Il canale di Excretory c. elegans come un modello per intracellulare Lumen morfogenesi e biogenesi di membrana polarizzata In Vivo in una singola cella: etichettatura di GFP-fusioni, schermata di interazione di RNAi e Imaging

Summary

Il canale escretore di c. elegans è un modello unico di singola cellula per l'analisi visiva in vivo della biogenesi della membrana de novo polarizzato. Questo protocollo descrive una combinazione di standard genetico/RNAi e approcci, adattabili per l'identificazione e la caratterizzazione di molecole dirigere tubulogenesis unicellulari e biogenesi lumen e membrana apicale di imaging.

Abstract

I quattro canali escretori c. elegans sono tubi stretti estese attraverso la lunghezza dell'animale da una singola cellula, con quasi altrettanto lontano estesa endotubes intracellulare che costruiscono e stabilizzare il lume con una membrana e submembraneous citoscheletro di carattere apicale. La cella escretore si espande la sua lunghezza circa 2.000 volte per generare questi canali, rendendo questo modello unico per la valutazione in vivo della biogenesi di membrana de novo polarizzato, morfogenesi lumen intracellulare e unicellulari tubulogenesis. Il protocollo presentato qui illustra come combinare standard di etichettatura, guadagno e perdita di-funzione genetica o interferenza del RNA (RNAi)-e approcci al microscopio per utilizzare questo modello per sezionare visivamente e funzionalmente analizzare questi processi a livello molecolare. Come esempio di un approccio d'etichettatura, il protocollo delinea la generazione di animali transgenici con proteine di fusione fluorescenti per analisi live di tubulogenesis. Come esempio di un approccio genetico, accentua i punti chiave di un visual schermo di interazione basato su RNAi progettato per modificare un fenotipo di guadagno di funzione canale cistico. I metodi specifici descritti sono come: etichetta e visualizzare i canali di esprimere proteine fluorescenti; costruire una libreria di RNAi mirata e strategize RNAi di screening per l'analisi molecolare della morfogenesi canal; valutare visivamente le modifiche di fenotipi di canale; Punteggio loro dissecando microscopia di fluorescenza; caratterizzare le componenti sottocellulari canal a risoluzione superiore mediante microscopia confocale; e quantificare i parametri visual. L'approccio è utile per l'investigatore che è interessato a sfruttare il canale escretore di c. elegans per identificare e caratterizzare geni coinvolti nei processi filogeneticamente conservati del lumen intracellulare e unicellulari morfogenesi del tubo.

Introduction

Tutti gli organi interni sono composti da tubi, cruciale per loro molte funzioni diverse, come ad esempio il trasporto e scambio di gas, liquidi e sostanze nutritive e l'escrezione dei rifiuti metabolici. Loro carattere polarizzato, con membrane apicali e lumenal distinte, è adattato a queste specifiche funzioni, e difetti nella biogenesi dei loro sistemi endo - e della membrana plasmatica sono una causa frequente di malattia umana^1,2. La maggior parte dei tubi del sistema vascolare e degli organi interni è pluricellulare e forma un lume intercellularmente; Tuttavia, tubi unicellulari, che formano il lume intracellulare, possono, ad esempio, rappresentare tanto quanto 30 – 50% dei letti capillari umano². Le membrane polarizzate di multi - e tubi unicellulari sono simili nella composizione, anche loro microdomini possono differire in base alla funzione specifica del tubo (ad es., canaliculi canale escretore contro i microvilli intestinali in Caenorhabditis elegans; Vedi che accompagna il libro su c. elegans intestinale tubulogenesis)³. I principi della biogenesi della membrana polarizzata e tubulogenesis sono conservati tra i metazoi, e un simile macchinario molecolare li dirige^1,2,4.

Il sistema escretore di c. elegans è costituito da cinque celle: poro escretore delle cellule (CE), delle cellule del condotto (DC), cellulare (PC) e due cellule della ghiandola. Ablazione del CE, DC o PC provoca l'accumulo di liquidi nella cavità del corpo e animali muoiono un precoce stadio larvale di⁵. Curiosamente, questi tre tubi unicellulari creano loro lumi in tre modi diversi: dalla cella di vuotatura (CE); avvolgimento di cellulare accoppiato con formazione di giunzione di autocellular (PC); e avvolgendo cellulare accoppiato con autofusion (DC); diversi meccanismi della morfogenesi lumen che sono tutti filogeneticamente conservate^6,7. La CE, situata sul lato sinistro laterale del bulbo pharyngeal posteriore, manda due estensioni laterali da cui si diramano i quattro canali estendere anteriormente e posteriormente (su entrambi i lati destro e sinistro) per la punta del naso del verme e coda , rispettivamente (Figura 1)^5,6,8. La CE si estende da circa 1 µm a 2 x 1.000 µm, rendendo la cellula più grande nell'animale. A livello subcellulare, il canale escretore è un semplice tubo, generato da una membrana basale diretto verso il pseudocoelom e incanalato da una membrana di lumenal (endotube). La membrana di lumenal canal si connette alla membrana lumenal condotto alla sua giunzione solo intercellulare; i canali sono altrimenti junctionless lungo la loro lunghezza (Figura 1). La membrana di lumenal canale escretore e sua submembraneous citoscheletro sono apicali, definito dalla loro composizione molecolare che ricorda la composizione della membrana apicale e citoscheletro submembraneous di tubi pluricellulari, come l'intestino, e di altri epiteli (ad es., piatto). Organelli citoplasmici, tra cui endosomal vescicolare e altri (ad es., Golgi) livello delle endomembrane è distribuiti lungo la lunghezza del canale. Inoltre, più vescicole canalicular - collegato alla membrana lumenal, e/o interconnessi o isolato - sono filettate attraverso il canale citoplasma^7,8,9,10 . Questa connessione dinamica del plasma-membrana/canalicular ulteriormente espande il sistema a membrana del canale e contribuisce a entrambi di morfogenesi e osmoregolazione del lume¹⁰. Il canale escretore pertanto costituito quasi interamente endo - e membrane plasmatiche, fornendo un eccellente modello per l'analisi della biogenesi della membrana polarizzata e la regolazione della endo-all'interfaccia della membrana plasmatica. La drammatica espansione della membrana apicale durante la morfogenesi di canal - in questo sistema di cella singola coincida con estensione lumen – permette anche di analizzare i problemi architettonici derivanti dalla necessità di stabilizzare e centrare una membrana di lumenal intracellulare . Questo protocollo si concentra sull'analisi della morfogenesi strutturale di canale tubo e di lumen e le dinamiche di membrana intracellulare necessarie per questo processo, piuttosto che sui segnali che indirizzano i movimenti delle cellule che generano la posizione della CE nella sistema escretore e costruire i suoi intricati collegamenti ad altri elementi cellulari (rivisto in⁶).

Un ulteriore vantaggio del sistema di c. elegans unicellulare canal per l'analisi della membrana polarizzata e biogenesi lumen intracellulare è la sua capacità di separare, nel tempo inerente allo sviluppo, la generazione delle diverse componenti della sue membrane e giunzioni. La CE è nato al momento della chiusura ventrale e si deposita ventro-laterale della faringe durante metà embriogenesi^5,6,8, durante il quale si verificano tempo canale laterale estensione e ramificazione. Questo è seguito dall'estensione antero-posteriore canale durante l'embriogenesi tardiva, un processo che continua nella fase L1-larvale (Figura 1). In una larva appena schiusi, la punta posteriore del canale raggiunge circa la metà del worm, completamente estendere a coda alla fine della fase L1, dopo di che il canale si allunga con il verme⁸. Crescita attiva canale ad una velocità superiore a quella della crescita dell'animale così si conclude la prima fase larvale, tuttavia, ulteriore crescita avviene in parallelo con la crescita dell'intero animale durante gli stadi larvali aggiuntive (L2 – 4). Questa impostazione offre l'opportunità di analizzare diversi passaggi della biogenesi di membrana de novo polarizzata indipendente di divisione delle cellule polarizzata o migrazione. Inoltre, permette la separazione di questo processo dall'assemblaggio di raccordi (che si verificano nell'embrione prima dell'inizio di lumen); loro esigenza esatta nella polarizzazione di membrana è ancora una questione aperta nel campo di polarità. Infine, si separa in modo univoco apicale dall'espansione di membrana basale, il processo di quest'ultimo precede l'ex nei canali escretori¹⁰. Il modello di canale escretore elegans del c. è quindi un complemento particolarmente istruttivo al modello intestinale che condivide un certo numero di questi vantaggi per l'analisi della biogenesi della membrana polarizzata, ma viene eseguito in un ambiente multicellulare (Vedi il libro d'accompagnamento sul tubulogenesis intestinale³).

