Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

C. elegans Excretory kanalen som modell for intracellulær Lumen Morphogenesis og I Vivo polarisert membran Biogenesis i en enkeltcelle: merking av GFP-fusjoner, RNAi interaksjon skjermen og bildebehandling

Published: October 3, 2017 doi: 10.3791/56101
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1,3, 1, 1
1Mucosal Immunology and Biology Research Center, Developmental Biology and Genetics Core, Massachusetts General Hospital for Children, Harvard Medical School, 2College of Life Sciences, Jilin University, 3Faculty of Health Sciences, University of Macau

Summary

C. elegans excretory kanalen er en unik encellede modell for synlig i vivo analyse av de novo polarisert membran biogenesis. Denne protokollen beskriver en kombinasjon av standard genetisk/RNAi og imaging tilnærminger, tilpasses identifikasjon og karakterisering av molekyler regi encellede tubulogenesis og apikale membran og lumen biogenesis.

Abstract

Fire C. elegans excretory kanalene er smale rør utvides gjennom lengden på dyret fra en enkelt celle, med nesten like langt utvidet intracellulær endotubes som bygger og stabilisere lumen membranen og submembraneous cytoskeleton apikale karakter. Excretory cellen utvider sin lengde ca 2000 ganger for å generere disse kanalene, noe som gjør denne modellen unikt i vivo -vurdering av de novo polarisert membran biogenesis, intracellulær lumen morphogenesis og encellede tubulogenesis. Protokollen presenteres her viser hvordan kombinere standard merking, gevinst og tap-av-funksjon genetisk eller RNA-interferens (RNAi)-, og mikroskopiske tilnærminger bruker denne modellen til å visuelt dissekere og funksjonelt analysere disse prosesser på molekylært nivå. Som et eksempel på en etikettmetoden skisserer protokollen generering av transgene dyr med fluorescerende fusion proteiner for live analyse av tubulogenesis. Som et eksempel på en genetisk tilnærming fremhever det nøkkelpunkt av en visuell RNAi-basert samhandling skjerm designet for å endre en gevinst-av-funksjon cystisk kanalen fenotypen. De bestemte metodene beskrives slik: label og visualisere kanalene ved å uttrykke fluorescerende proteiner; lage et målrettet RNAi bibliotek og strategi RNAi screening for molekylær analyse av kanalen morphogenesis; vurdere visuelt modifikasjoner av kanalen fenotyper; score dem ved å dissekere fluorescens mikroskopi; kjennetegner subcellular kanalen komponenter med høyere oppløsning av AC confocal mikroskopi; og kvantifisere visuelle parametere. Tilnærmingen er nyttig for etterforsker som er interessert i å dra nytte av C. elegans excretory kanalen for å identifisere og karakterisere gener involvert i phylogenetically bevart prosessene av intracellulær lumen og encellede rør morphogenesis.

Introduction

Alle indre organer består av rør, avgjørende for sine mange ulike funksjoner, som transport og utveksling av gasser, væsker og næringsstoffer og utskillelse av metabolsk avfall. Deres polarisert karakter, med forskjellige apikale og lumenal membraner, er tilpasset disse bestemte funksjoner mangler i biogenesis av systemene endo- og plasma membranen er en hyppig årsak til menneskelig sykdom1,2. Fleste av rør er blodkar og indre organer er flercellede og danne en lumen intercellularly; Imidlertid kan encellede rør, som danner lumen intracellulært, for eksempel representere så mye som 30-50% av menneskelig kapillære senger2. Polarisert membraner av multi- og encellede rør er like i sammensetning, men deres microdomains kan variere basert på tuben bestemt funksjon (f.eks, excretory kanalen canaliculi mot intestinal microvilli i Caenorhabditis elegans; se medfølgende papir på C. elegans intestinal tubulogenesis)3. Prinsippene om polarisert membran biogenesis og tubulogenesis er bevart blant Metazoer, og en lignende molekylær maskiner leder dem1,2,4.

C. elegans excretory systemet består av fem celler: excretory cellen (EC), duct-cellen (DC), pore cellen (PC) og to kjertel celler. Ablasjon EC, DC eller PC fører væske opphopning i kroppens hulrom og dyr dør på en tidlig larvestadiet5. Intriguingly, disse tre encellede rør lage deres lumen på tre forskjellige måter: celle hollowing (EC); cellen innpakning kombinert med autocellular junction dannelse (PC); og av cellen innpakning kombinert med autofusion (DC); ulike mekanismer av lumen morphogenesis som alle phylogenetically bevart6,7. EF, ligger den laterale venstre bakre pharyngeal pære, sender ut to laterale utvidelser som fire kanalene armen ut til å utvide peke og posteriorly (på både høyre og venstre side) til tuppen av ormen nese og hale , henholdsvis (figur 1)5,6,8. EF går fra ca 1 µm til 2 x 1000 µm, og den største cellen i dyret. På et subcellular nivå er excretory kanalen en enkel tube, generert fra en basal membran rettet mot pseudocoelom og tunneled av en lumenal membran (endotube). Kanalen lumenal membranen kobles til rør lumenal membranen sin bare intercellulære avkjørsel; kanalene er ellers junctionless langs deres lengder (figur 1). Excretory kanalen lumenal membranen og dens submembraneous cytoskjelett er apikale, definert av molekylære sammensetningen som ligner sammensetningen av apikale membranen og submembraneous cytoskjelett flercellet rør, for eksempel tarmen, og andre (f.eksflat) epithelia. Cytoplasmatiske organeller, inkludert endosomal vesicula og andre (f.eksGolgi) endomembranes er fordelt langs kanalen. I tillegg er flere canalicular blemmer - enten koblet til lumenal membranen, og/eller sammenkoblet, eller isolert - tredd gjennom kanalen cytoplasma7,8,-9,10 . Denne dynamiske plasma-membran/canalicular tilkoblingen videre utvider kanalsystemet membran og bidrar til både lumen morphogenesis og osmoregulation10. Excretory kanalen dermed består nesten utelukkende av endo- og plasma membraner, gir en utmerket modell for analyse av polarisert membran biogenesis og regulering av endo-plasma membranen grensesnitt. Dramatisk utvidelse av apikale membranen under kanalen morphogenesis - i én celle systemet samtidig med lumen utvidelsen-kan også analysere de arkitektoniske problemene som følge av behovet for å stabilisere og sentrum en intracellulær lumenal membran . Denne protokollen fokuserer på analyse av kanalen tunnelbane og lumen's strukturelle morphogenesis og intracellulær membran dynamikken kreves for denne prosessen ikke på signaler som direkte celle bevegelser som genererer EUs posisjon i den excretory systemet og bygge sine intrikate forbindelser til andre Mobiltlf elementer (omtalt i6).

