald door de bouw van de bibliotheek) per dag en blijven tot gerichte RNAi bibliotheek wordt gegenereerd.
   Opmerking: Afhankelijk van de grootte van de bibliotheek en geprojecteerde werkstroom, weglaten genereren van een volledige bibliotheek en gaan direct met batchanalyse. Platen kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C, niet langer dan ongeveer 2 weken (indien nodig, opnieuw op nieuwe borden zijn strijk daarna). Omgekeerd, een grotere bevroren bibliotheken kunt genereren in repliceren 96-Wells of 384-well formaten voor lange termijn opslag bij -80 ° C.
5. Incubeer de platen bij 37 ° C's nachts. Volgende ochtend, op 4 platen verwijderen van incubator en winkel ° C.
6. Kies RNAi bacteriën uit een plaat door een steriel tandenstoker, meng bacteriën met 600 μL LB/ampicilline (50 ng/μl) Bouillon in 1,5 mL microtube, Incubeer de buizen bij 37 ° C, schudden voor 6 h.
   Opmerking: Beënten RNAi bacteriën in de Bouillon door het wrijven van de pick (tandenstoker of micropipet tip) langs de kant van de microtube.
7. Zaad 70 μL gekweekte bacteriën in elk putje van 6-well RNAi platen in dubbele of drievoudige sets. Incubeer de platen van de RNAi bij 22 ° C's nachts.
   Opmerking: RNAi platen worden gegenereerd door standaardprocedures (Tabel van materialen en verwijzingen ^{3 , 17 , 21}) en hier gebruikt in een 6-well weefsel cultuur plaat formaat voor een hogere doorvoersnelheid aanpak waarmee nog voor de microscopische beoordeling van kanaal morfogenese in levende dieren op de platen.
8. Volgende ochtend, pick 3 L4 fase ERM-1 [++]; VHA-1 p:: GFP wormen op elk putje van de RNAi platen.
   1. Om te voorkomen dat besmetting met OP50 bacteriën (zie referentie ¹⁹) die met RNAi eerst interfereren de wormen op een bord NGM zonder bacteriën zaad en laat de dieren kruipen voor ongeveer 10 minuten. Gebruik alleen gezonde dieren niet-uitgehongerd.
9. Incubeer de platen bij 22 ° C gedurende 3 d om dieren te produceren nakomelingen.
10. Onderzocht kanaal fenotypes bij F1 nageslacht onder de ontleden fluorescentie Microscoop.

3. In Vivo Beeldvorming van het kanaal Excretory C. elegans door fluorescentie ontrafeling microscopie en scoren van fenotypen Tubulogenesis

1. voorbereiden een fenotype scoren blad (voorbeeld in tabel 4 en Figuur 5 ).
2. Plaatst de agarplaat met wormen direct onder de fluorescentie dissecting Microscoop, open deksel van de plaat voor evaluatie, gebruiken lagere vergroting te concentreren.
   Opmerking: Dit protocol beschrijft het gebruik van een scope met 1.5 X en 10 X doelstellingen en een zoombereik van 3.5 tot en met 45 (Tabel of Materials).
3. Evalueren van dieren door zich te concentreren op elk goed afzonderlijk, te beginnen met goed 1 en werk naar beneden van de plaat.
   Opmerking: Altijd beginnen met de evaluatie van besturingselementen. Bijvoorbeeld, een mock (lege vector) negatieve controle (HT115 RNAi bacteriën (zie referenties ^{17 , 21}) zonder of met een niet-verwante gene invoegen) en passende positieve controles, bijvoorbeeld zulks zeef interactie, erm-1 RNAi (onderdrukt het ERM-1 [++] fenotype) en sma-1 / spectrin RNAi (verbetert de ERM-1 [++] canal fenotype).
4. , Eerst algemene fenotypen zichtbaar onder fel licht (bijvoorbeeld: laat/lethal, Clr/wissen, Emb/embryonale dodelijk, Ste/steriele UNC-/ ongecoördineerde, Dpy/dumpy, etc.), het fenotype kwantificeren door het totale aantal dieren en nummer tellen opnemen van dieren met het fenotype, de nummers (Zie tabel 4).
   Opmerking: Voor knockdowns van genen die veroorzaken gebreken die invloed kunnen zijn op de beoordeling van kanaal fenotypen (b.v., Emb, Ste), het herhalen van het experiment met voorwaardelijke beschouwen, post embryonale RNAi (zie bijbehorende papier voor procedures ³ ).
5. Tweede, onderzoekt uitscheidingsmechanisme kanaal fenotypen onder tl-licht, scoren kwantificeerbare fenotypen (bijvoorbeeld lengte van canal, breedte van de lumen, cysten), de nummers opnemen en fenotypen beschrijven op een Score sheet (Zie tabel 4, < sterke class = "xfig" > figuur 5).
   Opmerking: Hogere vergroting met zoombereik is nodig om meer subtiele kanaal fenotypen evalueren. Heen en weer bewegen tussen lage en hoge vergroting zorgvuldig evalueren het kanaal ’ s lengte- en breedte- en eventuele andere kanaal morfogenese fenotype. Rekenen voor kwantificering of semi-kwantificering van eenvoudige fenotypen, 100 dieren (bijvoorbeeld L4s in dit gerichte RNAi scherm; fenotypes: kanaal lengte van 1/4, 1/2, 3/4 en volledige uitbreiding van posterieure grachten en lumen diameter van posterieure grachten, klein cysten (< 1/3 van dierlijke breedte), grote cysten (> 1/3 van dierlijke breedte); Zie tabel 4).
6. Ophaal beelden van de overheersende fenotypes van ten minste 3 verschillende dieren door een Microscoop gemonteerd digitale charge - coupled apparaat (CCD) camera en bijbehorende denkbaar software (Zie Tabel van materialen)
   1. te verwerven van beelden, eerst zet camera, aangesloten computer inschakelen, dubbelklik op het pictogram afbeelding capture software, richten een gebied van de plaat van de worm handmatig onder lage vergroting en open de sluiter van de camera.
   2. Klik op het “ live voorvertoning ” icoon van afbeelding capture software op het computerscherm te visualiseren de wormen op het computerscherm, passen de focus handmatig te duidelijk visualiseren de wormen op het scherm, klik op de “ magnetisch ” pictogram, vervolgens Klik op de “ opslaan ” pictogram.
      Opmerking: Dieren zullen zich sneller bewegen onder tl-licht, dus houd enerzijds op computermuis klaar terwijl het bewegen van de plaat in het interessegebied met de andere hand. Klik dan snel op de “ magnetisch ” pictogram te verwerven van de afbeelding. Het is meestal mogelijk te verwerven van een goed imago met verschillende pogingen.
   3. De verworven afbeeldingen opslaan met een juiste bestandsnaam (inclusief stam, RNAi kloon naam en datum).
      Opmerking: Sneller bewegende wild-type wormen met dunne en lange grachten zijn moeilijker om het imago dan mutanten. Mutanten met cystic grachten en/of andere fenotypen dreigen te langzaam, waardoor imaging. Marker plasmiden zoals Rol kunnen nuttig zijn voor imaging doordat dieren “ ter plaatse ” in plaats van verplaatsen toekomen en kan ook voorzien van een betere kijk op het fenotype het dier om zich heen rollen.