Anche se selvaggio-tipo canali sono tubuli ultrasottili in questo minuscolo verme, loro lumi possono essere visualized direttamente dall'ottica di Nomarski in questo animale trasparente. Infatti, morfologie mutante canale cistico possono essere caratterizzate in animali senza etichetta usando l'ingrandimento basso microscopia, che è stato utilizzato con grande efficacia in avanti schermi genetici per identificare i geni coinvolti nella tubulogenesis¹¹di dissezione. Visualizzazione migliore della morfologia dei canali e distinzione delle loro membrane polarizzate, componenti citoscheletriche, diversi organelli intracellulari e altre strutture subcellulari, tuttavia, richiede etichettatura e maggiore potenza fluorescenti microscopia confocale e dissezione. Anche se la struttura fine dei canali pone una serie di difficoltà per l'etichettatura e la microscopia, membrane e componenti sottocellulari possono essere distinto tramite le molecole specifiche univoche per ogni vano, e gli animali possono essere montati in modo sicuro per microscopia se alcune precauzioni per evitare di introdurre artefatti (Vedi protocollo e discussione). Etichettatura può essere fatto mediante immunoistochimica nei campioni fissati, o generando vermi transgenici che esprimono le proteine di fusione fluorescenti sotto il controllo dei loro propri o escretori canal specifici promotori per l'imaging in vivo . Questo protocollo descrive la seconda tecnica di etichettatura (Vedi il documento di accompagnamento il tubulogenesis intestinale per anticorpo che macchia³).

La capacità di combinare in vivo studi perdita o guadagno di funzione con in vivo imaging analisi a singola cella di livello in tutto lo sviluppo rende il canale escretore di c. elegans un modello particolarmente forte per il molecolare e analisi cellulare del tubulogenesis unicellulari. Marcia avanti o retromarcia schermi genetici possono essere eseguiti a partire con un animale transgenico wild-type o con etichettato per identificare il canale morfogenesi fenotipi (per esempio, cisti) e loro difetti del gene sottostante. In alternativa, tali schermi possono iniziare con un fenotipo mutante (ad esempio, un canale cistico) e identificare soppressori o esaltatori di questo fenotipo per identificare i geni che interagiscono funzionalmente con il gene che causa il fenotipo mutante. Il difetto genetico che causa il fenotipo mutante può indurre una perdita (ad es., tramite omissione del gene) o un aumento (ad es., tramite una mutazione d'attivazione o tramite l'introduzione di copie del gene in eccesso) della funzione oggetto dell'inchiesta. Trasmettere la mutagenesi o RNAi sistematica schermi senza preconcetti sulla funzione del gene e permettano l'identificazione imparziale di geni coinvolti nella funzione di interesse. Data la disponibilità di RNAi genoma librerie di alimentazione, quasi ogni gene può essere facilmente abbattuto da RNAi in c. elegans, tale che ogni singolo gene di interesse o qualsiasi gruppo di geni (ad es., nelle schermate mirati) anche può essere rapidamente sondato per il loro effetto in un approccio di genetica inversa. Per dimostrare una possibile combinazione di approcci, descriviamo qui una schermata di interazione RNAi mirata, a partire con un mutante di guadagno di funzione cistica canale escretore, etichettati con la proteina fluorescente citoplasmico canale verde (GFP). Il fenotipo mutante è stato generato da una sovraespressione di erm-1, un altamente conservata di c. elegans ortholog della famiglia del linker membrana-actina ezrina-radixina-moesina (ERM), che è stato implicato nella morfogenesi del lume e della membrana organizzazione in molte specie¹². C. elegans ERM-1 si localizza lumenal membrane degli organi interni, come ad esempio il canale escretore e intestino ed è necessario per la formazione di lumen in sia¹³. Sovraespressione di ERM-1 recluta actina in eccesso e vescicole alla membrana lumenal del canale, aumentando il flusso nel lumen e generando un breve canale cistico e una membrana di lumenal aggraffata con actina ispessita sottopelo⁹. Il protocollo descrive come generare ceppi transgenici con escretivo-canal-espresso etichettato proteine di fusione (o altre proteine); come eseguire mirati schermi RNAi a partire con tali ceppi, per identificare i modificatori di un fenotipo di canale; e come analizzare visivamente i risultati di tali schermi di dissezione e confocale microscopia a fluorescenza tra cui semplici modi per quantificare tubulogenesis informativo fenotipi. Alternativa i dettagli del RNAi, regolato per i geni di tubulogenesis spesso letale e tecniche di etichettatura si trovano nel libro d'accompagnamento sulla tubulogenesis intestinale³. Tutti i metodi possono essere utilizzati in varie combinazioni per l'indagine sulle altre domande sul canale tubulogenesis.

Protocol

1. etichettatura del canale di Excretory di c. elegans di proteine di fusione fluorescenti ¹⁴

Nota: vedere il documento su tubulogenesis intestinale ³ per l'etichettatura di in situ dell'anticorpo che macchia le procedure adattabile al canale escretore. Vedere la tabella 1 per esempi di molecole dimostrati utile per la visualizzazione di c. elegans canale escretore endo - e membrane plasmatiche, tabella 2 per un esempio di espressione di guida al canale escretore, promotori e Tabella 3 per risorse per collezioni più complete di marcatori e promotori, inclusi riferimenti discutendo la selezione di diversi fluorofori.