Enda en fordel av C. elegans encellede kanalen system for analyse av polarisert membran og intracellulær lumen biogenesis er dens evne til å skille, gjennom utviklingsmessige tid, generering av ulike komponenter i sin membraner og veikryss. EU er født ved ventrale nedleggelse og utligner ventro-lateralt av pharynx under midten embryogenesis5,6,8, når tid lateral kanalen forlengelse og forgrening forekomme. Dette etterfølges av anterior-posterior kanalen under sent embryogenesis, en prosess som fortsetter L1-larvestadiet (figur 1). I en nyklekte larven, bakre kanalen spissen når ca midten av ormen, fullt utvide til halen på slutten av L1 scenen, etter hvilken tid kanalen elongates sammen med ormen8. Aktiv kanal vekst med en hastighet over av dyrets vekst dermed ender på første larvestadiet, men ytterligere vekst skjer parallelt med veksten av hele dyret under den ekstra larver stadier (L2-4). Denne innstillingen gir mulighet til å analysere forskjellige trinn av de novo polarisert membran biogenesis uavhengig av polarisert celledeling eller migrering. Dessuten, det tillater separasjon av denne prosessen fra monteringen av veikryss (som forekommer i embryo før lumen Start); deres nøyaktige krav i membranen polarisering er fortsatt et åpent spørsmål i feltet polaritet. Til slutt, det unikt skiller apikale fra basale membran ekspansjon, sistnevnte prosessen før tidligere i excretory kanalene10. C. elegans excretory kanalen modellen er derfor spesielt informativ supplerer intestinal modellen som deler en rekke fordelene for analyse av polarisert membran biogenesis men utfører den i en flercellet (se det medfølgende papiret på intestinal tubulogenesis3).

Selv om vill-type kanalene ultrathin tubules i denne lille ormen, kan deres lumen visualized direkte av Nomarski optikk i denne gjennomsiktige dyr. Faktisk kan mutant cystisk kanalen morphologies være preget i umerkede dyr med lav forstørrelse dissekere mikroskopi, som har blitt brukt med stor virkning i fremover genetisk skjermene for å identifisere tilblivelse involvert inne tubulogenesis11. Forbedret visualisering av morfologi av kanalene og forskjellsbehandling av deres polarisert membraner, cellen cytoskjelett komponenter, ulike intracellulær organeller og andre subcellular strukturer, men krever merking og høyere makt lysstoffrør dissecting og AC confocal mikroskopi. Selv om kanalene fine struktur innebærer en rekke vanskeligheter for merking og mikroskopi, membraner og subcellular komponenter kan skilles via bestemte molekylene unike for hver avdeling, og dyr kan være trygt montert for mikroskopi hvis visse forholdsregler er tatt for å unngå å innføre gjenstander (se protokollen og diskusjon). Merking kan gjøres av immunhistokjemi i fast prøver, eller ved å generere transgene ormer uttrykke fluorescerende fusion proteiner under kontroll av sine egne eller excretory kanalen-spesifikke arrangører for i vivo bildebehandling. Denne protokollen beskriver den sistnevnte merking teknikken (se medfølgende avisen intestinal tubulogenesis for antistoff flekker3).

Muligheten til å kombinere i vivo tap eller vinning-av-funksjon studier med i vivo imaging analyse på enkelt cellen nivå gjennom utvikling gjør C. elegans excretory kanalen en spesielt sterk modell for den molekylære og mobilnettet analyse av encellede tubulogenesis. Fremover eller bakover genetisk skjermer kan utføres med en vill-type eller merket transgene dyr å identifisere kanalen morphogenesis fenotyper (for eksempel cyster) og deres underliggende genet defekter. Slike skjermer kan eventuelt starte med en mutant fenotypen (f.eks, en cystisk kanal) og identifisere suppressors eller enhancers av denne fenotypen identifisere gener som funksjonelt samhandler med genen forårsaker mutant fenotypen. Den genetisk defekten forårsaker mutant fenotypen kan indusere tap (f.eks, via genet sletting) eller en gevinst (f.eks via en aktivering mutasjon eller via innføringen av overflødig genet kopier) av funksjonen undersøkt. Videresender mutagenese eller systematisk RNAi skjermer uten fordommer på gen funksjon og tillate objektiv identifikasjon av tilblivelse involvert inne funksjonen av interesse. Gitt at genomet hele RNAi fôring biblioteker, kan nesten hver genet være lett slått ned av RNAi i C. elegans, slik at en enkelt genet av interesse eller grupper av gener (f.eksi målrettede skjermer) kan også være raskt analysert for deres effekt i en omvendt genetikk tilnærming. For å demonstrere en mulig kombinasjon av tilnærminger, her beskriver vi en målrettet RNAi interaksjon skjerm, starter med en gevinst-av-funksjon cystisk excretory kanalen mutant, merket med cytoplasmatiske kanalen grønne fluorescerende protein (GFP). Mutant fenotypen ble generert av overuttrykte erm-1, en høyt konservert C. elegans ortholog av membran-utgangen koblingsfunksjonalitet familien Ezrin-Radixin-Moesin (ERM), som har vært innblandet i lumen morphogenesis og membran organisasjonen i mange arter12. C. elegans ERM-1 regionaliserer å lumenal membraner av indre organer, som excretory kanalen og tarmen, og kreves for lumen formasjon i begge13. ERM-1 overuttrykte rekrutter overflødig utgangen og blemmer til kanalen lumenal membran, øke forandring i lumen og generere en kort cystisk kanal og en crimped lumenal membran med fortykket begrepsordbok underlaget9. Protokollen beskriver hvordan å generere transgene stammer med excretory-kanalen-uttrykt merket fusion proteiner (eller andre proteiner); utføre målrettet RNAi skjermer med slike stammer, identifisere modifikatorer av en kanalen fenotypen; og visuelt analysere resultatene av slike skjermer av fluorescens dissecting og AC confocal mikroskopi, inkludert enkle måter å kvantifisere informativ tubulogenesis fenotyper. Alternativ merking teknikker og detaljer om RNAi, justert til ofte dødelig tubulogenesis genene, kan finnes i tilhørende papir på intestinal tubulogenesis3. Alle metoder kan brukes i ulike kombinasjoner for etterforskningen av andre spørsmål på kanalen tubulogenesis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. merking C. elegans Excretory kanalen av fluorescerende Fusion proteiner 14

Merk: se medfølgende avisen intestinal tubulogenesis 3 for merking av i situ antistoff flekker prosedyrer tilpasses excretory kanalen. Se tabell 1 for eksempler på molekyler vist seg nyttig for å visualisere C. elegans excretory kanalen endo- og plasma membraner, tabell 2 eksempler på arrangører kjøring uttrykk til excretory kanalen, og Tabell 3 ressurser for mer omfattende samlinger av markører og arrangører, inkludert referanser diskuterer valg av forskjellige fluorophores.