4. Beeldvorming van het kanaal Excretory C. elegans op hoge resolutie door Laser Scanning Confocal Microscopie

1. montage van levende dieren
   1. plaats een kleine hoeveelheid vet of vaseline op het puntje van een wattenstaafje of op het puntje van de index van de vinger, en verspreid het vet voor het genereren van een uiterst dunne cirkel met een diameter van ~ 6 – 8 mm in het midden van een schone glasplaatje.
   2. Plaats 6 μL 5% lidocaïne-oplossing (verdoving) in de cirkel door een micropipet.
      Opmerking: Een stamoplossing lidocaïne kan geschieden door lidocaïne poeder in water oplost. Verdun tot 5% met M9 buffer ¹⁹ (Tabel van materialen). Het is van cruciaal belang voor de analyse van het uitscheidingsmechanisme kanaal om te voorkomen dat de gemeenschappelijke immobilisatie oplossingen (zoals natriumazide) die cysten te scheuren veroorzaken en dat induceren kanaal fenotypen.
   3. Kies verschillende dieren uit een plaat van RNAi, en plaats ze in de lidocaïne-oplossing door de worm pick ¹⁹ in de oplossing onderdompelend.
      Opmerking: Kies bij voorkeur fase-specifieke dieren die zelfs-montage door uniforme dikte zal vergemakkelijken. Dieren kunnen voorgeselecteerd voor het geval op de ontleden fluorescentie Microscoop.
   4. Plaats een dekglaasje 22 x 22 mm aan op het glasplaatje; laat het zachtjes regelen op de cirkel vet.
      Opmerking: Elke fysieke druk niet van toepassing op het dekglaasje aan die kanaal morfologie, vooral in mutanten of RNAi behandeld wormen met kanaal en eventueel andere fenotypen kan beschadigen. Het is daarom belangrijk om te voorkomen dat een dik vet cirkel; ideaal zijn de dieren voorzichtig ingeklemd tussen glasplaatje en cover slip.
   5. Schrijf de naam van het monster op de matte zijde van het glasplaatje. Meteen de dia aan de confocal microscoop voor analyse van kanaal fenotype en te verwerven beelden.
      Opmerking: Vertragingen kunnen leiden tot schade van kanaal cysten of wijzigen in kanaal lumen morfologie.
2. Verwerven confocal beelden
   1. plaats van de dia in het werkgebied van de steekproef van de confocal microscoop, richten de wormen bij lage vergroting (10 X).
   2. Weergave en selecteer dieren onder 60 X en/of 100 X doelstellingen, onderzoeken het uitscheidingsmechanisme kanaal ’ s mobiele en subcellular fenotypen, bijvoorbeeld, lumen vorm en diameter, grootte en vorm van cysten; of de subcellular onderdelen gelabeld voor analyse, bijvoorbeeld, apicale/lumenal membraan met basale membraan, cytoplasma, endosomal versus canalicular blaasjes, andere organellen (Zie discussie, Figuur 2 en Figuur 4).
   Ophaal beelden van het specifieke fenotype van belang
   3. .
      Opmerking: Dit protocol beschrijft het gebruik van een laser confocal microscoop (Tabel of Materials) scannen. U kunt oplossen door subcellular componenten in de dunne C. elegans zijn uitscheidingsmechanisme grachten, hogere vergroting doelstellingen (60 X 100 X) vereist. Een draaiende schijf confocal microscoop kan worden gebruikt voor het verwerven van time lapse beelden maar biedt minder confocality (Zie discussie).
      1. Te verwerven confocal beelden, zet de computer, tweevoudig tikken voort naar de confocal microscoop software en selecteer de laser door te klikken op het pictogram van een specifieke laser.
      2. Klik op de “ scan ” pictogram om te visualiseren de gerichte worm op het computerscherm, aanpassen laser intensiteit via de software en klik nogmaals op “ scan ” pictogram Scannen stopzetten, vervolgens klikt u op “ vangen ” vangen van een afbeelding, vervolgens klikt u op het pictogram “ opslaan ” pictogram.
      3. Afbeeldingen met de juiste bestandsnaam opslaan en RNAi kloon, stam naam en datum bevatten.
         Opmerking: Afbeeldingen kunnen worden verworven als single en meerdere secties (bijvoorbeeld 10 – 15 secties langs de z-as). Afdelen kunt 3D-visualisatie. Verwerven van projectie beelden en afzonderlijk opslaan indien nodig (afhankelijk van de Microscoop). Voor een optimale resolutie, laser-instellingen te gebruiken met lage winst, niet open pinhole teveel, en voeg toe verschillende gemiddeld per beeld (zie referenties ^{23 ,}, ²⁴, voor algemene discussies voor confocal imaging). Zorg voor het verwerven van beelden op een helderheid onder verzadigingsniveau mogelijk te maken voor wijziging door imaging software indien nodig (bij voorkeur gebruik ongewijzigd afbeeldingen).
      4. Verwerven beelden van dubbel - of vermenigvuldigen van gelabelde kanalen (bijvoorbeeld groen, rood en blauw) op dezelfde manier, door te klikken op meerdere pictogrammen van de laser, maar gebruiken sequentiële scannen te voorkomen bloeden-via tussen kanalen (kritische voor co lokalisatie studies).
         Opmerking: Men wellicht rekening houden met de tijd die nodig is voor het sequentiële scannen (die ook leidt tot een overeenkomstige toename in foto bleken) en scannerinstellingen wijzigen. Kan niet scannen dieren van de ene dia voor meer dan 30 min maximale aspecifieke effecten op de morfologie van het kanaal te vermijden. Nieuwe dia te koppelen als langere scannen vereist is.
      5. Krijgen bijbehorende differentiële interferentie optica (DIC) / Nomarski beelden, met name als kwantificeren kanaal lengte en lumen diameter ten opzichte van de worm ’ s lichaamslengte en diameter. Overlay van fluorescentie en Nomarski afbeeldingen door te klikken op “ overlay ” pictogram om aan te tonen van bezienswaardigheden ( Figuur 1 d en figuur 4A – D).
   4. Meten voor kwantificering, de intensiteit van de fluorescentie van een gelabelde component van belang door ImageJ software ²⁵ ( figuur 5C).