1. Costruzione di tessuto specifico marcatore fluorescente plasmidi con enzima di restrizione basata clonazione ¹⁵
   Nota: vedere la discussione per tecniche alternative di costruzione proteine di fusione fluorescenti.
   1. Identificare la sequenza del promotore (per fusioni trascrizionali) o dell'intero gene di interesse con relativo promotore (per fusioni traslazionale) in WormBase ⁴⁴.
      Nota: per i promotori, circa 1 – 3 kilobasi (kb) sono sufficiente per la maggior parte dei geni di c. elegans. Proteine di fusione traslazionale possono essere costruiti anche inserendo un gene di interesse sotto un promotore specifico canale escretore (Vedi tabella 2).
   2. Design forward e reverse primer per l'amplificazione del promotore (per fusioni trascrizionali) e/o un gene completo con promotore (per fusioni traslazionale). Aggiungere il linker di enzima di restrizione al 5 ’ e 3 ’ le estremità dei primer.
      Nota: Scegliere gli enzimi di restrizione che sono presenti nel vettore plasmidico (ad esempio, pPD95.79) ¹⁶. Per le fusioni traslazionale, la 3 ’ linker deve essere progettato in modo che dopo digestione degli enzimi di restrizione e legatura con il vettore, il telaio dell'inserto codone sarà continuo con i codoni del fluoroforo, ad es., GFP. Uno potrebbe essere necessario aggiungere 1 o 2 basi più al tipico degli enzimi di limitazione linker ¹⁴; fare attenzione a non per creare un codone di stop.
   3. Eseguire polimerasi reazione a catena (PCR) per amplificare il promotore o full-length gene usando vermi vivi o selvaggio-tipo DNA genomico o cDNA come modello ¹⁵.
      Nota: Quando si utilizza vermi come modello, in primo luogo lisare vermi lysis buffer (buffer di PCR più proteinasi K) ¹⁷. Fase mista worm può essere utilizzato come modello. Vermi affamati possono essere utilizzati per evitare la contaminazione con DNA batterico.
   4. Eseguire agarosio (1%) elettroforesi su prodotti di PCR per identificare la dimensione corretta del prodotto amplificato.
      Nota: Se la taglia è corretta, procedere con il passo successivo. Se vengono generati più bande, migliorare le condizioni di amplificazione per produrre singola banda. Se questo non funziona, tagliare la banda corretta dal gel e purificare il DNA di metodi standard ¹⁵ e poi procedere con il passo successivo.
   5. Raccolta di limitazione di eseguire il prodotto PCR e il plasmide vettore che contiene il fluoroforo (ad esempio, pPD95.79) in provette separate dai metodi standard ¹⁵.
   6. Separare il DNAs digerito con elettroforesi su gel ed eluire il prodotto PCR e bande di DNA in provette separate di vettore.
   7. Purificare il DNAs da fette del gel con metodi standard ¹⁵. Misurare la concentrazione di DNA mediante lo spettrofotometro.
   8. Legare il prodotto PCR e del DNA di vettore con i metodi standard e trasformare il DNA ricombinante in cellule competenti di metodi standard ¹⁵.
   9. Diffondere 10 μL, 50 μL e 100 μL di cellule trasformate nei tre piatti brodo di Luria (LB) completati con ampicillina di 50 μg/mL.
      Nota: Si sono diffuse diverse quantità di cellule su diversi piatti per uno spettro delle efficienze di trasformazione. Per esempio, placcatura troppo densamente potrebbe non consentire l'isolamento di colonie se la trasformazione è efficiente.
   10. Incubare le piastre a 37 ° C durante la notte. Mattina successiva, estrarre le piastre dall'incubatrice.
       Nota: Se le colonie sono molto piccole, incubare per molte più ore.
   11. Preparazione del plasmide DNAs dalle singole colonie di metodi standard ¹⁵. Mescolare il DNA del modello e primer e inviare per il sequenziamento (in genere eseguita in un centro di assistenza di nucleo).
   12. Leggere le sequenze e verificare l'integrità del costrutto fusione.
       Nota: critico: confermare il telaio codone corretta tra il gene inserito e il gene marcatore fluorescente per fusioni di traduzione. Idealmente, sequenza del gene intero per confermare che nessuna mutazione è stata introdotta durante le procedure di legatura e di PCR.
   13. Generare altro DNA del plasmide (tramite passaggio 1.1.11) iniettabile per passaggio 1.2.
2. Generazione di animali transgenici di microiniezione di DNA per la trasformazione di germline ¹⁸
   Nota: vedere la discussione per tecniche alternative per l'introduzione di transgeni. Descritte le procedure possono essere utilizzate per generare animali transgenici che trasportano una proteina di fusione di fluorescenza o qualsiasi altra proteina di interesse. Per esempio, una proteina esogena può essere appena introdotto (ad es., un ortholog eterologa) o una proteina endogena può essere reintrodotto (ad es., nel suo corrispondente mutante di germline per il soccorso) o sovraespresso per generare un fenotipo (per esempio, iniezione di erm-1 è stato utilizzato per generare il fenotipo di sovraespressione canale cistico che funge da destinazione per modifica dallo schermo di interazione del RNAi descritto di seguito).
   1. Mix costrutto di DNA (1 – 50 ng/μL) con il plasmide marcatore del DNA (in genere 100 ng/μL), per esempio il marcatore dominante rol-6 (su1006) (Vedi 1.2.3 per opzioni di indicatore).
      Nota: critico: concentrazione di DNA iniettato deve essere determinata empiricamente per evitare l'introduzione di fenotipi artefactual (cisti, difetti di estensione, letalità) quando esprimono geni nei canali escretori che sono particolarmente sensibile all'espressione dei transgeni. Si possono, ad esempio, fare diverse miscele di plasmidi alle concentrazioni di 1 ng / µ l, 10 ng / µ l, 50 ng/μL e 100 ng/μL con 100 ng/μL rol-6(su1006) ad un intervallo di concentrazioni di prova per la generazione di un ceppo praticabile con la espressione desiderata o fenotipo (concentrazioni elevate rischiano di essere non specifico tossici per la morfogenesi del canale e può essere letale).
   2. Filtrare la miscela di DNA attraverso un filtro di 0,22 μm (micrometri) poro formato spin-x centrifuga tubo.
      Nota: Non lasciare il coperchio del tubo aperto per evitare la polvere che può bloccare gli aghi di microinjection.
   3. Microinject plasmidi ricombinanti nella gonade di vermi wild-type o mutanti con i metodi standard per la trasformazione di germline (Vedi riferimento ¹⁸ per particolari della procedura).
      Nota: Standard marcatore plasmidi sono, per esempio: rol-6(su1006), dpy-20, unc-119, pha-1. Transgeni dominante come rol-6(su1006) vengono introdotti in vermi wild-type, mentre salvataggio transgeni vengono introdotti nel loro rispettivi mutanti. Marcatore plasmidi sono co-iniettate per una facile manutenzione delle linee transgeniche poiché extracromosomico transgeni sono casualmente persi durante la divisione cellulare (Vedi 1.2.8). Durante l'iniezione di geni che codificano per le fusioni fluoroforo, si può anche utilizzare il fluoroforo, GFP, stesso come marcatore. ROL-6 induce vermi a rotolare intorno a se stessi che spesso è vantaggioso per la valutazione dei fenotipi di morfogenesi.
   4. Trasferimento iniettato worm su Escherichia coli seminato piastre Nematode crescita medio (NGM) (ad esempio, 5 vermi/piastra) (per standard c. elegans, vedere riferimento ¹⁹ procedure di cultura e di manutenzione e Tabella materiali).
   5. Incubare le piastre e lasciato progenie svilupparsi a 20 ° C per circa 3 d.
   6. Esaminare la progenie F1 sotto il microscopio per dissezione per Rol (rotolamento) worm (o qualsiasi altri iniezione specifici marker, per esempio, GFP) e scegliere rulli tpiatti individuali o.
   7. Piastre con rolling F2 animali di selezionare e confermare la presenza di fluorescenza sotto un microscopio a fluorescenza per dissezione (di solito tutti gli animali a rulli sono positivo di GFP).
      Nota: F2 rulli indicano la generazione di successo di una linea transgenica. Singole linee possono essere diversi, ad esempio, per quanto riguarda la velocità di trasmissione del transgene. È quindi utile mantenere e conservare numerose linee.
   8. Mantenere le linee transgeniche arricchendo di nuove piastre per marcatore-positivi animali.
      Nota: Il DNA iniettato è incorporato nella linea germinale come matrice extracromosomico. Velocità di trasmissione per le matrici extracromosomico sono variabile ma generalmente intorno ~ 50%. Per non perdere il ceppo, pertanto è fondamentale per arricchire manualmente linee con marcatori dominanti (ad esempio, linee non protetti da selezione negativa).
   9. Congelare linee transgeniche mediante tecniche di congelamento standard per l'archiviazione a lungo termine a-80 ° C ¹⁹.
      Nota: Transgeni sulle matrici extracromosomico possono essere integrato anche nella linea germinale di irradiazione UV in un ulteriore passaggio per resa omogenea linee ¹⁸. Ad esempio, erm-1 era integrato nella linea germinale di irradiazione UV per ottenere il ceppo di ERM-1 [+ +] fgIs2[erm-1p::erm-1;rol-6p::rol-6(su1006)] dove ogni animale trasporta il transgene, un requisito per il suo utilizzo in basati su RNAi schermata di interazione descritta di seguito. Questo ceppo è stato inoltre etichettato dal canale escretore citoplasmico GFP tramite incrocio in un ceppo contenente un vha - 1P:: transgene GFP (generato dalle stesse procedure indicate sopra; Vedi riferimento ²⁰ per basic genetica procedure quali croci) e viene definito come ERM-1 [+ +]; VHA - 1P:: ceppo GFP sotto.

2. Costruzione di una biblioteca di RNAi mirati e Design di uno schermo di interazione di RNAi per modificare un fenotipo Canal

Nota: uno schermo di interazione genetica basata su RNAi mirati è descritto che utilizza un fenotipo di canale cistico iperespressione di ricerca dei geni di morfogenesi canale escretore interagenti. Il ceppo di ERM-1 [+ +] (Vedi punto 1.2.9) serve come esempio ⁹. Questo approccio presenta solo uno dei molti possibili approcci per l'analisi genetica della morfogenesi lumen canale escretore (Vedi Introduzione e discussione per altri approcci genetici). Vedi il documento di accompagnamento il tubulogenesis intestinale ³ e riferimenti ^{17 , 21 , 22} per sfondo su RNAi, dettagli di RNAi procedure, modulazione della forza di RNAi (regolato per i geni di tubulogenesis spesso letale) e discussione di problemi tecnici connessi a RNAi. Vedere riferimento ¹⁹ per cultura di vite senza fine standard, manutenzione e tabella materiali.

1. Molecole interagenti Cerca ERM-1 (o un altro gene di interesse) in banche dati e articoli pubblicati.
   Nota: Potenziali interattori di ERM-1 dovrebbe includere tutte le molecole che sono stati sperimentalmente dimostrate funzionalmente, geneticamente o fisicamente interagire con proteine ERM in tutte le specie e/o stimate a farlo da qualsiasi in silico, throughput elevato o biologia dei sistemi approccio (vedere tabella 3 per esempi di banche dati e risorse).
2. Generare un elenco di tutti i geni e trovare c. elegans omologhi dove richiesto.
   Nota: Considerare espandendo l'elenco dei geni identificati per classi di gene, che prende in considerazione la funzione del gene di interesse e si allarga la rete per l'identificazione di interattori (ad es., per il linker di membrana-actina ERM-1, selezionare tutte le actine e molecole in relazione con l'actina).
3. Identificare il corrispondente RNAi batterica cloni in librerie di RNAi batteriche a genoma commercialmente disponibili per tutti i geni di alimentazione (ad es., Ahringer genomica di c. elegans RNAi alimentazione biblioteca ²¹; Tabella materiali)
4. Generare un foglio di calcolo per tutti i geni e loro corrispondenti RNAi targhetta e il numero di ben.
5. Pick e striscia ~ 50 RNAi cloni su piastre LB/ampicillina/tetraciclina (scelta dell'antibiotico è determinato dalla costruzione della libreria) al giorno e proseguire fino a mirati è generata RNAi libreria.
   Nota: A seconda della dimensione di biblioteca e proiettata del flusso di lavoro, omettere la generazione di una libreria completa e procedere direttamente con analisi dei lotti. Piastre possono essere memorizzati a 4 ° C, per non più di circa 2 settimane (se necessario, ri-striscia sulle nuove piastre dopo che). Al contrario, uno può generare grandi biblioteche congelati in replicati 96 pozzetti o 384 pozzetti formati per stoccaggio a lungo termine a -80 ° C.
6. Incubare le piastre a 37 ° C durante la notte. Mattina successiva, togliete le piastre dall'incubatore e negozio a 4 ° C.
7. Pick RNAi batteri da una piastra con uno stuzzicadenti sterile, mescolare i batteri con 600 μL LB/ampicillina (50 ng/μL) brodo nella microprovetta 1,5 mL, incubare le provette a 37 ° C, agitare bene per 6 h.
   Nota: Inoculare batteri RNAi nel brodo strofinando il pick (punta di uno stuzzicadenti o micropipetta) lungo il lato della provetta.
8. Seme 70 μL coltivate batteri in ogni pozzetto di RNAi a 6 pozzetti in set duplicate o triplicate. Incubare le piastre di RNAi a 22 ° C durante la notte.
   Nota: RNAi piastre vengono generati dalle procedure standard (Tabella materiali e riferimenti ^{3 , 17 , 21}) e qui utilizzati in un tessuto 6 pozzetti formato di piastra di coltura per un approccio di throughput superiore che permette ancora per la valutazione microscopica della morfogenesi canal animali vivi sulle piastre.
9. Avanti mattina, scegliere 3 L4 fase ERM-1 [+ +]; VHA - 1P:: GFP worms su ciascun pozzetto delle piastre RNAi.
   1. Per evitare la contaminazione con batteri OP50 (Vedi riferimento ¹⁹) che interferiscono con RNAi in primo luogo i vermi in un piatto NGM senza batteri di semi e lasciare gli animali a strisciare per circa 10 min. Utilizzare solo gli animali sani non morti di fame.
10. Incubare le piastre a 22 ° C per 3 d permettere agli animali di produrre progenie.
11. Examine fenotipi di canale nella progenie F1 sotto il microscopio di fluorescenza per dissezione.