  1. Bygging av vevet bestemt fluorescerende markør Plasmidene begrensning enzym basert kloning 15
    Merk: se diskusjon for alternative teknikker for å bygge fluorescerende fusion proteiner.
    1. Identifiserer rekkefølgen av arrangøren (for transcriptional fusjoner) eller hele genet av interesse med sin arrangøren (for translasjonsforskning fusjoner) WormBase 44.
      Merk: For arrangører, ca 1 – 3 kilobase (kb) er tilstrekkelig for de fleste C. elegans gener. Translasjonsforskning fusion proteiner kan også settes sammen ved å plassere en genet av interesse under en excretory kanalen bestemt promoter (se tabell 2).
    2. Design forover og bakover grunning for forsterkning av arrangøren (for transcriptional fusjoner) og/eller en full genet med arrangøren (for translasjonsforskning fusjoner). Legg til begrensning enzym linkers på 5 ’ og 3 ’ ender primerne.
      Merk: Velg begrensning enzymer som finnes i vektor plasmider (f.eks, pPD95.79) 16. For translasjonsforskning fusjoner, 3 ’ linker bør utformes slik at etter begrensning enzym fordøyelsen og ligatur med vektoren, sett inn codon rammen blir kontinuerlig med kodon av fluorophore, f.eks GFP. En må legge til 1 eller 2 mer baser i den typiske begrensning enzym linkers 14; ta vare ikke for å opprette en stopp codon.
    3. Utføre polymerase kjedereaksjon (PCR) å forsterke med arrangør eller full lengde genet bruker live ormer eller vill-type genomisk DNA eller cDNA som mal 15.
      Merk: Når du bruker ormer som mal, først lyse ormer i lyse buffer (PCR buffer pluss proteinasen K) 17. Blandet scenen ormer kan brukes som mal. Starved ormer kan brukes til å unngå forurensning med bakteriell DNA.
    4. Utføre agarose (1%) gel geleelektroforese på PCR produkter å identifisere riktig størrelse på forsterket produktet.
      Merk: Hvis bandet er riktig, Fortsett med neste trinn. Hvis flere band genereres, forbedre forsterkning forhold å produsere enkelt band. Hvis dette ikke fungerer, kuttet riktig bandet fra gel og rense av standardmetodene 15 og deretter fortsetter med neste trinn.
    5. Utføre begrensning digest PCR-produktet og vektor plasmider som inneholder fluorophore (f.eks, pPD95.79) i separate rør av standardmetodene 15.
    6. Skill fordøyd DNAs med gel geleelektroforese og elute PCR produktet og vektor DNA band i separate rør.
    7. Renser DNAs fra gel skiver av standardmetodene 15. Måle DNA konsentrasjon av spektrofotometeret.
    8. Ligate PCR produktet og vektor DNA av standard metoder og forvandle de rekombinante DNAs kompetent celler av standardmetodene 15.
    9. Spre 10 μL, 50 μL og 100 μL transformert cellene i tre individuelle Luria kjøttkraft (LB) plater med 50 μg/mL ampicillin.
      Merk: Spre ulike mengder av celler på ulike plater for et spekter av transformasjon effektivitet. For eksempel plating for tett kan ikke gi isolasjon av koloniene hvis transformasjon er effektiv.
    10. Ruge platene på 37 ° C over natten. Neste morgen, ta ut plater fra inkubator.
      Merk: Hvis koloniene er svært liten, ruge for flere timer.
    11. Forberede plasmider DNAs fra enkelt kolonier av standardmetodene 15. Bland mal DNA og grunning og sende ut for sekvensering (vanligvis utføres i en kjernen servicesenter).
    12. Lese sekvenser og bekrefte integriteten til fusion Konstruer.
      Merk: kritisk: bekrefte riktig codon rammen mellom innsatte gene og fluorescerende markør genet for oversettelse fusjoner. Ideelt sett sekvens hele genet for å bekrefte at ingen mutasjon ble introdusert under PCR og ligatur.
    13. Genererer mer plasmider DNA (med trinn 1.1.11) for injeksjon for trinn 1.2.
  2. Generasjon av transgene dyr av microinjection av DNA for germline transformasjon 18
    Merk: se diskusjonen for alternative teknikker for å innføre effekter av transgener. Disponerte prosedyrene kan brukes til å generere transgene dyr som bærer en fluorescens fusion protein eller noen andre protein av interesse. For eksempel en eksogene protein kan være nylig introduserte (f.eks en heterologous ortholog) eller en endogen protein kan gjeninnført (f.eks i sine tilsvarende germline mutant for redning) eller overexpressed for å generere en fenotypen (f.eks injeksjon erm - 1 ble brukt til å generere overuttrykte cystisk kanalen fenotypen som fungerer som mål for endring av RNAi interaksjon skjermen beskrevet nedenfor).
    1. Mix konstruere DNA (1 – 50 ng/μL) med markør plasmider DNA (vanligvis 100 ng/μL), for eksempel den dominerende markør rol-6 (su1006) (se 1.2.3 for Indikatoralternativer).
      Merk: kritisk: konsentrasjon av injisert DNA empirisk må bestemmes unngå innføring av artefactual fenotyper (cyster, utvidelse defekter, dødelighet) når uttrykke genene i excretory kanalene som er spesielt følsom til uttrykk for effekter av transgener. Man kan for eksempel gjøre flere blandinger av plasmider i konsentrasjoner av 1 ng/μL, 10 ng/μL, 50 ng/μL og 100 ng/μL med 100 ng/μL rol-6(su1006) å teste en rekke konsentrasjoner for generering av en levedyktig stamme med den ønsket uttrykk eller fenotypen (høye konsentrasjoner er sannsynlig å være nonspecifically giftig for kanalen morphogenesis og kan være dødelig).
    2. Filtrerer DNA blandingen gjennom et 0.22-μm (mikrometer) pore størrelse spin-x sentrifuge tube filter.
      Merk: Ikke la lokket på røret åpen å unngå støv som kan blokkere microinjection nålene.
    3. Microinject rekombinant plasmider i gonad av vill-type eller mutant av standardmetodene for germline transformasjon (se referanse 18 for prosedyren detaljer).
      Merk: Standard markør plasmider er, for eksempel: rol-6(su1006), dpy-20, unc-119, pha-1. Dominerende effekter av transgener som rol-6(su1006) er introdusert i vill type ormer, mens redde effekter av transgener innføres i deres respektive mutanter. Markør plasmider er co injisert for lett opprettholdelsen av transgene linjene siden extrachromosomal effekter av transgener er tilfeldig tapt under celledeling (se 1.2.8). Når sprøytebruk gener som koder for fluorophore fusjoner, kan man også bruke fluorophore, GFP, som markør. ROL-6 induserer ormer å rulle rundt seg som ofte er fordelaktig for vurdering av morphogenesis fenotyper.
    4. Overføring injisert ormer på Escherichia coli seeded Rundormer vekst Medium (NGM) plater (f.eks, 5 ormer/plate) (se referanse 19 for standard C. elegans kultur og vedlikehold og Tabell av materialer).
    5. Ruge platene og la avkom utvikle ved 20 ° C i ca 3 d.
    6. Undersøke F1 avkommet under dissecting mikroskopet Rol (bølgende) ormer (eller noen andre spesifikke injeksjon markør, f.eks GFP) og plukke valser to trykkplatene.
    7. Velg plater med rulle F2 dyr og bekrefte tilstedeværelse av fluorescens under dissecting fluorescens mikroskop (vanligvis alle roller dyr er GFP positive).
      Merk: F2 valser indikerer vellykket generering av transgene linjen. Individuelle linjer kan være annerledes, e.g. når det gjelder transgene overføringshastigheten. Det er derfor nyttig å opprettholde og lagre flere.
    8. Opprettholde transgene linjene ved berikende nye plater for markør-positive dyr.
      Merk: Injisert DNA er innlemmet i germline som en extrachromosomal matrise. Overføringshastigheter for extrachromosomal matriser er variabel men vanligvis rundt ~ 50%. Å ikke miste belastningen, det er derfor avgjørende å manuelt berike linjer med dominerende indikatorer (f.eks, linjene ikke sikret av negative utvalg).
    9. Fryse transgene linjer av frysing standardmetoder for langtidslagring-80 ° C 19.
      Merk: Effekter av transgener på extrachromosomal matriser kan også integreres i germline av UV bestråling i et ekstra trinn å gi homogen linjer 18. For eksempel erm-1 ble integrert i germline av UV bestråling hente ERM-1 [++] belastningen fgIs2[erm-1p::erm-1;rol-6p::rol-6(su1006)] hvor hvert dyr bærer transgene, et krav for bruk i den RNAi-baserte samhandling skjermen beskrevet nedenfor. Denne belastningen ble i tillegg merket cytoplasmatiske excretory kanal GFP via krysset i en stamme som inneholder en vha-1 p:: GFP transgene (generert av de samme fremgangsmåtene som skissert ovenfor, se referanse 20 Basic genetisk prosedyrer som krysser) og kalles ERM-1 [++]; vha-1 p:: GFP belastning under.