Representative Results

Dit protocol wordt beschreven hoe u de uitscheidingsmechanisme grachten van C. elegans visueel en moleculair analyseren eencellige tubulogenesis en intracellulaire lumen morfogenese in één cel. Tijdens hun uitbreiding uit de tijd van halverwege embryogenese naar volwassenheid blijven de vier uitscheidingsmechanisme grachten uitbreiden van hun basolaterale en apicaal/lumenal membranen samen met hun canalicular en endosomal endomembraansysteem, bieden een uniek model voor de in vivo analyse van DOVO gepolariseerde biogenese van organellen (Figuur 1). Subcellular componenten zoals apicale membraan, het cytoplasma en endosomal versus canalicular blaasjes kunnen worden gevisualiseerd door specifieke fluorescerende fusie-eiwitten (beschreven in sectie 1 protocol) uitdrukken, en zij kunnen worden onderscheiden van elkaar door dubbele of drievoudige labeling in afzonderlijke transgene dieren (Figuur 2). Een unieke uitscheidingsmechanisme kanaal fenotype (figuur 3A-B) gegenereerd door het overexpressing van een apicale membraan geassocieerde molecuul (ERM-1), wordt gebruikt om aan te tonen van het uitvoeren van een gerichte RNAi scherm ter identificatie van genen werking in de apicale membraan en lumen biogenese; Dit dient als een voorbeeld van een moleculaire en visuele analyse van gepolariseerde biogenese van organellen in dit model (beschreven in sectie 2 protocol). Deze ERM-1 [++] canal fenotype wordt gebruikt om aan te tonen hoe te te visueel evalueren en score onderdrukking (Figuur 3 c-D) en toebehoren (figuur 3E– F) door de ontrafeling van de fluorescentie microscopie (beschreven in sectie 3 protocol) . Kanaal fenotypen geïnduceerd door modulatie van ERM-1 niveaus dienen om het oplossen van gebreken aan het subcellular niveau door confocale microscopie (Figuur 4) (beschreven in sectie 4 protocol), en hoe te kwantificeren van eenvoudige kanaal fenotypen (kanaal lengte en cyste te tonen grootte) en apicale membraan biogenese gebreken (Figuur 5).