3. In Vivo Imaging del c. elegans Excretory canale di microscopia di fluorescenza di dissezione e segnando di fenotipi di Tubulogenesis

1. preparare un foglio di Punteggio di fenotipo (esempio riportato nella tabella 4 e Figura 5 ).
2. Mettere la piastra di agar con vermi direttamente sotto il dissectin di fluorescenzamicroscopio di g, aprire il coperchio della piastra per la valutazione, utilizzare ingrandimento inferiore a fuoco.
   Nota: Questo protocollo viene descritto l'utilizzo di un ambito con 1.5 X e 10 X obiettivi e una gamma di zoom da 3,5 a 45 (Tabella materiali).
3. Valutare gli animali di messa a fuoco su ogni bene separatamente, partendo da ben 1 e verso il basso la piastra.
   Nota: Iniziare sempre con la valutazione dei controlli. Per esempio, un mock (vettore vuoto) controllo (RNAi HT115 batteri (vedi riferimenti ^{17 , 21}) senza o con un inserto di gene correlato) negativo e positivo del caso controlla, ad esempio, in Questo schermo di interazione, erm-1 RNAi (sopprime il fenotipo di ERM-1 [+ +]) e sma-1 / spectrin RNAi (migliora il fenotipo di canal ERM-1 [+ +]).
4. In primo luogo, esaminare generali fenotipi visibili sotto una luce intensa (per esempio: Let/letale, Clr/clear, Emb/embrionali letali, Ste/sterile, Unc/scoordinata, Dpy/losca, ecc.), quantificare il fenotipo contando il numero totale di animali e numero degli animali con il fenotipo, registrare i numeri (Vedi tabella 4).
   Nota: Per atterramenti di geni che causano i difetti che possono influire sulla valutazione dei fenotipi di canale (ad es., Emb, Ste), prendere in considerazione ripetendo l'esperimento con la condizionale, post embrionali RNAi (Vedi che accompagna il libro per procedure ³ ).
5. In secondo luogo, esaminare fenotipi di canale escretore sotto una luce fluorescente, segnare quantificabili fenotipi (ad es., la lunghezza del canale, larghezza del lume, cisti), registrare i numeri e descrivere fenotipi su un foglio di Punteggio (Vedi tabella 4, < forte classe = "xfig" > figura 5).
   Nota: Per valutare altri fenotipi sottile canale è necessaria maggiore ingrandimento con gamma di zoom. Spostare avanti e indietro tra basso e alto ingrandimento a valutare con attenzione il canale ’ s lunghezza e larghezza e qualsiasi altro fenotipo di morfogenesi di canal. Per quantificazione o semi-quantificazione dei fenotipi semplici, contare 100 animali (ad es., L4s in questa schermata di RNAi mirata; fenotipi: canal lunghezza di 1/4, 1/2, 3/4 e piena estensione dei canali posteriori e diametro del lume dei canali posteriori, piccolo le cisti (< 1/3 della larghezza degli animali), cisti di grandi dimensioni (> 1/3 della larghezza degli animali); Vedi tabella 4).
6. Acquisire immagini dei fenotipi predominanti da almeno 3 animali diversi da un microscopio montato fotocamera digitale charge coupled device (CCD) e software di imaging corrispondente (Vedi Tabella materiali)
   1. per acquisire immagini, prima attivare la fotocamera, accendere il computer collegato, fare doppio clic sull'icona del software di acquisizione immagine, un'area della piastra verme manualmente sotto ingrandimento basso a fuoco e aprire l'otturatore della fotocamera.
   2. Fare clic sul “ anteprima dal vivo ” icona del software di acquisizione di immagini sullo schermo del computer per visualizzare i vermi sullo schermo del computer, regolare il fuoco manualmente a chiaramente visualizzare i vermi sullo schermo, quindi fare clic sul “ a scatto ” icona, quindi fare clic sul “ Salva ” icona.
      Nota: Pertanto gli animali si muovono più velocemente sotto la luce fluorescente, mantenere una mano sul mouse del calcolatore pronto mentre spostando la piastra nell'area di interesse con l'altra mano. Quindi prontamente la “ a scatto ” icona per acquisire l'immagine. È solitamente possibile acquisire una buona immagine con diversi tentativi.
   3. Salvare le immagini acquisite con un nome di file corretto (includere il nome della razza, nome di clone di RNAi e data).
      Nota: Vermi di selvaggio-tipo mobile più veloce con i canali sottili e lunghe sono più difficili da immagine di mutanti. Mutanti con canali cistici e/o altri fenotipi rischiano di muoversi lentamente, facilitando così la formazione immagine. Plasmidi marcatore come Rol possono essere utile per l'imaging di tenere gli animali “ in loco ” piuttosto che lo spostamento in avanti e può anche fornire una migliore visione sul fenotipo con l'animale rotolamento intorno se.

4. Imaging del c. elegans Excretory canale ad alta risoluzione di microscopia confocale a scansione Laser

1. montaggio animali vivi
   1. collocare una piccola quantità di grasso o vaselina sulla punta di un bastoncino di cotone o sulla punta della dito indice e spalmare il grasso per generare un cerchio ultrasottile con un diametro di ~ 6 – 8 mm al centro di un vetrino pulito.
   2. Posto 6 μL 5% soluzione di lidocaina (anestetico) nel cerchio di una micropipetta.
      Nota: Una soluzione di riserva di lidocaina può essere fatta sciogliendo polvere di lidocaina in acqua. Diluire al 5% con M9 buffer ¹⁹ (Tabella materiali). È fondamentale per l'analisi del canale escretore per evitare le soluzioni di immobilizzazione comuni (ad esempio sodio azide) che causano le cisti alla rottura e che inducono canal fenotipi.
   3. Scegliere diversi animali da una piastra di RNAi e metterli nella soluzione di lidocaina da immergere il worm pick ¹⁹ nella soluzione.
      Nota: Scegliere preferibilmente animali di fase-specifici che faciliteranno il montaggio anche di spessore uniforme. Gli animali possono essere preselezionati il microscopio di fluorescenza per dissezione.
   4. Porre un coprivetrino 22 x 22 mm sulla lastra di vetro; lasciarlo materassi delicatamente il cerchio grasso.
      Nota: Non applicare alcuna pressione fisica il coprivetrino che potrebbe danneggiare la morfologia del canale, soprattutto in mutanti o vermi di RNAi trattati con canal e possibilmente altri fenotipi. È importante quindi per evitare un cerchio di grasso denso; idealmente gli animali sono delicatamente inseriti tra il vetrino e il coprioggetto.
   5. Scrivere il nome del campione sul lato glassato di vetrino. Portare immediatamente il vetrino al microscopio confocale per l'analisi del fenotipo di canale e di acquisire immagini.
      Nota: Ritardi possono provocare il danneggiamento delle cisti canal o cambiare nella morfologia lumen canal.
2. L'acquisizione immagini confocal
   1. porre il vetrino sul palco campione del microscopio confocale, concentrarsi i vermi a basso ingrandimento (X 10).
   2. Vista e selezionare animali sotto 60 X e/o 100 X obiettivi, esaminare il canale escretore ’ cellulare s e fenotipi subcellulari, ad es., lume forma e diametro, dimensione e forma delle cisti; o i componenti subcellulari etichettati per analisi, ad esempio, membrana basale, endosomal contro canalicular vescicole, citoplasma, membrana apicale/lumenal, altri organelli (Vedi discussione, Figura 2 e Figura 4).
   3. Acquisire immagini del fenotipo specifico di interesse.
      Nota: Questo protocollo descrive l'uso di un microscopio confocale (Tabella materiali) di scansione laser. Per risolvere il componenti sottocellulari nella sottile c. elegans canali escretori, gli obiettivi a maggiore ingrandimento (60 X 100 X) sono necessari. Un microscopio confocale disco rotante può essere utilizzato per acquisire immagini di lasso di tempo, ma fornisce meno confocality (Vedi discussione).
      1. Per acquisire immagini confocal, accendere il computer, fare doppio clic sul software microscopio confocale e seleziona il laser facendo clic su un'icona di laser specifico.
      2. Clic la “ scansione ” icona per visualizzare il worm focalizzato sullo schermo del computer, regolare intensità del laser attraverso la software e fare di nuovo clic su “ scan ” icona per interrompere la scansione, quindi fare clic su “ catturare ” icona per acquisire un'immagine, quindi fare clic su “ salvare ” icona.
      3. Salvare le immagini con nome di file corretto e includere nome di clone di RNAi, ceppo nome e data.
         Nota: Le immagini possono essere acquisite come singolo e più sezioni (ad esempio, 10 – 15 sezioni lungo l'asse z). Sezionamento consente la visualizzazione 3D. Acquisire immagini di proiezione e salvare separatamente se necessario (a seconda del microscopio). Per risoluzione ottimale, utilizzare impostazioni di laser con basso guadagno, non aprire pinhole troppo e aggiungere una media diversi per ogni immagine (vedi riferimenti ^{23 ,}, ²⁴ per la discussione generale dell'imaging confocale). Prendersi cura di acquisire immagini a una luminosità sotto il livello di saturazione per consentire modifiche di software di imaging, se richiesto (preferibilmente immagini di uso non modificato).
      4. Acquisire immagini della doppio - o moltiplicare i canali etichettati (ad esempio verde, rosso e blu) allo stesso modo, facendo clic sulle icone laser multipli, ma utilizzare la scansione sequenziale per evitare trapasso tra i canali (fondamentale per gli studi di co-localizzazione).
         Nota: Uno potrebbe essere necessario prendere in considerazione il tempo necessario per la scansione sequenziale (che anche risultati in un corrispondente aumento nella foto lo sbiancamento) e modificare le impostazioni dello scanner. Non eseguire la scansione animali da una diapositiva per più di 30 minuti massimo per evitare effetti aspecifici sulla morfologia del canale. Montare la nuova diapositiva se più lungo di scansione è necessaria.
      5. Acquisire corrispondente ottica differenziale di interferenza (DIC) / immagini di Nomarski, particolarmente se quantificare canal diametro lunghezza e lume in relazione il worm ’ s corpo lunghezza e diametro. Sovrapposizione di fluorescenza e Nomarski immagini cliccando su “ sovrapposizione ” icona per illustrare i punti di riferimento ( Figura 1 e Figura 4A – D).
   4. Per la quantificazione, misurare l'intensità di fluorescenza di un componente con etichettato di interesse di ImageJ software ²⁵ ( Figura 5).