2. Byggingen av en målrettet RNAi bibliotek og utformingen av en RNAi interaksjon skjerm til å endre en kanalen fenotypen

Merk: en målrettet RNAi-basert genetisk interaksjon skjerm er beskrevet som bruker en overuttrykte cystisk kanalen fenotypen til Søk etter samspill excretory kanalen morphogenesis gener. ERM-1 [++] belastningen fungerer (se trinn 1.2.9) som eksempel 9. Denne tilnærmingen presenterer bare en av mange mulige fremgangsmåter for genetisk analyse av excretory kanalen lumen morphogenesis (se introduksjon og diskusjon for andre genetiske metoder). Se medfølgende avisen intestinal tubulogenesis 3 og referanser 17 , 21 , 22 for bakgrunnsinformasjon om RNAi, detaljer om RNAi prosedyrer, modulering av RNAi styrke (justert til ofte dødelig tubulogenesis gener) og diskusjon av tekniske problemer knyttet til RNAi. Se referanse 19 standard ormen kultur og vedlikehold og tabellen materialer.

  1. Søk etter ERM-1 (eller andre genet av interesse) samspill molekyler i databaser og publiserte artikler.
    Merk: Potensielle ERM-1 interaktører omfatter alle molekyler som ble eksperimentelt vist funksjonelt, genetisk eller fysisk samhandle med ERM proteiner i alle arter og/eller ble spådd av noen i sili, høy gjennomstrømning eller Systems biology tilnærming (se tabell 3 eksempler av databaser og ressurser).
  2. Genererer en liste over alle gener og finne C. elegans homologs der kreves.
    Merk: Vurdere å utvide listen over identifiserte gener genet klasser, som tar hensyn til funksjonen av genet av interesse og utvider nettet for å identifisere interaktører (f.eks for membran-utgangen linker ERM-1, velger du alle actins og utgangen-relaterte molekyler).
  3. Identifisere den tilsvarende RNAi bakteriell fôring kloner i kommersielt tilgjengelig genomet hele bakteriell RNAi biblioteker for alle gener (f.eks Ahringer genomisk C. elegans RNAi fôring biblioteket 21; Tabell av materialer)
  4. Genererer et regneark for alle gener og deres tilsvarende RNAi plate og brønn nummer.
  5. Plukke og strek ~ 50 RNAi kloner på LB/ampicillin/tetracycline plater (valg av antibiotika bestemmes av biblioteket construction) per dag og Fortsett til målrettet RNAi biblioteket genereres.
    Merk: Avhengig av biblioteket størrelse og prosjekterte arbeidsflyt, utelater genererer en hele biblioteket og fortsette direkte med satsvis analyse. Platene kan lagres ved 4 ° C, lenger enn ca 2 uker (om nødvendig, nytt seiersrekke på nye plater etter det). Omvendt, man kan generere større frosne biblioteker i Repliker 96-brønnen eller 384-godt for langsiktig lagring på-80 ° C.
  6. Ruge platene på 37 ° C over natten. Neste morgen, fjerne plater fra inkubator og butikk på 4 ° C.
  7. Plukke RNAi bakterier fra en plate av en steril tannpirker, bland bakterier med 600 μL LB/ampicillin (50 ng/μL) kjøttkraft i 1,5 mL microtube, ruge rørene på 37 ° C, riste for 6 h.
    Merk: Vaksinere RNAi bakterier i suppen ved å gni plukke (tannpirker eller brønnene tips) langs microtube.
  8. Frø 70 μL kultivert bakterier i hver brønn av 6-vel RNAi plater i to og tre eksemplarer setter. Inkuber RNAi platene på 22 ° C over natten.
    Merk: RNAi plater er generert av standard prosedyrer (Tabell av materialer og referanser 3 , 17 , 21) og her brukt i en 6-og vev kultur plate format for en høyere gjennomstrømming tilnærming som fortsatt tillater for mikroskopiske vurdering av kanalen morphogenesis i levende dyr på platene.
  9. Neste morgen, Velg 3 L4 scenen ERM-1 [++]; vha-1 p:: GFP ormer på hver brønn av RNAi platene.
    1. å unngå forurensning med OP50 bakterier (se referanse 19) som forstyrrer RNAi første frø ormer på en NGM plate uten bakterier og la dyrene gjennomgå i ca 10 min. Bare bruke ikke-sultet friske dyr.
  10. Ruge platene på 22 ° C til 3 d å tillate dyr å produsere avkom.
  11. Undersøke kanalen fenotyper i F1 avkom under dissecting fluorescens mikroskopet.

3. I Vivo Imaging av C. elegans Excretory kanalen fluorescens dissekere mikroskopi og Scoring av Tubulogenesis fenotyper

  1. forberede et fenotypen scoring ark (eksempel vist i Tabell 4 og figur 5 ).
  2. Plasserer agar platen med ormer direkte under fluorescens dissecting mikroskop, åpne lokket på platen for bedømmelse, bruk forstørring å fokusere.
    Merk: Denne protokollen beskriver bruken av et område med 1,5 X og 10 X mål og en bratt stigning omfang fra 3,5 til 45 (Tabell av materialer).
  3. Vurdere dyr av fokuserer på hver også separat, starter med vel 1, og arbeider ned platen.
    Merk: Alltid starte med evalueringen av kontroller. For eksempel, en uekte (tom vektor) negative kontroll (HT115 RNAi bakterier (se referanser 17 , 21) uten eller med urelaterte genet insert) og passende positiv kontroller, f.eks i denne samhandlingen skjermen, erm-1 RNAi (undertrykker ERM-1 [++] fenotypen) og sma-1 / spectrin RNAi (forbedrer ERM-1 [++] kanalen fenotypen).
  4. Først undersøke de generelle fenotyper synlig under lys (for eksempel: La/lethal, Clr/fjerne, Emb/embryonale dødelige, Ste/sterilt, Unc/ukoordinert, Dpy/Munan, etc.), kvantifisere fenotypen ved å telle antall dyr og tall dyr med fenotypen, posten tall (se Tabell 4).
    Merk: For bokseren av gener forårsaker feil som kan påvirke evaluering av kanalen fenotyper (f.eks Emb, Ste), vurdere gjenta eksperimentet med betinget, legge embryonale RNAi (se medfølgende papir for prosedyrer 3 ).
  5. Andre undersøke excretory kanalen fenotyper under fluorescerende lys, score kvantifiserbare fenotyper (f.eks, lengden på kanalen, bredden på lumen, cyster), registrere tallene og beskrive fenotyper på en scoring (se Tabell 4, < sterk class = "xfig" > figur 5).
    Merk: Høyere forstørrelse med bratt stigning omfang er nødvendig å vurdere mer subtile kanalen fenotyper. Flytte frem og tilbake mellom lav og høy forstørrelse til forsiktig vurdere kanalen ’ s lengde og bredde og noen andre kanalen morphogenesis fenotypen. For kvantifisering eller semi kvantifisering av enkel fenotyper, teller 100 dyr (f.eks, L4s i denne målrettet RNAi skjermen, fenotyper: canal lengden på 1/4, 1/2, 3/4 og full forlengelse av bakre kanaler og lumen diameteren på bakre kanalene, liten cyster (< 1/3 av dyr bredde), store cyster (> 1/3 av dyr bredde); se Tabell 4).
  6. Hent bilder av de dominerende fenotyper fra minst 3 forskjellige dyr av mikroskop montert digital kostnad - sammen enhet (CCD) kameraet og tilhørende programvare (se Tabell for materiale)
    1. hente bilder, først slår på kameraet, aktivere vedlagt datamaskinen, dobbeltklikker du ikonet image fange programvare, fokusere et område av ormen platen manuelt under lav forstørrelse og åpne kameraet nedleggelse.
    2. Klikk på den “ bo forpremière ” ikonet for image fange programvare på dataskjermen å visualisere ormer på skjermen, justere avstanden manuelt tydelig visualisere ormer på skjermen, og klikk på “ fest ” ikonet, deretter Klikk på “ lagre ” ikon.
      Merk: Dyr vil gå raskere under fluorescerende lys, derfor holde en hånd på mus klar mens du beveger platen inn i området rundt med den andre hånden. Deretter umiddelbart den “ fest ” ikon å anskaffe bildet. Er det vanligvis mulig å få et godt bilde med flere prøver.
    3. Lagre ervervet bildene med et riktig filnavn (inkluderer belastning navn, RNAi klone navn og dato).
      Merk: Raskere flytte vill-type ormer med tynn og lange kanaler er vanskeligere å bilde enn mutanter. Mutanter med cystisk kanalene og/eller andre fenotyper er sannsynlig å gå sakte, dermed tilrettelegge bildebehandling. Markør plasmider som Rol kan være nyttig for bildebehandling ved å holde dyr “ på stedet ” stedet flytte fremover, og kan også gi en bedre syn på fenotypen dyret rullende rundt selve.