Figuur 1 : Morfogenese van de C. elegans Excretory Canal en Subcellular Canal structuren
(A) schematische weergave van uitscheidingsmechanisme kanaal extensie (blauwe lijnen) tijdens de ontwikkeling van het embryo en de larve. De uitscheidingsmechanisme cel bereikt zijn definitieve locatie aan de linkerkant van de ventro-laterale van de posterieure faryngaal lamp in het stadium van de komma van het embryo (niet afgebeeld). Zoals het embryo kieuwopeningenvorm, breidt het eerst twee armen zijwaarts naar de linker- en rechterkant; elke arm bifurcates dan in een voorste en achterste tak. Deze anterior en posterior takken verder hele rek van het dier tijdens vier larvale stadia, eerst inhalen met de groei van het dier in het stadium van de L2- en bijbehorende haar verdere groei tot volwassenheid. DOVO gepolariseerde membraan biogenese steunt deze uitbreiding tot volwassenheid. (B) In het volwassen dier, de anterior kanaal takken bereiken de neus tip en de achterste takken, de staart (blauwe lijnen). Het uitscheidingsmechanisme lichaam van de cel wordt weergegeven in de buurt van de posterieure faryngaal lamp (blauw). Gepolariseerde membraan domeinen worden gehandhaafd tijdens volwassenheid. (C) uitgebreide weergaven van een kanaal arm sectie. Links: 3D-weergave van het kanaal shows: basale membraan (zwart), cytoplasma (blauw), lumenal membraan (groen) en de lumen (wit). Rechts: binnen uitzicht op het kanaal en de membranen: basale membraan (zwart) met cytoplasma (blauw), Endosomen (gele ovalen), canalicular blaasjes (witte bollen, verbonden met elke andere, verbonden met de lumen of geïsoleerde enkele blaasjes), apicale membraan (groen) en de lumen (wit). (D) Confocal/DIC overlay microfoto van het uitscheidingsmechanisme cel in een embryo en de uitscheidingsmechanisme grachten in een larve, gelabeld door lumenal versus cytoplasmatische GFP, respectievelijk. Linker afbeelding: uitscheidingsmechanisme cell (groen, pijl) in een 1.5-fold embryo, met kanaal lumen gevisualiseerd met het uitspreken van de apicale ERM-1::GFP onder de promotor erm-1 . Rechterafbeelding: vier uitscheidingsmechanisme canal takken (groen, pijl) in L3 larven, gevisualiseerd door cytoplasmatische vha-1 p:: GFP. Schaal bars = 20 μm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2 : Visualiseren Subcellular componenten in Wild-type uitscheidingsmechanisme Canal armen door dubbele labelen met fluorescerende Fusion eiwitten
(A) het cytoplasma van de apicale membraan te onderscheiden. Expressie van GFP onder de sulp-5 -promotor visualiseert het kanaal cytoplasma (groen, top); expressie van ERM-1::mCherry onder zijn eigen promotor visualiseert de apicale membraan (rood, midden); samenvoegen van deze afbeeldingen (onder) maakt een onderscheid tussen cytoplasma en de apicale membraan dat anders zou niet te onderscheiden door enkele labeling zelfs bij hoge vergroting. Schaal Bar = 5μm. (B) het bepalen van de ruimtelijke relatie van endosomal blaasjes aan de lumen. Visualisatie van de lumen door een apicale membraan-geassocieerde GFP fusieproteïne (pseudo gekleurd rood, bovenste); visualisatie van endosomal blaasjes met het uitspreken van mCherry::RAB-7 (pseudo gekleurde blauw, midden); samenvoegen van deze afbeeldingen (onder) toont de relatieve ruimtelijke posities van endosomal blaasjes aan de lumen. Schaal Bar = 5μm. (C en D) Het oplossen van kanaal buis vormen versus subcellular kanaal onderdelen in verschillende vergrotingen. Het cytoplasma van L1 larven heet GFP uitspreken onder de sulp-5 promotor en cytoplasmatische canalicular blaasjes met het uitspreken van het water kanaal AQP-8::mCherry onder de aqp-8 -promotor. (C) afbeeldingen verworven bij lagere vergroting oplossen van een patroon van de "parels-op-een-string" overeenkomt met fase-specifieke varicosities (varicosities zijn reservoirs overvloedig in canalicular blaasjes en andere onderdelen die nodig zijn voor de groei van het kanaal), maar doen niet opgelost door cytoplasmatische AQP-8 puncta. (D) beelden verkregen bij hogere vergroting oplossen AQP-8 puncta in het cytoplasma kanaal overeenkomt met canalicular blaasjes. Schaal Bars: 20 μm in C en 5 μm in D. Alle deelvensters tonen confocal projecties van 10 – 15 secties, elk. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3 : Scoren van smaakversterkers en Suppressors van een Cystic Canal fenotype (ERM-1[++]) door de ontrafeling van de microscopie
(A) ERM-1 [++]; rol-6(su1006) uitscheidingsmechanisme grachten worden gevisualiseerd met het uitspreken van GFP onder een promotor van vha-1 . Posterieure kanalen uit te breiden tot de vulva of medio kadaver van het dier (pijlen; beschouwd als 1/2 verlengstuk) op lagere vergroting (1.5 X doelstelling en lage zoom). (B) op hogere vergroting, de handtekening ERM-1 [++] kleine-cystic Serti kanaal kan worden opgelost, met het puntje van de posterieure grachten (één arm aangeduid met een pijltje) uitbreiden tot aan de vulva of iets daarbuiten (vulva aangegeven met grote pijl; canal lumen in deelvenster D kan worden beschouwd als wild type voor vergelijking). (C) onderdrukking, lage vergroting: langwerpig en dun grachten in RNAi ERM-1 [++] dieren behandeld. (D) op hogere vergroting, posterior kanalen kunnen blijken dat bijna volledig uit te breiden tot de staart (pijltjes, te vergelijken met die van de moederdieren, weergegeven in het deelvenster B); grote pijl geeft de positie van de vulva. (E) toebehoren: verdere verkorte grachten met grotere cysten in RNAi behandeld ERM-1 [++] dieren; lage vergroting, geen zoom. (F) op hogere vergroting, achterste kanaal extensie kan worden bepaald als minder dan 1/2 (pijltje) of niet verlengd tot de vulva (aangegeven door de grote pijl) en de grootte van de cyste als meer dan 1/3 van het dier breedte (breder dan die van het moederdier komt te staan in B). Schaal bars = 400 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 4 : Visuele analyse van uitscheidingsmechanisme Canal morfologie en Subcellular Canal componenten in Mutant/RNAi dieren door confocale microscopie
(A – D) Een vacuolar onderscheiden van een cystic kanaal fenotype (confocal/DIC overlay microfoto worden weergegeven). (A) het cytoplasma van een wild-type kanaal is gevisualiseerd met het uitspreken van GFP onder de sulp-5 promotor (pseudo-gekleurde blauw in onderscheid van apicale membraan labelen, getoond in groen in deelvenster B). (B) de apicale membraan van een wild-type kanaal is gevisualiseerd met het uitspreken van ERM-1::GFP; Merk op dat lumen niet zichtbaar op deze vergroting is en dat enkele etikettering kan geen onderscheid cytoplasmatische van membraan labeling maken. (C) uitscheidingsmechanisme kanaal fenotype geïnduceerd door RNAi: cytoplasmatische vacuolen cytoplasmatische labeling niet kan onderscheiden van intralumenal cysten. (D) uitscheidingsmechanisme kanaal fenotype geïnduceerd door RNAi: apicale ERM-1::GFP labeling detecteert vocht ophoping in het lumen, identificeren (lumenal) cysten in plaats van (cytoplasmatische) vacuolen (vergelijk figuur 4I voor cytoplasmatische vacuolen). Schaal Bar = 40 μm voor A-D, aangegeven in A. (E-J) analyseren verlies - en winst-van-functie effecten op subcellular kanaal onderdelen (confocal beelden van één kanaal wapens worden weergegeven). (E-G) Effect van erm-1 RNAi op de subcellular localisatie van canaliculi. (E) Wild-type kanaal cytoplasma; Opmerking GFP uitsluiting aangeeft lumen. (F) Wild-type cytoplasmatische AQP-8::GFP puncta, overeenkomt met de canalicular vesikels. (G) Cytoplasmic en basale verplaatsing van AQP-8::GFP puncta in erm-1(RNAi) dier. (H) discontinue lumen en detail van lumen tip pathologie (curling en verlies van lumen centreren) in erm-1(mildRNAi) dier Zie (³ voor het moduleren van RNAi kracht); Merk op dat kanaal cytoplasma verder reikt dan het puntje van de lumen, hier aangegeven door kleine cysten. (I) cytoplasmatische vacuolen in uitscheidingsmechanisme kanaal lichaam zonder een eventuele uitbreiding van het kanaal in sterk beïnvloed erm-1(RNAi) dierlijke³; Merk op dat ACT-5::GFP niet gerekruteerd om de lumen (met uitzondering van enkele kleine vlekjes rond sommige vacuolen). (J) werving van overtollige ACT-5::GFP en AQP-8::mCherry aan de lumen in triple transgene dieren overexpressing ERM-1 (Opmerking dikke band van ACT-5::GFP en overlappende AQP-8::mCherry bosjes rond de cystic lumen). Schaal Bar = 5 μm voor E-J, weergegeven in E. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 5 : Voorbeelden van kwantificering van Canal gebreken van ontleden en Confocal Microscopie
(A) schematische weergave van wild type (bovenste deelvenster) en mutant cystic (lagere panelen) uitscheidingsmechanisme grachten voor kwantificering van kanaal lengte en cyste grootte. Lengte van achterste kanaal wordt gekwantificeerd als 0, 1/4, 1/2, 3/4 en 1. Kanaal lengte '0' duidt zonder extensie en '1' duidt full-length extensie. De grootte van de cyste wordt gekwantificeerd als < 1/3 (klein) en > 1/3 (groot) diameter van het lichaam. (B) kwantificering van bruto kanaal morfologie in controle en ERM-1 [++](RNAi) dieren door fluorescentie microscopie ontleden. In mock(RNAi) ERM-1 [++] dieren is de achterste kanaal lengte ongeveer 1/2 uitgebreid in 95% dieren (referentiebeeld, figuur 3A-B). In suppressor ERM-1 [++](RNAi) dieren, het achterste kanaal lengte bijna volledig is uitgestrekt in 80-90% dieren (referentiebeeld, Figuur 3 c-D). In enhancer ERM-1 [++](RNAi) dieren, ongeveer 60-70% kanalen hebben grote cysten en kortere lengte (< 1/2) (referentiebeeld, figuur 3E– F). Gegevens gepresenteerd als bedoel ± SD (n > 3). (C) kwantificering van de intensiteit van de fluorescentie van het cytoskelet van de apicale/lumenal kanaal door ImageJ van confocal beelden. Het kanaal de apicale membraan heet door ACT-5::GFP, wild-type kanaal arm wordt aangetoond dat de, ERM-1 [++] canal linkerarm, rechts. Links van de panelen: intensiteit van ACT-5::GFP in wild type membraan hoes is ongeveer 50 (grijze waarde/membraan; aangegeven door zwarte en rode pijl), perceel komt te staan onder de afbeelding. Rechts panelen: intensiteit van ACT-5::GFP in ERM-1 [++] bedraagt 100 (grijswaarde van dorsale membraan is ongeveer 110 (zwarte pijl) en ventrale membraan is ongeveer 140 (rode pijl)), perceel onder afbeelding hier komt te staan. Schaal bars = 5 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Tabel 1: voorbeelden van merkers voor de C. elegans Uitscheidingsmechanisme Canal membraan systeem
Eiwit naam	Sub