Representative Results

Questo protocollo viene descritto come utilizzare i canali escretori di c. elegans analizzare visivamente e molecolarmente tubulogenesis unicellulari e morfogenesi intracellulare lume in una singola cella. Durante la loro estensione dal momento dell'embriogenesi metà fino all'età adulta, i quattro canali escretori continuano a espandere la loro basolaterale e membrane apicali/lumenal insieme al loro sistema di endomembrane canalicular ed endosomal, fornendo un modello unico per l'analisi in vivo del de novo polarizzati biogenesi della membrana (Figura 1). Componenti sottocellulari come membrane apicale, il citoplasma ed endosomal contro canalicular vescicole possono essere fruiti da esprimere proteine di fusione fluorescenti specifici (descritti nel protocollo sezione 1), e possono essere distinti da altro da raddoppiare o triplicare etichettatura in un singolo animale transgenico (Figura 2). Un fenotipo unico canale escretore (Figura 3A– B) generato overexpressing una molecola di membrana apicale connessa (ERM-1), viene utilizzato per illustrare come eseguire una schermata di RNAi mirata per identificare i geni funzionamento nella membrana apicale e biogenesi di lumen; Questo serve come un esempio di un'analisi molecolare e visivo della biogenesi della membrana polarizzata in questo modello (descritto nel protocollo sezione 2). Questo fenotipo di canal ERM-1 [+ +] viene utilizzato per illustrare come valutare visivamente e la soppressione di Punteggio (Figura 3– D) e la valorizzazione (Figura 3E– F) dissecando microscopia di fluorescenza (descritta nel protocollo sezione 3) . Fenotipi Canal indotti da modulazione dei livelli di ERM-1 servono a mostrare come risolvere difetti a livello subcellulare mediante microscopia confocale (Figura 4) (descritti nel protocollo sezione 4) e come quantificare fenotipi semplice canale (lunghezza del canale e ciste dimensioni) e difetti di biogenesi della membrana apicale (Figura 5).