4. Imaging av C. elegans Excretory kanalen med høy oppløsning av Laser skanning AC Confocal mikroskopi

  1. montering levende dyr
    1. stedet en liten mengde fett eller vaselin på spissen av en bomullspinne eller på spissen av den indeksen fingeren, og spre fett for å generere en supertynn sirkel med en diameter på ~ 6 – 8 mm i en ren objektglass.
    2. Sted 6 μL 5% lidocaine løsning (anestesi) inn i sirkelen av brønnene.
      Merk: En lidocaine lagerløsning gjøres ved oppløsning lidocaine pulver i vann. Fortynne 5% med M9 buffer 19 (Tabell for materiale). Det er viktig for analyse av excretory kanalen å unngå de vanlige immobilisering løsningene (for eksempel Natriumazid) som forårsaker cysts brudd og som induserer kanalen fenotyper.
    3. Velg flere dyr fra en RNAi plate, og plassere dem i lidocaine løsningen av immerging orm plukke 19 i løsningen.
      Merk: Velg fortrinnsvis scenen-spesifikke dyr som vil lette selv-montering av jevn tykkelse. Dyr kan være Forvalgt dissecting fluorescens mikroskopet.
    4. Plasserer en 22 x 22 mm dekkglassvæske på av objektglass, la det forsiktig bosette seg på fett sirkelen.
      Merk: Gjelde ikke noen fysisk press på dekkglassvæske som kan skade kanalen morfologi, spesielt i mutanter eller RNAi behandlet ormer kanalen og muligens andre fenotyper. Det er derfor viktig å unngå en tykk fett sirkel; ideelt dyr forsiktig klemt mellom objektglass og cover slip.
    5. Skrive navnet på prøven på siden frostet glass lysbildet. Umiddelbart ta lysbildet til AC confocal mikroskop for analyse av kanalen fenotypen og hente bilder.
      Merk: Forsinkelser kan resultere i skade for kanalen cyster eller endre i kanalen lumen morfologi.
  2. Anskaffe AC confocal bilder
    1. lysbildet på utvalg scenen av AC confocal mikroskopet, fokusere ormer ved lav forstørrelse (10 X).
    2. Vis og velg dyr under 60 X og/eller 100 X mål, undersøke excretory kanalen ’ s mobilnettet og subcellular fenotyper, f.eks, lumen form og diameter, størrelse og form av cyster, eller subcellular komponentene merket for analyse, f.eks, apikale/lumenal membran, basale membran, cytoplasma, endosomal versus canalicular blemmer, andre organeller (se diskusjon, figur 2 og Figur 4).
    3. Hent bilder av spesifikke fenotypen interessepunkter.
      Merk: Denne protokollen beskriver bruken av en laserskanning AC confocal mikroskop (Tabell for materiale). For å løse subcellular komponenter i den tynne C. elegans kreves excretory kanaler, høyere forstørrelse mål (60 X 100 X). Spinning-disk AC confocal mikroskop kan brukes til å hente tid lapse bilder, men gir mindre confocality (se diskusjon).
      1. For å erverve AC confocal bilder, slå på datamaskinen, dobbeltklikker du på AC confocal mikroskop programvare og velger laser ved å klikke på en bestemt laser ikon.
      2. Klikk på “ skanning ” ikon å visualisere fokusert ormen på skjermen, Juster laser intensitet gjennom den programvare og klikk igjen på “ skanne ” ikon å opphøre skanning, og klikk på “ fange ” ikonet for å ta et bilde, klikk på “ lagre ” ikon.
      3. Lagre bilder med riktig filnavn og inkluderer RNAi klone navn, belastning navn og dato.
        Merk: Bilder kan skaffes som enkelt og inndelingene (f.eks 10 – 15 deler langs z-aksen). Skjæring kan 3D-visualisering. Hente projeksjon bilder og lagre separat hvis nødvendig (avhengig av mikroskopet). For optimal oppløsning, bruker laser innstillingene med liten gevinst, ikke åpne pinhole for mye, og legge til flere gjennomsnitt per bilde (se referanser 23 , 24 for generell diskusjon av AC confocal imaging). Ta vare for å hente bilder på en lysstyrke under fargemetning å tillate endring av bildebehandlingsprogrammer hvis nødvendig (fortrinnsvis bruk uendret bilder).
      4. Hente bilder av dobbel - eller multiplisere merket kanaler (f.eks grønn, rød og blå) på samme måte, ved å klikke på flere laser ikoner, men Bruk sekvensiell skanning for å unngå gjennomslag mellom kanaler (kritisk for co lokalisering studier).
        Merk: En må ta hensyn til tiden som kreves for sekvensiell skanning (som også fører til en tilsvarende økning i Foto bleking) og endre skannerinnstillingene. Ikke Skann dyr fra ett lysbilde i mer enn 30 min maksimal å unngå uspesifikke effekter på kanalen morfologi. Montere nytt lysbilde hvis lengre skanning kreves.
      5. Kjøpe tilsvarende differensial forstyrrelser optikk (DIC) / Nomarski bilder, spesielt hvis kvantifisere kanalen lengde og lumen diameter i forhold til ormen ’ s kropp lengde og diameter. Overlegg fluorescens og Nomarski bilder ved å klikke på “ overlegg ” ikon å demonstrere landemerker ( figur 1 d og figur 4A – D).
    4. For kvantifisering, måle fluorescens intensiteten av en merket del av interesse ved ImageJ programvare 25 ( figur 5C).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne protokollen beskriver hvordan du bruker C. elegans excretory kanalene å visuelt og molecularly analysere encellede tubulogenesis og intracellulær lumen morphogenesis i en enkelt celle. Under filtyper fra tidspunktet for midt embryogenesis til voksen fortsetter fire excretory kanalene å utvide sin basolateral og apikale/lumenal membraner sammen med deres canalicular og endosomal endomembrane system, som gir en unik modell for i vivo analyse av de novo polarisert membran biogenesis (figur 1). Subcellular komponenter som apikale membraner, cytoplasma og endosomal versus canalicular blemmer kan visualiseres ved å uttrykke spesifikke fluorescerende fusion proteiner (beskrevet i protokollen del 1), og de kan skilles fra hverandre av dobbel eller trippel merking i en enkelt transgene dyr (figur 2). En unik excretory kanalen fenotypen (figur 3A-B) generert av overexpressing en apikale membran forbundet molekyl (ERM-1), brukes til å vise hvordan du utfører en målrettet RNAi skjerm for å identifisere tilblivelse fungerer i apikale membran og lumen biogenesis; Dette fungerer som et eksempel på en molekylære og visuell analyse av polarisert membran biogenesis i denne modellen (beskrevet i protokollen inndeling 2). Denne ERM-1 [++] kanalen fenotypen brukes til å demonstrere hvordan du visuelt evaluere og score undertrykkelse (Figur 3 c-D) og ekstrautstyr (figur 3E-F) ved å dissekere fluorescens mikroskopi (beskrevet i avsnitt 3-protokoll) . Kanalen fenotyper indusert av modulering av ERM-1 nivåene tjene til å vise hvordan å løse feil på subcellular nivå av AC confocal mikroskopi (Figur 4) (beskrevet i protokollen seksjon 4), og hvordan å kvantifisere enkel kanalen fenotyper (kanalen lengde og cyste størrelse) og apikale membran biogenesis feil (figur 5).