cellulaire lokalisatie Functie Voorbeelden van beschikbare stammen Verwijzingen ERM-1 apicale domein membraan – cytoskelet linker VJ402 (fgEx13 [erm-1p::erm-1::gfp, rol-6p::rol-6(su1006)]) Ref (¹³) ACT-5 apicale domein apically gelokaliseerde actine VJ268 (fgEx12[(act-5p::act-5::gfp), een unc-119 (+); een unc-119 (ed3) III]) Ref (¹³) ABTS-2 Basolaterale Anion/bicarbonaat transporter ABTS-2::GFP Ref (⁴²) SULP-8 Basolaterale Sulfatepermease SULP-8::GFP Ref (⁴²) VHA-1 canalicular blaasjes V-ATPase VJ535 (fgEx35 (vha-1p::vha-1::gfp; rol - 6p:: rol-6(su1006))) Ref (⁹) VHA-5 canalicular blaasjes V-ATPase ML846 (vha-5(mc38)-IV; mcEx337 [vha-5 (+):: GFP + rol-6(su1006)]) Ref (¹⁰) AQP-8 canalicular blaasjes aquaporin, water kanaal VJ533 (fgEx33 (aqp-8p::aqp-8::gfp)) Ref (⁹) RAB-5 blaasjes endosomal mensenhandel BK209 (qpIs99 (exc9p::mCherry::rab-5)) Ref (³⁶) RAB-7 blaasjes endosomal mensenhandel BK210 (qpIs100 [Pexc-9::mCherry::rab-7]) Ref (³⁶) RAB-11 blaasjes endosomal mensenhandel BK205 (qpIs97 (exc9p::mCherry::rab-11)) Ref (³⁶) ¹ Voorbeelden zijn geselecteerd uit middelen die zijn vermeld in tabel 3.

Tabel 2: voorbeelden van C. elegans Excretory Canal-specifieke initiatiefnemers
initiatiefnemers	Expressie fase
ERM-1	komma fase embryo
sulp-5	3-voudig embryo
VHA-1	2-fold embryo
VHA-5	2-fold embryo
aqp-8	2-fold embryo
GLT-3	laat embryo
1 Voorbeelden zijn geselecteerd uit middelen die zijn vermeld in tabel 3.

Tabel 3: bronnen

Middelen om te identificeren van C. elegans uitscheidingsmechanisme kanaal-specifieke moleculen, labeling reagentia/spanningen en antilichamen

1. Caenorhabditis genetica Center (CGC)43 voor beschikbaar reagentia en stammen

2. Wormbase44 voor informatie over het uitscheidingsmechanisme kanaal-specifieke moleculen, spanningen en antilichamen

3. informatie over uitscheidingsmechanisme kanaal-specifieke moleculen: zie referentie6

4. Transgeneome website45 voor translationeel GFP fusion constructies

5. C.elegans expressie patroon46 voor transcriptionele GFP fusion constructies

6. nationale BioResource Project (NBRP)::C.elegans47 voor informatie over C. elegans mutanten en initiatiefnemers

7. Fluorophores: zie referentie48,49

Web gebaseerde bronnen voor het samenstellen van moleculen voor een gerichte RNAi bibliotheek

1. GeneMANIA50

2. AceView51

3. iHOP52

4. Wormbase44

5. de saccharomyces Genome Database53

6. Flybase54

7. muis Genome Database55

8. menselijk genoom Database56

9. BLAST57

Tabel 4: Voorbeeld van eenvoudige fenotype scoren blad
RNAi bibliotheek		Stam	Generaal fenotype (% totaal)	Kanaal fenotype
				Kanaal lengte < 1/2 (% L4)	Kanaal lengte > 1/2 (% L4)	Andere Canal fenotype	Totaal aantal dieren geteld
Plaat No	Goed nummer
I-1	A1	ERM-1 [++]; VHA-1 p:: GFP	CLR (30)	80	20		100
X-5	B12	dezelfde	geen	30	70		100
III-10	C5	dezelfde	UNC (54)	70	30	grote cysten	100

Discussion

C. elegans genetische veelzijdigheid, transparantie, eenvoudige lichaam plan en invariant cel lineage alle maken het een uitstekend model voor de analyse van de voedselproductie. Dit protocol beschrijft hoe te combineren met standaard genetische manipulaties en beeldvorming studies om te profiteren van de 2 micron dun C. elegans uitscheidingsmechanisme grachten te studeren gepolariseerde membraan en intracellulaire lumen biogenese in de buis van een enkele cel.