Figura 1 : Morfogenesi del canale Excretory c. elegans e strutture subcellulari Canal
(A) rappresentazione schematica dell'estensione canale escretore (linee blu) durante lo sviluppo dell'embrione e della larva. La cella escretore raggiunge posizione finale sul lato sinistro di ventro-laterale del bulbo pharyngeal posteriore nella fase virgola dell'embrione (non mostrato). Come l'embrione si allunga, si estende in primo luogo due braccia lateralmente verso i lati sinistro e destro; quindi ogni braccio si biforca in un ramo anteriore e posteriore. Questi rami anteriori e posteriori estendono ulteriormente in tutto di allungamento dell'animale durante quattro stadi larvali, recuperando innanzitutto con la crescita dell'animale nella fase L2, poi accompagnando la sua crescita ulteriore, fino all'età adulta. De novo polarizzati membrana biogenesi supporta questa estensione fino all'età adulta. (B) nell'animale adulto, i rami del canale anteriore raggiungono la punta del naso e i rami posteriori, la coda (linee blu). Viene visualizzato il corpo cellulare escretore vicino la lampadina pharyngeal posteriore (blu). Domini di membrana polarizzata vengono mantenuti durante l'età adulta. (C) ampliato visualizzazioni di una sezione del braccio di canal. A sinistra: vista 3D degli spettacoli canal: membrana basale (nera), citoplasma (blu), membrana lumenal (verde) e il lume (bianco). A destra: vista sul canale e sue membrane interna: membrana basale (nera), citoplasma (blu), gli endosomi (gialli ovali), vescicole canalicular (sfere bianche, collegate con ogni altri, collegato con il lume o isolato singole vescicole), membrana apicale (verde) e il lume (bianco). (D) confocale/CIA sovrapposizione micrografie della cella escretiva in un embrione e i canali escretori in una larva, con l'etichetta di lumenal contro citoplasmico GFP, rispettivamente. Immagine a sinistra: cella escretore (freccia verde,) in un embrione di 1,5 volte, con il lume del canale visualizzato esprimendo apicale ERM-1::GFP sotto il promotore di erm-1 . Immagine a destra: quattro escretore canal rami (freccia verde,) nelle larve L3, visualizzate da citoplasmatica vha - 1P:: GFP. Scala bar = 20 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2 : Componenti sottocellulari nelle braccia di canale escretore selvaggio-tipo di visualizzazione tramite doppia etichettatura con proteine di fusione fluorescente
(A) distinguendo il citoplasma dalla membrana apicale. Espressione della GFP sotto il promotore di disporre-5 Visualizza il citoplasma canal (verde, in alto); espressione di ERM-1::mCherry sotto il proprio promotore Visualizza la membrana apicale (rosso, medio); l'Unione di queste immagini (in basso) distingue tra citoplasma e la membrana apicale che altrimenti sarebbe indistinguibile dall'etichettatura singolo anche ad alto ingrandimento. Barra della scala = 5μm. (B) determinazione dei rapporti spaziali delle vescicole endosomal al lumen. Visualizzazione del lume di un apicale associata di membrana fusione proteina GFP (pseudo colorato di rosso, top); visualizzazione delle vescicole endosomal esprimendo mCherry::RAB-7 (pseudo colorato di blu, centrale); l'Unione di queste immagini (in basso) Mostra le posizioni spaziali relative delle vescicole endosomal al lumen. Barra della scala = 5μm. (C e D) Risoluzione di forme dei tubi canal contro componenti sottocellulari canal a diversi ingrandimenti. Il citoplasma delle larve L1 è etichettato esprimendo GFP sotto il promotore di disporre-5 e vescicole citoplasmatiche canalicular esprimendo il canale acqua AQP-8::mCherry sotto il promotore di aqp-8 . (C) immagini acquisite a basso ingrandimento risolvere un modello "-su-un-stringa di perline" corrispondente alla fase-specifici varicosità (varicosità sono riserve abbondanti in vescicole canalicular e altri componenti necessari per la crescita del canale), ma fare non risolvere citoplasmico puncta AQP-8. (D) immagini acquisite a maggiore ingrandimento risolvono puncta AQP-8 nel citoplasma canal, corrispondenti alle vescicole canalicolare. Barre della scala: 20 μm in C e 5 μm in D. Tutti i pannelli mostrano confocale proiezioni di 10 – 15 sezioni ciascuna. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3 : Segnando esaltatori e soppressores di un fenotipo di canale cistico (ERM-1[++]) di microscopia di dissezione
(A) ERM-1 [+ +]; ROL-6(su1006) canali escretori sono visualizzati esprimendo GFP sotto un promotore vha-1 . Canali posteriori si estendono fino la vulva o metà corpo dell'animale (frecce; considerato come estensione di 1/2) a basso ingrandimento (1.5 X obiettivo e zoom basso). (B) a maggiore ingrandimento, il canale di aggraffato piccolo-cistica di ERM-1 [+ +] firma possa essere risolto, con la punta dei canali posteriori (un braccio indicato dalla piccola freccia) allungabile fino alla vulva o leggermente oltre (canal vulva indicato dalla freccia grande; lume in pannello D può essere considerato come wild-type per il confronto). (C) soppressione, basso ingrandimento: canali allungate e sottile nel RNAi ERM-1 [+ +] animali trattati. (D) a maggiore ingrandimento, canali posteriore possono essere visto quasi completamente estendere alla coda (piccole frecce; confrontare a quello degli animali riproduttori, mostrati nel pannello B); grande freccia indica la posizione del vulva. (E) potenziamento: ulteriormente accorciati canali con le cisti più grandi in RNAi trattati animali ERM-1 [+ +]; basso ingrandimento, senza zoom. (F) a maggiore ingrandimento, estensione del canale posteriore può essere determinato come meno di 1/2 (piccola freccia) o non estesa fino alla vulva (indicato dalla freccia grande) e il formato della ciste come superiore a 1/3 della larghezza dell'animale (più ampia di quella di quale animale genitore b). Scala bar = 400 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4 : Analisi visiva del canale escretore morfologia e componenti sottocellulari Canal in mutante/RNAi animali mediante microscopia confocale
(A-D) Distinguere un vacuolar da un fenotipo di canale cistico (sovrapposizione di confocal/CIA micrografie sono mostrati). (A) nel citoplasma di un canale di selvaggio-tipo è visualizzato da che esprimono GFP sotto il promotore di disporre-5 (pseudo-colore blu a differenza dalla membrana apicale, etichettatura, mostrato in verde nel pannello B). (B) sulla membrana apicale di un canale di selvaggio-tipo è visualizzata da esprimere ERM-1::GFP; Si noti che lume non è visibile a questo ingrandimento e quella singola etichettatura non può distinguere da etichettatura della membrana citoplasmatica. (C) fenotipo canale escretore indotta da RNAi: etichettatura citoplasmatica non può distinguere i vacuoli citoplasmici dalla presenza di cisti. (D) fenotipo canale escretore indotta da RNAi: etichettatura apicale ERM-1::GFP rileva l'accumulo di liquidi all'interno del lume, identificando le cisti (lumenal) piuttosto che i vacuoli (citoplasmatici) (confronta figura 4I per vacuoli citoplasmatici). Barra della scala = 40 μm per A – D, mostrato in a. (E-J) analizzando gli effetti di perdita e guadagno di funzione su componenti sottocellulari canal (immagini confocal di braccia di singolo canale sono indicate). (E-G) Effetto di erm-1 RNAi sulla localizzazione subcellulare dei canaliculi. Citoplasma di canale Wild-type (E) ; Nota lumen che indica l'esclusione di GFP. (F) selvaggio-tipo citoplasmatico AQP-8::GFP puncta, corrispondenti alle vescicole canalicolare. (G) citoplasmatici e spostamento basale dei puncta AQP-8::GFP in erm-1(RNAi) animale. Lume discontinuo (H) e il dettaglio della patologia di punta di lumen (curling e perdita di centratura lumen) in erm-1(mildRNAi) animale (Vedi³ per modulare la forza di RNAi); Si noti che citoplasma canal si estende oltre la punta del lume, indicato qui da piccole cisti. Vacuoli citoplasmici (I) nel corpo di canale escretore senza estensione canal in influenzata fortemente erm-1(RNAi) animale³; Si noti che ACT-5::GFP non viene reclutato al lumen (ad eccezione di alcuni piccoli granelli intorno alcuni vacuoli). (J) assunzione di eccesso ACT-5::GFP e AQP-8::mCherry al lumen in tripla animale transgenico che overexpressing ERM-1 (cintura spessa nota di ACT-5::GFP e sovrapposti AQP-8::mCherry ciuffi intorno il lume cistico). Barra della scala = 5 μm per E-J, mostrato in E. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5 : Esempi di quantificazione dei difetti di canale mediante microscopia confocale e dissezione
(A) rappresentazione schematica del wild type (pannello superiore) e mutante cistico (pannelli inferiori) canali escretori per la quantificazione della dimensione lunghezza e cisti del canale. Lunghezza di canale posteriore è quantificata come 0, 1/4, 1/2, 3/4 e 1. Lunghezza del canale '0' non indica estensione e '1' indica estensione full-length. Dimensione della ciste è quantificata come < 1/3 (piccolo) e > (grande) in 1/3 del diametro del corpo. (B) quantificazione della morfologia lordo canal in controllo ed ERM-1 [+ +](RNAi) animali da dissezione microscopia fluorescente. In finto(RNAi) ERM-1 [+ +] animali, la lunghezza del canale posteriore è circa 1/2 esteso in 95% animali (immagine di riferimento, Figura 3A– B). Negli animali di soppressore ERM-1 [+ +](RNAi) , lunghezza di canale posteriore è quasi completamente esteso a 80 – 90% animali (immagine di riferimento, Figura 3– D). Negli animali di enhancer ERM-1 [+ +](RNAi) , circa 60-70% canali hanno grandi cisti e lunghezza più corta (< 1/2) (immagine di riferimento, Figura 3E– F). I dati presentati come media ± deviazione standard (n > 3). (C) quantificazione dell'intensità di fluorescenza del citoscheletro canale apicale/lumenal di ImageJ da immagini confocal. Membrana apicale del canale è etichettata da ACT-5::GFP, braccio di selvaggio-tipo canale è mostrato al braccio sinistro, canale ERM-1 [+ +], a destra. Pannelli a sinistra: intensità di ACT-5::GFP in manica di membrana di tipo selvaggio è di circa 50 (grigio valore/membrana; indicato dalla freccia nera e rossa), grafico mostrato sotto immagine. Pannelli a destra: intensità di ACT-5::GFP in ERM-1 [+ +] è superiore a 100 (valore di grigio della membrana dorsale è di circa 110 (freccia nera), e della membrana ventrale è di circa 140 (freccia rossa)), grafico mostrato sotto immagine. Scala bar = 5 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: esempi di marcatori per la C. elegans Sistema escretore di membrana Canal
Nome della proteina	Sub

localizzazione cellulare Funzione Esempi delle varietà disponibili. Riferimenti ERM-1 dominio apicale linker membrana – citoscheletro VJ402 (fgEx13 [erm-1p::erm-1::gfp, rol-6p::rol-6(su1006)]) Ref (¹³) ACT-5 dominio apicale dell'actina apically localizzata VJ268 (fgEx12[(act-5p::act-5::gfp); unc-119 (+) e unc-119 (ed3) III]) Ref (¹³) ABTS-2 Basolaterale Trasportatore dell'anione/bicarbonato ABTS-2::GFP Ref (⁴²) DISPORRE-8 Basolaterale Sulfatepermease DISPORRE-8::GFP Ref (⁴²) VHA-1 vescicole canalicular V-ATPasi VJ535 (fgEx35 (vha-1p::vha-1::gfp; rol - 6p:: rol-6(su1006))) Rif. (⁹) VHA-5 vescicole canalicular V-ATPasi ML846 (vha-5(mc38) IV; mcEx337 [vha-5 (+):: GFP + rol-6(su1006)]) riferimento (¹⁰) AQP-8 vescicole canalicular Aquaporin, canale d'acqua VJ533 (fgEx33 (aqp-8p::aqp-8::gfp)) Rif. (⁹) RAB-5 endosomal vescicole tratta di esseri BK209 (qpIs99 (exc9p::mCherry::rab-5)) Ref (³⁶) RAB-7 endosomal vescicole tratta di esseri BK210 (qpIs100 [Pexc-9::mCherry::rab-7]) Ref (³⁶) RAB-11 endosomal vescicole tratta di esseri BK205 (qpIs97 (exc9p::mCherry::rab-11)) Ref (³⁶) ¹ Esempi sono selezionati da risorse elencate nella tabella 3.

Tabella 2: esempi di C. elegans promotori Excretory Canal-specifici
promotori	Stage di espressione
ERM-1	embrione di fase di virgola
disporre-5	3 volte embrione
VHA-1	2 volte embrione
VHA-5	2 volte embrione
AQP-8	2 volte embrione
GLT-3	fine dell'embrione
1 Esempi sono selezionati da risorse elencate nella tabella 3.

Tabella 3: risorse

Risorse per identificare le molecole di canale specifico escretore c. elegans, etichettatura di reagenti/ceppi e anticorpi

1. Caenorhabditis Genetics Center (CGC)43 per reagenti disponibili e ceppi

2. Wormbase44 per informazioni escretore canal specifiche molecole, ceppi e anticorpi

3. informazioni su molecole specifiche del canale escretore: vedere riferimento6

4. Transgeneome sito Web45 per i costrutti di fusione di GFP traslazionale

5. c. elegans espressione modello46 per i costrutti di fusione di GFP trascrizionale

6. progetto di BioResource nazionale (NBRP)::C.elegans47 per informazioni su promotori e mutanti di c. elegans

7. fluorofori: vedere riferimento48,49

Risorse basate sul Web per l'assemblaggio di molecole per una raccolta mirata di RNAi

1. GeneMANIA50

2. AceView51

3. iHOP52

4. Wormbase44

5. saccharomyces Genome Database53

6. Flybase54

7. Mouse Genome Database55

8. human Genome Database56

9. BLAST57

Tabella 4: Esempio di semplice fenotipo segnando foglio
Biblioteca di RNAi		Ceppo	Generale fenotipo (% sul totale)	Fenotipo di canale
				Lunghezza di canale < 1/2 (% L4)	Lunghezza di canale > 1/2 (% L4)	Altri fenotipo Canal	Numero totale di animali contato
Piastra n	Numero ben
I-1	A1	ERM-1 [+ +]; VHA - 1P:: GFP	CLR (30)	80	20		100
X-5	B12	stesso	nessuno	30	70		100
III-10	C5	stesso	UNC (54)	70	30	grandi cisti	100

Discussion

Versatilità genetica c. elegans , trasparenza, piano corpo semplice e stirpe delle cellule invarianti tutti ne fanno un eccellente modello per l'analisi della morfogenesi. Questo protocollo viene descritto come combinare standard manipolazioni genetiche e imaging studi per poter sfruttare il 2 micron sottile c. elegans canali escretori per studiare membrana polarizzata e biogenesi intracellulare lumen in un tubo di singola cellula.