Figure 1
Figur 1 : Morphogenesis C. elegans Excretory kanalen og Subcellular kanalen strukturer
(A) skjematisk fremstilling av excretory kanalen forlengelsen (blå linjer) under utvikling av embryoet og Larven. Excretory cellen når sin endelige plassering ventro-lateral venstre bakre pharyngeal pære på komma scenen av embryoet (vises ikke). Så fosteret elongates, den første strekker seg to armer sidelengs mot venstre og høyre side; deretter bifurcates hver arm i en fremre og bakre gren. Disse fremre og bakre grener utvide ytterligere gjennom forlengelse av dyret under fire larver stadier, først fanger opp med dyr vekst på L2 scenen, deretter følger videre veksten, fram til voksen alder. De novo polarisert membran biogenesis støtter denne filtypen til voksen alder. (B) i voksen dyr, anterior kanalen greinene nå nesetippen og bakre grener, halen (blå linjer). Excretory celle kroppen vises nær bakre pharyngeal pære (blå). Polarisert membran domener vedlikeholdes voksen. (C) utvidet utsikt over en kanal armen delen. Venstre: 3D-visning av kanalen viser: basale membran (svart), cytoplasma (blå), lumenal membran (grønn) og lumen (hvit). Høyre: inne utsikt over kanalen og dens membraner: basale membran (svart), cytoplasma (blå), endosomes (gul ovaler), canalicular blemmer (hvite kuler, koblet til hver andre, koblet til lumen eller isolert enkelt blemmer), apikale membran (grønn) og lumen (hvit). (D) Confocal/DIC overlegg micrographs av excretory cellen i et embryo og excretory kanalene i en larve, merket av lumenal versus cytoplasmatiske GFP, henholdsvis. Venstre bilde: excretory celle (grønn, pil) i en 1.5-fold embryo, med kanalen lumen visualisert ved å uttrykke apikale ERM-1::GFP under erm-1 arrangøren. Høyre bilde: fire excretory canal filialer (grønn, pil) i L3 larvene, visualisert ved cytoplasmatiske vha-1 p:: GFP. Skalere barer = 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Visualisere Subcellular komponenter i vill-type Excretory kanalen armene av dobbel merking med fluorescerende Fusion proteiner
(A) skille cytoplasma fra apikale membranen. Uttrykk for GFP under sulp-5 arrangøren visualiserer kanalen cytoplasma (grønn, øverst). uttrykk for ERM-1::mCherry under sin egen promoter visualiserer apikale membranen (rød, midten); slå sammen disse bildene (nederst) skiller mellom cytoplasma og apikale membranen som ellers ville være utvisket ved enkelt merking med på forstørring. Skala Bar = 5μm. (B) å avgjøre endosomal blemmer til lumen romlige forhold. Visualisering av lumen av en apikale membran-assosiert GFP fusion protein (pseudo farget til rød, toppen); visualisering av endosomal blemmer ved å uttrykke mCherry::RAB-7 (pseudo farget til blå, midten); slå sammen disse bildene (nederst) viser relative romlige plasseringen av endosomal blemmer til lumen. Skala Bar = 5μm. (C og D) Løse kanalen tube figurer versus subcellular kanalen komponenter ved ulike forstørrelser. Cytoplasm i L1 Larvene er merket ved å uttrykke GFP under sulp-5 arrangøren og cytoplasmatiske canalicular blemmer ved å uttrykke vann kanalen AQP-8::mCherry under aqp-8 arrangøren. (C) bilder kjøpt til forstørring løse et "perler-på-en-streng" mønster tilsvarende scenen-spesifikke varicosities (varicosities er reservoarer rikelig i canalicular blemmer og andre komponenter kreves for kanalen vekst), men gjør ikke løse cytoplasmatiske AQP-8 puncta. (D) bilder ervervet ved høyere forstørrelse løse AQP-8 puncta i kanalen cytoplasma, tilsvarer canalicular blemmer. Skala: 20 μm i C og 5 μm i D. Alle paneler Vis AC confocal anslag av 10-15 deler hver. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Scoring Enhancers og Suppressors av en cystisk kanalen fenotypen (ERM-1[++]) av Dissecting mikroskopi
(A) ERM-1 [++]; ROL-6(su1006) excretory kanalene er visualisert ved å uttrykke GFP under en vha-1 promoter. Bakre kanalene utvide til vulva eller midt i kroppen på dyret (piler, anses som 1/2 forlengelse) på forstørring (1,5 X mål og lave zoom). (B) på høyere forstørrelse, signatur ERM-1 [++] små-cystisk crimped kanalen kan løses med spissen av bakre kanalene (en arm angitt med liten pil) utvider opp vulva eller litt utover (canal vulva angitt med stor pil; lumen i D-panelet kan betraktes som wild type for sammenligning). (C) undertrykkelse, lav forstørrelse: langstrakt og tynn kanalene i RNAi behandlet ERM-1 [++] dyr. (D) på høyere forstørrelse, bakre kanalene ses nesten fullt utvidet halen (små pilene, sammenlignet med overordnede dyrene, vises i panelet B); store piler angir plasseringen av vulva. (E) ekstrautstyr: ytterligere forkortet kanaler med større cyster i RNAi behandlet ERM-1 [++] dyr; lav forstørrelse uten zoom. (F) på høyere forstørrelse, bakre kanalen utvidelse kan bestemmes som mindre enn 1/2 (liten pil) eller ikke utvidet til vulva (angitt med stor pil) og cyste størrelse som overstiger 1/3 av dyrets bredde (bredere enn det overordnede dyr vises i B). Skalere barer = 400 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Visuell analyse av Excretory kanalen morfologi og Subcellular kanalen komponenter i Mutant/RNAi dyr av AC Confocal mikroskopi