Labelen
De C. elegans uitscheidingsmechanisme grachten kunnen worden gelabeld door de expressie van fluorescerende fusion eiwitten, toelaat live analyse (hier beschreven), of door antilichaam of chemische kleuring (zie bijbehorende papier op intestinale tubulogenesis voor antilichaam kleuring ³). de uitdrukking van twee of meer verschillende fluorophores, of de combinatie van deze verschillende technieken, labeling zorgt voor een hoge resolutie visuele dissectie van deze dunne buisjes (Figuur 2). Fluorescerende fusion eiwitten gericht aan de grachten door een kanaal specifieke promotor zijn de eerste keuze voor het uitscheidingsmechanisme kanaal labeling voor verschillende redenen, onder hen: (1) de lage expressie niveaus van vele kanaal eiwitten, en (2) het kanaal van fijne structuur die gemakkelijk is overweldigd door de kleuring buiten de grachten waar de proteïne van belang kan ook worden uitgedrukt. Aan de andere kant, grachten zijn gevoelig voor exogene eiwitten en gemakkelijk ontwikkelen aspecifieke fenotypen (b.v., uitbreiding defecten en cysten, of zelfs letaliteit) wanneer dergelijke eiwitten sterk worden uitgedrukt. Dit moet wegen in het besluit bij de keuze tussen verschillende manieren van het genereren van transgene dieren. In principe, kan transgenen worden ingevoerd als extrachromosomal matrices (bijvoorbeelddoor directe injectie van de plasmide DNA in de gonaden voor germline transformatie, zoals hier is beschreven), die meestal genereert hoge-kopie nummer arrays (vaak met een hoge expressie), of geïntegreerd in het genoom, doorgaans op lage of één exemplaaraantal (bijvoorbeelddoor bombardement²⁶ of via Mos1-gemedieerde één exemplaar invoeging [MosSCI]²⁷). Extrachromsomal arrays kunnen ook worden geïntegreerd in het genoom in een tweede stap (nog steeds, echter op een hoog exemplaaraantal)¹⁸. Aan de andere kant, wanneer geïnjecteerd in de kiemcellen bij lage concentratie (bijvoorbeeld, 1 – 2 ng/µL DNA, gecombineerd met een hogere concentratie van markering DNA), kunnen lage (zelfs één) exemplaar nummer matrices gemakkelijk gegenereerde²⁸. Dit scenario heeft het voordeel dat DNA concentraties kunnen worden gevarieerd, die bij het vinden van de beste expressie niveau helpen kan voor kanaal labeling, noch te hoog als te laag (giftig). De relatie tussen ingespoten DNA-concentratie en expressie niveau is afhankelijk van meerdere factoren (bijvoorbeeld, de promotor), en dus moet worden empirisch bepaald. U kunt ook kan het gen van belang direct gelabeld zijn met een fluorophore in de kiemcellen door geclusterd regelmatig afgewisseld korte palindromische herhaalt (CRISPR) gebaseerd labeling procedures^29,30. Hoewel deze benadering de fluorophore in zijn meest fysiologische genomic context geplaatst, is dit niet altijd noodzakelijk of zelfs wenselijk (bijvoorbeeld wanneer het eiwit wordt uitgedrukt op een zeer laag niveau). Men kan echter wel de beste optie, bijvoorbeeld als het gen van belang zeer groot is.

Kanaal visualisatie kan worden bereikt door het regisseren van transcriptionele constructies in het kanaal dat het cytoplasma kanaal door een fluorophore markeren zal. Daarentegen vereist labeling subcellular kanaal componenten een translationeel fusie waar het full-length gen is aangesloten in het frame dat u wilt de fluorophore gen-codering. Wanneer u een kanaal specifieke promotor voor expressie (in plaats van de gene's eigen promotor), moet haar keuze berusten op de sterkte van de promotor en de ontwikkelings analyse, de tijd van de expressie. Vele uitscheidingsmechanisme kanaal specifieke genen doen niet kenbaar te maken voordat het larvale stadium wanneer de osmotische functie van het kanaal kritisch wordt; te laat voor de analyse van de fase van actieve extensie (erm-1 en profs-1 zijn vroege uitgedrukte genen)^10,,¹³. Voorbeelden van markeringen van uitscheidingsmechanisme kanaal endo- en plasma vliezen en voor kanaal specifieke initiatiefnemers worden gegeven in de tabellen 1 en 2, respectievelijk, en middelen voor het vinden van extra kanaal-specifieke moleculen in tabel 3. Deze middelen kunnen ook worden gebruikt voor het vinden van een reeds makelij geschikt fluorescerende fusieproteïne, die mogelijk beschikbaar zijn via de Caenorhabditis genetica Center (CGC; Zie ook tabel 1). Voor de bouw van recombinante plasmiden voor de uitdrukking van dergelijke fusies eiwit, kan men gebruik maken van verschillende klonen methoden, elk met specifieke voor- en nadelen (elders besproken¹⁴). Deze omvatten conventionele restrictie-enzym gebaseerd klonen benaderingen, die hier worden beschreven, modulaire klonen met de multisite Gateway systeem³¹, Gibson vergadering³²of reporter gene bouw door de methode van "PCR stiksel"^{14 ,33}. Deze verschillende benaderingen kunnen worden aangepast aan de methode die gekozen voor hun introductie in de kiemcellen en/of andere specifieke behoeften (bijvoorbeeld de veelzijdige Gateway systeem vergemakkelijkt de schuifelende van initiatiefnemers en cDNAs voor grotere schaal labeling benaderingen) . Zorg moet worden genomen om te kiezen van de juiste invoeging site voor de fluorophore (koppelen op de N-versus C-terminus van de proteïne), rekening houdend met de functie van het eiwit van belang.