Etichettatura
I canali escretori di c. elegans possono essere identificati mediante l'espressione delle proteine di fusione fluorescenti, permettendo analisi live (descritto qui), o di anticorpi o chimica colorazione (Vedi che accompagna il libro su tubulogenesis intestinale per la macchiatura dell'anticorpo ³). l'espressione di due o più diversi fluorofori, o la combinazione di queste diversa tecniche, di etichettatura permette per una dissezione visual di alta risoluzione di questi tubuli sottili (Figura 2). Proteine di fusione fluorescente diretti ai canali da un promotore specifico canale sono la prima scelta per l'etichettatura di canale escretore per diversi motivi, tra cui: (1) i livelli di bassa espressione di molte proteine di canale e struttura fine (2) del canale che è facilmente sopraffatto dalla macchiatura di fuori dei canali dove la proteina di interesse può essere anche espressi. D'altra parte, i canali sono sensibili alle proteine esogene e sviluppare facilmente fenotipi non specifici (ad esempio, estensione difetti e cisti o addirittura letalità) quando tali proteine sono fortemente espressi. Questo dovrebbe pesare nella decisione nella scelta tra diverse modalità di generazione di animali transgenici. In linea di principio, transgeni possono essere introdotte come extracromosomico matrici (ad es., iniettando direttamente il DNA del plasmide nella gonade di germline trasformazione, come descritto qui), che in genere genera alta-copia numero matrici (spesso con alta espressione), o integrato nel genoma, in genere al numero di copia singola o basso (ad es., da bombardamento²⁶ o via Mos1-mediata copia singola inserzione [MosSCI]²⁷). Matrici di Extrachromsomal possono anche essere integrate nel genoma in una seconda fase (ancora, tuttavia, a un numero di alta copia)¹⁸. D'altra parte, quando iniettato in linea germinale a bassa concentrazione (ad es., 1 – 2 ng / µ l DNA, combinato con una maggiore concentrazione del marcatore del DNA), matrici numero basso (anche singola) copia possono essere facilmente generato²⁸. Questo scenario ha il vantaggio che le concentrazioni di DNA possono essere variate, che può aiutare a trovare il migliore livello di espressione per l'etichettatura di canale, né troppo basso né troppo alto (tossico). La relazione tra livello di concentrazione e l'espressione del DNA iniettato dipende da molteplici fattori (ad esempio, il promotore) e così deve essere determinata empiricamente. In alternativa, il gene di interesse possa essere etichettato direttamente con un fluoroforo sulla linea germinale di cluster regolarmente sparpagliato breve palindromo si ripete (CRISPR) basata d'etichettatura procedure^29,30. Sebbene questo approccio pone il fluoroforo nel suo contesto genomico più fisiologico, questo non è sempre necessario o persino desiderabile (per esempio, quando la proteina è espressa a livelli molto bassi). Tuttavia, può essere l'opzione migliore, per esempio se il gene di interesse è molto grande.

Visualizzazione del canale è possibile indirizzando trascrizionale costrutti nel canale che metterà in evidenza il citoplasma di canale da un fluoroforo. Al contrario, etichettatura componenti sottocellulari canale richiede una fusione traslazionale dove il gene full-length è collegato nel frame per il fluoroforo codificante gene. Quando si utilizza un promotore specifico canale di espressione (piuttosto che il promotore del gene), la scelta dovrebbe essere basata sulla forza del promotore e, per l'analisi inerente allo sviluppo, al momento della sua espressione. Molti geni specifici di canale escretore non esprimono prima fase larvale quando funzione osmotico del canale diventa critico; troppo tardi per l'analisi della sua fase di estensione attiva (erm-1 e Pro-1 sono primi geni espressi)^10,13. Esempi per gli indicatori del canale escretore endo - e membrane plasmatiche e per promotori specifici canal sono riportati nelle tabelle 1 e 2, rispettivamente e risorse per reperire ulteriori molecole di canale specifico nella tabella 3. Queste risorse possono essere utilizzate anche per la ricerca di una proteina di fusione fluorescente adatto già fatti, che potrebbe essere disponibile attraverso il centro di genetica di Caenorhabditis (CGC; cfr. anche tabella 1). Per costruire plasmidi ricombinanti per l'espressione di tali fusioni di proteina, si possono usare vari metodi di duplicazione, ognuno con specifici vantaggi e svantaggi (discusso altrove¹⁴). Questi includono degli enzimi di limitazione convenzionali basato su approcci, descritti qui di clonazione, clonazione modulare utilizzando il multisito Gateway sistema³¹, Gibson gruppo³²o costruzione di gene reporter dal metodo "PCR impunture"^{14 ,33}. Questi diversi approcci possono essere adattati per il metodo selezionato per la loro introduzione nella linea germinale e/o altre esigenze specifiche (ad esempio, il Gateway versatile sistema facilita il rimescolamento dei promotori e cDNA per dimensioni maggiori approcci di etichettatura) . Cura deve essere presa per scegliere il sito di inserimento corretto per il fluoroforo (collegandola al N-rispetto al C-terminale della proteina), prendendo in considerazione la funzione della proteina di interesse.

Interferenza con la funzione del gene
Come uno dei molti modi possibili per perturbare la funzione del gene in c. elegans, questo protocollo descrive un schermo di interazione RNAi mirato progettato per modificare un fenotipo di lumen canale cistico, indotto overexpressing una componente di lumenal membrana. In questo caso specifico, che overexpressing una membrana apicale/lumenal associato marcatore come ERM-1 ha il vantaggio di guidare direttamente la tua richiesta per la destinazione desiderata: l'analisi della biogenesi della membrana apicale/lumenal intracellulare. Un fenotipo di guadagno di funzione generato da sovraespressione fornisce inoltre alcuni vantaggi quando combinato con uno schermo di interazione (RNAi) perdita di funzione come descritto qui (cfr.³⁴ per la discussione delle analisi di perdita e guadagno di funzione e la progettazione di schermi genetici). Inoltre, ERM-1 stessa è una ben studiata "morfogenesi lume" e membrana apicale identità molecola¹². Pertanto, in questo caso, uno schermo mirato (anziché imparziale) rischia di essere direttamente informato per la morfogenesi di lumen mentre simultaneamente la specifica funzione di ulteriore caratterizzante di ERM-1 in questo processo. Tuttavia, uno schermo imparziale non mirati poteva essere condotte in modo simile, a partire con un tipo selvaggio animale, un animale transgenico con fluorescently con etichettata canali escretori, o con qualsiasi mutante di canal. Il generali vantaggi e svantaggi del RNAi (ad es., contro la mutagenesi) per la generazione di fenotipi di perdita-de-funzione e la conduzione e la discussione di diversi tipi di schermi genetici in c. elegans sono discussi altrove ³⁴. RNAi produce uno spettro di fenotipi, compreso i fenotipi più lievi, un vantaggio specifico per l'analisi dei geni tubulogenesis spesso letale. Questo è descritto e discusso nel documento di accompagnamento il intestinale tubulogenesis³. Diversi approcci per generare guadagno e perdita di funzione mutanti e procedure genetiche classiche quali croci, sono dettagliate e discusso nella genetica generale metodi letteratura²⁰.