(A-D) Skille en mer fra en cystisk kanalen fenotypen (AC confocal/DIC overlegg micrographs vises). (A) cytoplasm i en vill-type-kanal er visualisert ved å uttrykke GFP under sulp-5 arrangøren (pseudo farget til blå til forskjell fra apikale membran merking, vises i grønt i panelet B). (B) apikale membranen av en vill-type-kanal er visualisert ved å uttrykke ERM-1::GFP; Merk at lumen vises ikke med denne forstørrelsen og at enkelt merking kan ikke skille cytoplasmatiske fra membranen merking. (C) Excretory kanalen fenotypen indusert av RNAi: cytoplasmatiske merking kan ikke skille cytoplasmatiske vacuoles fra intralumenal cyster. (D) Excretory kanalen fenotypen indusert av RNAi: apikale ERM-1::GFP merking oppdager væske opphopning i lumen, identifisere (lumenal) cyster i stedet for (cytoplasmatiske) vacuoles (sammenligne figur 4I for cytoplasmatiske vacuoles). Skala Bar = 40 μm for A-D, vises i A. (E-J) analysere tap og gevinst-av-funksjon effekter på subcellular canal komponenter (AC confocal bilder av enkelt kanalen armene vises). (E-G) Effekten av erm-1 RNAi på den subcellular lokaliseringen av canaliculi. (E) vill-type kanalen cytoplasma; Merk GFP utelukkelse angir lumen. (F) vill-type cytoplasmatiske AQP-8::GFP puncta, tilsvarer canalicular blemmer. (G) Cytoplasmic og basale forskyvning av AQP-8::GFP puncta i erm-1(RNAi) dyr. (H) usammenhengende lumen og detaljer i lumen tips patologi (curling og tap av lumen sentrering) i erm-1(mildRNAi) dyr se (3 for modulerende RNAi styrke); Merk at kanalen cytoplasma strekker seg utover spissen av lumen, her angitt av små cyster. (I) cytoplasmatiske vacuoles i excretory kanalen kroppen uten noen kanalen utvidelse i sterkt påvirket erm-1(RNAi) dyr3; Merk at ACT-5::GFP ikke er rekruttert til lumen (unntatt flere små flekker rundt noen vacuoles). (J) rekruttering av overflødig ACT-5::GFP og AQP-8::mCherry til lumen i trippel transgene dyr overexpressing ERM-1 (Merk tykke belte ACT-5::GFP og overlappende AQP-8::mCherry-klumper rundt cystisk lumen). Skala Bar = 5 μm for E-J, vises i E. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : Eksempler for kvantifisering av kanalen feil av Dissecting og AC Confocal mikroskopi
(A) skjematisk fremstilling av vill-type (øvre panel) og mutant cystisk (nedre paneler) excretory kanaler for kvantifisering av kanalen lengde og cyste størrelse. Bakre kanalen lengde er kvantifisert som 0, 1/4, 1/2, 3/4 og 1. Kanalen lengde '0' angir ingen utvidelse og '1' viser full lengde forlengelsen. Cyste størrelse er kvantifisert som < 1/3 (liten) og > 1/3 (stor) av kroppen diameter. (B) kvantifisering av brutto kanalen morfologi i kontroll og ERM-1 [++](RNAi) dyr av fluorescerende dissekere mikroskopi. I uekte(RNAi) ERM-1 [++] dyr er bakre kanalen lengden ca 1/2 utvidet i 95% dyr (referanseavbildningen figur 3A-B). Suppressor ERM-1 [++](RNAi) dyr, er bakre kanalens lengde nesten fullstendig utvidet i 80-90% dyr (referanseavbildningen, Figur 3 c-D). I enhancer ERM-1 [++](RNAi) dyr, ca 60-70% kanalene ha stor cyster og kortere lengde (< 1/2) (referanseavbildningen figur 3E-F). Dataene presenteres som betyr ± SD (n > 3). (C) kvantifisering av fluorescens intensiteten av apikale/lumenal kanalen cytoskeleton av ImageJ fra AC confocal bilder. Kanalens apikale membranen er merket av ACT-5::GFP, vill-type kanalen arm er vist til venstre, ERM-1 [++] kanalen armen, til høyre. Venstre panel: intensiteten av ACT-5::GFP i vill type membran ermet er ca 50 (grå verdi/membran, angitt med svart og rød pil), plottet vises under bildet. Rett paneler: intensiteten av ACT-5::GFP i ERM-1 [++] er over 100 (grå dorsal membranen er ca 110 (svart pil) og ventrale membranen er ca 140 (rød pil)), plottet vises under bildet. Skalere barer = 5 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tabell 1: eksempler på markører for den C. elegans Kanalen membran urinveier
Protein navn Sub
mobilnettet lokalisering Funksjonen Eksempler på tilgjengelige stammer Referanser ERM-1 apikale domene membranen-cytoskjelett koblingsfunksjonalitet VJ402 (fgEx13 [erm-1p::erm-1::gfp, rol-6p::rol-6(su1006)]) REF (13) ACT-5 apikale domene apically lokalisert utgangen VJ268 (fgEx12[(act-5p::act-5::gfp), unc-119 (+), unc-119 (ed3) III]) REF (13) ABTS-2 Basolateral Anion/bikarbonat transporter ABTS-2::GFP REF (42) SULP-8 Basolateral Sulfatepermease SULP-8::GFP REF (42) VHA-1 canalicular blemmer V-ATPase VJ535 (fgEx35 (vha-1p::vha-1::gfp, rol - 6p:: rol-6(su1006))) REF (9) VHA-5 canalicular blemmer V-ATPase ML846 (vha-5(mc38) IV, mcEx337 [vha-5 (+):: GFP + rol-6(su1006)]) REF (10) AQP-8 canalicular blemmer aquaporin, vann kanal VJ533 (fgEx33 (aqp-8p::aqp-8::gfp)) REF (9) RAB-5 endosomal blemmer menneskehandel BK209 (qpIs99 (exc9p::mCherry::rab-5)) REF (36) RAB-7 endosomal blemmer menneskehandel BK210 (qpIs100 [Pexc-9::mCherry::rab-7]) REF (36) RAB-11 endosomal blemmer menneskehandel BK205 (qpIs97 (exc9p::mCherry::rab-11)) REF (36) 1 Eksempler er valgt fra ressursene som er oppført i tabell 3.