Interferentie met genfunctie
Dit protocol beschrijft als een van de vele mogelijke manieren om erover genfunctie in C. elegans, een gerichte RNAi interactie scherm ontworpen om te wijzigen van een cystic kanaal lumen fenotype, geïnduceerd door overexpressing een lumenal membraan-component. In dit specifieke geval, overexpressing een apicaal/lumenal membraan geassocieerde marker, zoals ERM-1 heeft het voordeel van het direct begeleiden het onderzoek naar het gewenste doel: de analyse van biogenese van intracellulaire apicale/lumenal. Een winst-of-function fenotype gegenereerd door overexpressie biedt ook bepaalde voordelen wanneer deze wordt gecombineerd met een verlies-van-functie (RNAi) interactie scherm zoals hier beschreven (Zie³⁴ voor de bespreking van de analyses van de verlies - en winst-van-functie en de ontwerp van genetische schermen). Bovendien ERM-1 zelf is een goed onderzochte "lumen morfogenese" en apicale membraan identiteit molecuul¹². In dit geval daarom een gerichte (eerder dan onbevooroordeelde) scherm waarschijnlijk direct informatief voor lumen morfogenese terwijl gelijktijdig verdere wezenlijke ERM-1's specifieke functie in dit proces. Echter kan een onpartijdige, niet-doelgerichte scherm plaatsvinden op een gelijkaardige manier, hetzij met een wild type dier, een transgene dieren met f beginnenLabel uitscheidingsmechanisme grachten, luorescently of met elk kanaal mutant. De algemene voordelen en nadelen van RNAi (bijvoorbeeldversus mutagenese) voor de generatie van de verlies-of-function fenotypen, en de geleiding en bespreking van verschillende soorten genetische schermen in C. elegans zijn elders besproken ³⁴. RNAi produceert een spectrum van fenotypen, met inbegrip van mildere fenotypen, een specifieke voordeel voor de analyse van de vaak dodelijke tubulogenesis genen. Dit is beschreven en besproken in het begeleidende document op intestinale tubulogenesis³. Verschillende benaderingen voor het genereren van winst en verlies-van-functie mutanten en klassieke genetische procedures zoals kruizen, zijn gedetailleerde en besproken in de algemene genetica methoden literatuur²⁰.

Microscopie en evaluatie van tubulogenesis fenotypes
Visueel beoordelen en scoren van de wijziging van het fenotype van een welomschreven kanaal onder een TL Microscoop ontleden met behulp van eenvoudige scoren parameters (zoals kanaal lengte en lumen diameter), zoals hier beschreven, kunnen worden bereikt in een korte periode van tijd zelfs bij de verwerking van grote aantallen dieren in een gerichte of systematische genetische of RNAi scherm. Daarentegen een soortgelijk scherm zoekt nieuwe kanaal morfogenese fenotypes bij een stam dat is wild-type (met uitzondering van haar kanaal-labeling transgenic), is meer tijdrovend, maar kan, in principe op dezelfde manier worden uitgevoerd (wij hebben verricht die een scherm op basis van genoom-brede in enkele maanden). Dergelijke schermen zal identificeren meerdere verschillende kanaal fenotypen (hier niet afgebeeld) en daarom moeten dienovereenkomstig verschillende scoren parameters, bijvoorbeeld, een kwalitatieve classificatie in scheme (Zie ^{9,11, 35},^,36,^,37,38 voor verschillende manieren om te scoren kanaal fenotypen door het ontleden van microscopie). Bij de interpretatie van het fenotype van een kanaal, is het cruciaal om te houden in het achterhoofd dat vorming van cysten een aspecifieke effect van veel verschillende beledigingen aan deze dunne buisvormige structuur kunnen, en het is vaak een minder informatief terminal fenotype. Grootte van de cyste en de locatie, aan de andere kant, kunnen worden informatieve, bijvoorbeeld, een cyste dicht bij de canal cel (aan het begin van het kanaal extensie), cysten langs het kanaal van lengte of cysten op kanaal toppen, bieden aanknopingspunten met het onderliggende mechanisme van de gebreken. Kanaal cysten (hier gedefinieerd als intra-lumenal vloeistof gevulde spheroïden omgeven door een apicaal/lumenal membraan) moeten worden onderscheiden van blaasjes (kleine cytoplasmatische membraan-gebonden vloeistof gevulde spheroïden) of vacuolen (uitgebreide cytoplasmatische membraan-gebonden vloeistof gevulde spheroïden), niet omgeven door een lumenal membraan, dat kan alle kijken oppervlakkig identiek (figuur 4A– D). Cytoplasmatische vacuolen kunnen eveneens ontstaan subsidiair, bijvoorbeeldvia de toxische effecten van ophangsystemen (natriumazide). Zowel grote cysten en cytoplasmatische vacuolen kunnen nemen bijna de grootte van het dier, en moet worden verder onderscheiden van de klassieke "clear (Clr)" canal fenotype die wordt door ophoping van vocht in de lichaamsholte veroorzaakt. Tot slot, kanaal lengte is bijna altijd subsidiair gecompromitteerd in cystic grachten, dus een echte kanaal extensie defect moet worden aangetoond in een cyste-vrije omgeving.