Microscopia e valutazione dei fenotipi di tubulogenesis
Valutare visivamente e segnando la modifica di un fenotipo ben definito canale sotto un fluorescenti microscopio per dissezione utilizzando parametri di Punteggio semplici (ad esempio canale lumen e lunghezza diametro), come descritto qui, può essere realizzati in un breve periodo di tempo anche quando l'elaborazione più grande numero di animali in modo mirato o sistematica genetici o schermo di RNAi. Al contrario, un simile schermo alla ricerca di fenotipi di morfogenesi romanzo canale in un ceppo che è selvaggio-tipo (fatta eccezione per il transgene canal-etichettatura), è molto più tempo, ma può, in linea di principio, essere eseguita nello stesso modo (abbiamo effettuato tale un schermo su una base di genoma in diversi mesi). Tali schermi identificherà più fenotipi di canale diverso (non mostrati qui) e pertanto deve sviluppare corrispondentemente differenti parametri di punteggio, per esempio, una classificazione qualitativa schema (Vedi ^{9,11, 35,36,37,38} per diversi modi di segnare canale fenotipi di microscopia di dissezione). Nell'interpretazione di qualsiasi fenotipo canal, è fondamentale da tenere a mente la formazione della ciste può essere un effetto non specifico di molti diversi insulti a questa struttura tubolare sottile, che è spesso un fenotipo terminal meno informativo. Formato della ciste e la posizione, d'altra parte, può essere informativi, ad esempio, una ciste vicino alla cella di canale (all'inizio dell'estensione del canale), cisti lungo la lunghezza del canale o cisti alle punte di canal, forniscono indizi per il meccanismo di fondo dei difetti. Cisti di canale (qui definite come intra-lumenal sferoidi fluido-riempita, circondati da una membrana apicale/lumenal) dovrebbero essere distinto dalle vescicole (piccola citoplasmico membrana-limitano fluido riempito sferoidi) o (allargata citoplasmico membrana-limitano i vacuoli sferoidi riempite di fluido), non circondato da una membrana di lumenal, che possono tutti sembrano superficialmente identici (Figura 4A– D). Vacuoli citoplasmici similarmente possono insorgere secondariamente, ad esempio, tramite gli effetti tossici di soluzioni (sodio azide) di montaggio. Entrambi, grandi cisti e vacuoli citoplasmatici occupano quasi le dimensioni dell'animale e hanno bisogno di essere ulteriormente distinto dal classico "clear (Clr)" canal fenotipo che è causato dall'accumulo di liquido nella cavità del corpo. Infine, lunghezza del canale è quasi sempre secondariamente compromesso nei canali cistici, pertanto un difetto di estensione canale vero deve essere dimostrata in un ambiente libero di ciste.

Nonostante i loro diametri piccoli, componenti sottocellulari di escretore, canali, come apicale contro le membrane basali, intracellulare endosomal versus canalicular vescicole, organelli intracellulari e componenti citoscheletriche, possono essere visualizzate da più in alto ingrandimento, per esempio, microscopia confocale (Figura 2, Figura 4). Di imaging confocale, un citoplasma di canale positivo GFP da solo è sufficiente per distinguere il lume dal citoplasma canale tramite una linea non fluorescenti (Figura 2A, Figura 4E). L'identità di marcatori contribuisce alla risoluzione canalicular dalle vescicole endosomal (anche in maniera sconvolgente differente in dimensioni), anche se la ripartizione definitiva richiederà immunoelectronmicroscopy³⁹. Doppie e triple etichettatura può determinare la localizzazione subcellulare di una molecola di interesse e la relazione di componenti sottocellulari a vicenda (Figura 2). Singolo con etichetta lumenal canal membrane producono la stessa linea doppia come il citoplasma o la membrana basale, ma possono essere distinto tramite doppia o tripla etichettatura. Per analisi confocale, montaggio corretto è importante, data la fragilità della struttura canal, sua sensibilità ai cambiamenti osmotici e la vulnerabilità del suo fenotipo cistico più frequente. Le cisti scoppiano facilmente con cambiamenti osmotici o pressione fisica, sono sensibili alle tossine di membrana quali sodio azide e sono inoltre sensibili ad alcuni anestetici utilizzati per immobilizzazione (che può anche produrre vacuoli citoplasmatici). Nelle nostre mani, lidocaina 5% in tampone M9 funziona meglio per più escretore canal saggi. Procedure di formazione immagine e gestione di tutto dovrebbe essere delicate, come descritto. Per evitare artefatti che imitano fenotipi (ad es., cisti e vacuoli), si consiglia di acquisire immediatamente le immagini dopo il montaggio. Se non è possibile, ciste immagini dovrebbero essere acquisite in primo luogo, prima dell'imaging di altri fenotipi. Questo protocollo viene descritto microscopia confocale scansione standard che fornisce confocality superiore, rispetto alla filatura microscopia confocale disco che, al contrario, riduce la fototossicità ed è la microscopia della scelta per l'analisi dei cambiamenti dinamici di componenti sottocellulari nel corso del tempo. Tali domande sulle dinamiche subcellulare possono essere affrontate anche utilizzando tecniche di photobleaching o proteine di fusione con fluorofori foto-commutabile che cambiano colore⁴⁰di etichettatura. Infine, la gamma di risoluzione può essere ulteriormente aumentata con l'aggiunta di microscopia elettronica a trasmissione (TEM, fornendo la massima risoluzione strutturale ma non molecolare), microscopia di Super-risoluzione (fornendo una risoluzione molecolare tra i nanometri); o immunoelectronmicroscopy (fornendo sia)^39,41. Tomografia 3D può essere combinata con le sezioni di serie TEM ed è particolarmente utile per l'analisi dell'interfaccia membrana canalicolare del plasma di canali escretori^9,10. Miglioramento delle tecniche per questi diversi tipi di microscopia e combinazioni di questi diversi approcci di imaging continua ad essere sviluppate.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cloning
Plasmid pPD95.75	Addgene	Cat. No. 37464
PCR Kit	Qiagen	Cat. No. 27106
Ligation kit	New England Biolabs	Cat. No. E2611L
DNA marker	Thermo Scientific	Cat. No. SM1331
Agarose DNA grade	Fisher Scientific	Cat. No. BP164-100
Competent cells	New England Biolabs	Cat. No. C2987H
Tris	Fisher Scientific	Cat. No. BP154-1
EDTA	Sigma	Cat. No. ED-1KG
Acetic acid	Fisher Scientific	Cat. No. A38S-500
Ethidium bromide	Fisher Scientific	Cat. No. BP1302-10
Equipments
PCR machine	MJ Research	Cat. No. PTG-200
Centrifuge	Eppendorf	Cat. No. 5415C
Water Bath	Precision Scientific	Cat. No. 666A3
Gel running instrument	Fisher Scientific	Cat. No. 09-528-165
Gel running power supply	Fisher Scientific	Cat. No. 45-000-465
Molecular Imager Gel Doc XR System	Bio-Rad	Cat. No. 1708195EDU
Nanodrop Spectrophotometer	Thermo Scientific	Cat. No. ND1000
C. elegans related1			1see reference19 for standard C. elegans culture and maintenance procedures.
LB Medium and plates2			2see reference19 for protocols.
Tryptone	Acros Organics	Cat. no. 611845000
Yeast Extract	BD Biosciences	Cat. no. 212750
NaCl	Sigma	Cat. no. S7653
Bacto Agar	BD Biosciences	Cat. no. 214040
Ampicillin	Sigma	Cat. no. A0116
Tetracycline	Fisher Scientific	Cat. no. BP912
M9 Medium2			2see reference19 for protocols.
NaCl	Sigma	Cat. no. S7653
KH2PO4	Sigma	Cat. no. P0662
Na2HPO4	Sigma	Cat. no. S7907
MgSO4	Sigma	Cat. no. M2773
NGM plates 2			2see reference19 for protocols.
NaCl	Sigma	Cat. no. S7653
Peptone	BD Biosciences	Cat. no. 211677
Tryptone	Acros Organics	Cat. no. 611845000
Bacto Agar	BD Biosciences	Cat. no. 214040
MgSO4	Sigma	Cat. no. M2773
CaCl2	Sigma	Cat. no. C3881
Cholesterol	Sigma	Cat. no. C8667
K2HPO4	Sigma	Cat. no. P3786
KH2PO4	Sigma	Cat. no. P0662
RNAi plates3			3see reference21 for protocols.
NaCl	Sigma	Cat. no. S7653
Peptone	BD Biosciences	Cat. no. 211677
Tryptone	Acros Organics	Cat. no. 611845000
Bacto Agar	BD Biosciences	Cat. no. 214040
MgSO4	Sigma	Cat. no. M2773
CaCl2	Sigma	Cat. no. C3881
Cholesterol	Sigma	Cat. no. C8667
K2HPO4	Sigma	Cat. no. P3786
KH2PO4	Sigma	Cat. no. P0662
IPTG	US Biological	Cat. no. I8500
Carbenicillin	Fisher Scientific	Cat. no. BP2648
NaOH	Fisher Scientific	Cat. no. SS266-1
Sodium hypochlorite	Fisher Scientific	Cat. no. 50371500
Bacteria
OP50 bacteria	CGC
HT115 bacteria	CGC
Genome-wide RNAi libraries
Ahringer genome-wide RNAi feeding library (ref21,58,59)	Source BioScience
C. elegans ORF-RNAi feeding library (ref60)	Source BioScience
Imaging related
Lidocaine	MP Biomedicals,LLG	Cat. no. 193917
Materials
Vacuum Grease Silicone	Beckman	Cat. no. 335148
Microscope slides	Fisher Scientific	Cat. no. 4448
Tissue culture plate, 6 well	Corning Inc.	Cat. no. 08-772-33
Equipment
SMZ-U dissecting microscope (Nikon)
SZX12 dissecting microscope (Olympus), equipped with a high-power stereo fluorescence attachment (Kramer Scientific), CCD camera with Q capture software and X-Cite fluorescent lamp (Photonic Solutions).
TCS SL Laser-scanning confocal microscope (Leica Microsystem)
C2 laser-scanning confocal mounted on an ECLIPSE Ti-E inverted microscope (Nikon)