Ondanks hun kleine diameters, subcellular onderdelen van uitscheidingsmechanisme kanalen, zoals apicale versus basale membranen, intracellulaire endosomal versus canalicular blaasjes, intracellulaire organellen en cytoskeletal onderdelen, kunnen worden gevisualiseerd door hoger vergroting, bijvoorbeeldconfocale microscopie (Figuur 2, Figuur 4). Door confocal imaging is een GFP positieve kanaal cytoplasma alleen voldoende om te onderscheiden van het lumen van het kanaal cytoplasma via een niet-fluorescerende lijn (figuur 2A, figuur 4E). De identiteit van markeringen draagt bij aan het oplossen van canalicular van endosomal blaasjes (ook opvallend verschillend in grootte), hoewel de definitieve verdeling vergt immunoelectronmicroscopy³⁹. Twee- en driepersoonskamers labelen kunt bepalen de subcellular localisatie van een molecule van belang en de relatie van subcellular componenten aan elkaar (Figuur 2). Enkele gelabelde lumenal kanaal membranen produceren dezelfde dubbele lijn als het cytoplasma of de basale membraan, maar kunnen worden onderscheiden via dubbele of drievoudige labeling. Confocale p.a., juiste montage is belangrijk, gezien de kwetsbaarheid van de structuur van het kanaal, de gevoeligheid op osmotische veranderingen en de kwetsbaarheid van de meest voorkomende cystic fenotype. Cysten gemakkelijk barsten met osmotische veranderingen of fysieke druk, zijn gevoelig voor membraan toxines zoals natriumazide, en zijn ook gevoelig voor sommige verdoving immobilisatie (die kan produceren ook cytoplasmatische vacuolen) gebruikt. In onze handen, 5% lidocaïne in M9 buffer geschikt voor meest uitscheidingsmechanisme kanaal testen. Imaging procedures en alle behandeling moet zacht, zoals beschreven. Om te voorkomen dat artefacten die na te fenotypen (b.v., cysten en vacuolen bootsen), is het best om de beelden onmiddellijk te verwerven na montage. Als dat niet mogelijk is, moeten de cyste beelden eerst, voordat andere fenotypen imaging worden verworven. Dit protocol bespreekt standaard scanning confocal microscopie waarmee superieure confocality, in vergelijking met draaiende schijf confocale microscopie, die daarentegen vermindert fototoxiciteit en de microscopie van keuze voor de analyse van dynamische veranderingen van subcellular onderdelen na verloop van tijd. Dergelijke vragen op subcellular dynamiek kunnen ook worden aangepakt met behulp van photobleaching technieken of labelen fusion eiwitten met foto-schakelbare fluorophores die veranderen van kleur⁴⁰. Tot slot, het bereik van resolutie verder kan worden verhoogd door het toevoegen van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM, verstrekken van de hoogste resolutie voor structuurfondsen maar niet moleculaire), super resolutie microscopie (mits moleculaire resolutie in het bereik van nanometer); of immunoelectronmicroscopy (mits beide)^39,41. 3D-tomografie kan gecombineerd worden met TEM seriële secties en is vooral nuttig voor de analyse van het raakvlak van de canalicular-plasma-membraan van uitscheidingsmechanisme grachten^9,10. Verbeterde technieken voor deze verschillende soorten microscopie en combinaties van deze verschillende benaderingen van de beeldvorming verder worden ontwikkeld.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cloning
Plasmid pPD95.75	Addgene	Cat. No. 37464
PCR Kit	Qiagen	Cat. No. 27106
Ligation kit	New England Biolabs	Cat. No. E2611L
DNA marker	Thermo Scientific	Cat. No. SM1331
Agarose DNA grade	Fisher Scientific	Cat. No. BP164-100
Competent cells	New England Biolabs	Cat. No. C2987H
Tris	Fisher Scientific	Cat. No. BP154-1
EDTA	Sigma	Cat. No. ED-1KG
Acetic acid	Fisher Scientific	Cat. No. A38S-500
Ethidium bromide	Fisher Scientific	Cat. No. BP1302-10
Equipments
PCR machine	MJ Research	Cat. No. PTG-200
Centrifuge	Eppendorf	Cat. No. 5415C
Water Bath	Precision Scientific	Cat. No. 666A3
Gel running instrument	Fisher Scientific	Cat. No. 09-528-165
Gel running power supply	Fisher Scientific	Cat. No. 45-000-465
Molecular Imager Gel Doc XR System	Bio-Rad	Cat. No. 1708195EDU
Nanodrop Spectrophotometer	Thermo Scientific	Cat. No. ND1000
C. elegans related1			1see reference19 for standard C. elegans culture and maintenance procedures.
LB Medium and plates2			2see reference19 for protocols.
Tryptone	Acros Organics	Cat. no. 611845000
Yeast Extract	BD Biosciences	Cat. no. 212750
NaCl	Sigma	Cat. no. S7653
Bacto Agar	BD Biosciences	Cat. no. 214040
Ampicillin	Sigma	Cat. no. A0116
Tetracycline	Fisher Scientific	Cat. no. BP912
M9 Medium2			2see reference19 for protocols.
NaCl	Sigma	Cat. no. S7653
KH2PO4	Sigma	Cat. no. P0662
Na2HPO4	Sigma	Cat. no. S7907
MgSO4	Sigma	Cat. no. M2773
NGM plates 2			2see reference19 for protocols.
NaCl	Sigma	Cat. no. S7653
Peptone	BD Biosciences	Cat. no. 211677
Tryptone	Acros Organics	Cat. no. 611845000
Bacto Agar	BD Biosciences	Cat. no. 214040
MgSO4	Sigma	Cat. no. M2773
CaCl2	Sigma	Cat. no. C3881
Cholesterol	Sigma	Cat. no. C8667
K2HPO4	Sigma	Cat. no. P3786
KH2PO4	Sigma	Cat. no. P0662
RNAi plates3			3see reference21 for protocols.
NaCl	Sigma	Cat. no. S7653
Peptone	BD Biosciences	Cat. no. 211677
Tryptone	Acros Organics	Cat. no. 611845000
Bacto Agar	BD Biosciences	Cat. no. 214040
MgSO4	Sigma	Cat. no. M2773
CaCl2	Sigma	Cat. no. C3881
Cholesterol	Sigma	Cat. no. C8667
K2HPO4	Sigma	Cat. no. P3786
KH2PO4	Sigma	Cat. no. P0662
IPTG	US Biological	Cat. no. I8500
Carbenicillin	Fisher Scientific	Cat. no. BP2648
NaOH	Fisher Scientific	Cat. no. SS266-1
Sodium hypochlorite	Fisher Scientific	Cat. no. 50371500
Bacteria
OP50 bacteria	CGC
HT115 bacteria	CGC
Genome-wide RNAi libraries
Ahringer genome-wide RNAi feeding library (ref21,58,59)	Source BioScience
C. elegans ORF-RNAi feeding library (ref60)	Source BioScience
Imaging related
Lidocaine	MP Biomedicals,LLG	Cat. no. 193917
Materials
Vacuum Grease Silicone	Beckman	Cat. no. 335148
Microscope slides	Fisher Scientific	Cat. no. 4448
Tissue culture plate, 6 well	Corning Inc.	Cat. no. 08-772-33
Equipment
SMZ-U dissecting microscope (Nikon)
SZX12 dissecting microscope (Olympus), equipped with a high-power stereo fluorescence attachment (Kramer Scientific), CCD camera with Q capture software and X-Cite fluorescent lamp (Photonic Solutions).
TCS SL Laser-scanning confocal microscope (Leica Microsystem)
C2 laser-scanning confocal mounted on an ECLIPSE Ti-E inverted microscope (Nikon)