Tabell 2: eksempler på C. elegans Excretory Canal-spesifikke arrangører
arrangører Uttrykket scenen
erm-1 komma scenen embryo
sulp-5 3-fold embryo
vha-1 2-fold embryo
vha-5 2-fold embryo
aqp-8 2-fold embryo
Nick-3 sen embryo
1 Eksempler er valgt fra ressursene som er oppført i tabell 3.

Tabell 3: ressurser
Ressurser for å identifisere C. elegans excretory kanalen-spesifikke molekyler, merking reagenser/stammer og antistoffer
1. Caenorhabditis genetikk Center (CGC)43 tilgjengelig reagenser og stammer
2. Wormbase44 for informasjon om excretory kanalen-spesifikke molekyler, stammer og antistoffer
3. informasjon om excretory kanalen-spesifikke molekyler: se referanse6
4. Transgeneome nettstedet45 for translasjonsforskning GFP fusion konstruksjoner
5. C.elegans uttrykk mønster46 for transcriptional GFP fusion konstruksjoner
6. national BioResource Project (NBRP)::C.elegans47 for informasjon på C. elegans mutanter og arrangører
7. Fluorophores: se referanse48,49
Web-baserte ressurser for montering molekyler for et målrettet RNAi bibliotek
1. GeneMANIA50
2. AceView51
3. iHOP52
4. Wormbase44
5. saccharomyces genomet Database53
6. Flybase54
7. musen genomet Database55
8. menneskelige genom Database56
9. BLAST57

Tabell 4: Eksempel på enkel fenotypen Scoring ark
RNAi bibliotek Belastning General fenotypen (% totalt) Kanalen fenotypen
Kanalen lengde < 1/2 (% L4) Kanalen lengde > 1/2 (% L4) Andre kanalen fenotypen Totalt antall dyr telt
Plate uten Brønn nummer
I-1 A1 ERM-1 [++]; vha-1 p:: GFP CLR (30) 80 20 100
X-5 B12 samme ingen 30 70 100
III-10 C5 samme UNC (54) 70 30 store cyster 100

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

C. elegans genetisk allsidighet, åpenhet, enkel kroppen planen og konstant celle avstamning alle gjør det til en utmerket modell for analyse av morphogenesis. Denne protokollen beskriver hvordan kombinere standard genetisk manipulasjon og tenkelig studier for å dra nytte av de 2 mikron tynn C. elegans excretory kanaler for å studere polarisert membran og intracellulær lumen biogenesis i en enkelt celle rør.

Merking
C. elegans excretory kanalene kan merkes uttrykk for fluorescerende fusion proteiner, tillater live analyse (beskrevet her), eller antistoffer eller kjemiske flekker (se medfølgende papir på intestinal tubulogenesis til antistoff farging 3). uttrykk for to eller flere forskjellige fluorophores, eller en kombinasjon av disse forskjellige merking teknikker, gir en høy oppløsning visual Disseksjon av disse tynne tubules (figur 2). Fluorescerende fusion proteiner rettet mot kanalene av en kanalen bestemt arrangøren er førstevalget for excretory kanalen merking av flere grunner, blant dem: (1) lavt uttrykk nivåer av mange kanalen proteiner og (2) kanalen fine struktur som er lett overveldet av flekker utenfor kanalene der protein rundt kan også uttrykkes. På den annen side, kanalene er følsomme for eksogene proteiner og utvikle uspesifikke fenotyper (f.eksforlengelsen feilene og cyster og selv dødelighet) når slike proteiner er sterkt uttrykt. Dette bør veie i beslutningsprosessen når du velger mellom ulike måter å generere transgene dyr. I prinsippet kan effekter av transgener innføres som extrachromosomal matriser (f.eksved direkte injeksjon av plasmider DNA i gonad for germline transformasjon, som beskrevet her), som vanligvis genererer høy-kopi nummer matriser (ofte med høy uttrykk), eller integrert i genomet, vanligvis i lav eller enkelt nummer (f.eksved bombardement26 eller via Mos1-mediert enkeltutgave innsetting [MosSCI]27). Extrachromsomal matriser kan også integreres i genomet under det andre trinnet (fortsatt, men på noen høy kopi)18. Derimot, når det injiseres i germline ved lav konsentrasjon (f.eks1 – 2 ng/µL DNA, kombinert med en høyere konsentrasjon av markør DNA), kan lav (selv enkelt) kopi nummer matriser være lett genererte28. Dette scenariet har fordelen at DNA konsentrasjoner kan varieres, som kan hjelpe deg med å finne det beste uttrykk nivået for kanalen merking, verken for lav eller for høy (giftig). Forholdet mellom injisert DNA konsentrasjon og uttrykket er avhengig av flere faktorer (f.eks, arrangøren), og dermed må være empirisk bestemt. Alternativt kan genet av interesse direkte merkes med en fluorophore i germline ved klynge jevnlig ispedd kort Palindromic gjentar (CRISPR) basert merking prosedyrer29,30. Selv om fluorophore plasseres i sin mest fysiologiske genomisk sammenheng, er dette ikke alltid nødvendig eller til og med ønskelig (f.eks når protein uttrykkes på svært lave nivåer). Det kan imidlertid være det beste alternativet, for eksempel hvis genet av interesse er svært store.

Kanalen visualisering kan oppnås ved å dirigere transcriptional konstruksjoner i kanalen som vil markere kanalen cytoplasma av en fluorophore. Derimot krever merking subcellular kanalen komponenter en translational fusjon hvor full lengde genet er koblet i ramme fluorophore koding genet. Når du bruker en kanalen bestemt pådriver for uttrykk (i stedet for genet egen arrangøren), bør valg være basert på selskapets styrke og, for utviklingsmessige analyse, tidspunktet for uttrykket. Mange excretory kanalen bestemte gener uttrykke ikke før larvestadiet når kanalens osmotisk funksjonen blir avgjørende; for sent for analyse av sin aktive forlengelsen fase (erm-1 og proffene-1 er tidlig uttrykt gener)10,13. Eksempler for markører av excretory kanalen endo- og plasma membraner og kanalen bestemt arrangører er gitt i tabell 1 og 2, henholdsvis og ressurser for å finne flere kanalen-spesifikke molekyler i tabell 3. Disse ressursene kan også brukes for å finne en allerede gjort egnet fluorescerende fusion protein, som er tilgjengelig gjennom Caenorhabditis genetikk Center (CGC; se også tabell 1). For å konstruere rekombinant plasmider for uttrykket av slike protein fusjoner, kan man bruke forskjellige kloning metoder, hver med bestemte fordeler og ulemper (nevnt14). Disse inkluderer vanlig begrensning enzym basert kloning tilnærminger, beskrevet her, modulære Klon bruker multisite Gateway system31, Gibson montering32eller reporter genet bygging av "PCR søm" metoden14 ,33. Disse ulike tilnærminger kan tilpasses metoden valgt for innføring i germline og/eller andre behov (for eksempel allsidig gatewayen system forenkler shuffling av arrangørene og cDNAs for større skala merking tilnærminger) . Omsorg må tas for å velge riktig inn området for fluorophore (knytte det på N-kontra C-terminus av protein), hensyntatt funksjonen av protein av interesse.

Interferens med gen funksjon
Som en av mange mulige måter å forurolige gen funksjon i C. elegans, beskriver denne protokollen en målrettet RNAi interaksjon skjerm beregnet endre en cystisk kanalen lumen fenotype, indusert av overexpressing en lumenal membran komponent. I dette konkrete tilfellet, overexpressing en apikale/lumenal membran assosiert markør som ERM-1 har fordelen av direkte guiding forespørselen til ønsket mål: analyse av intracellulær apikale/lumenal membran biogenesis. En gevinst-av-funksjon fenotypen generert av overuttrykte gir også visse fordeler kombinert med tap-av-funksjon (RNAi) samhandling skjerm som beskrevet her (se34 for diskusjon av tap og vinning-av-funksjon analyser og utformingen av genetisk skjermer). Videre ERM-1 selv er en godt undersøkt "lumen morphogenesis" og apikale membran identitet molekyl12. Derfor, i dette tilfellet en målrettet (i stedet for objektiv) skjerm er trolig være direkte informativ for lumen morphogenesis mens samtidig ytterligere karakteriserer ERM-1's spesifikk funksjon i denne prosessen. Men kunne en upartisk ikke-målrettede skjerm utføres på en lignende måte, starter med en vill type dyr, en transgene dyr med fluorescently merket excretory kanaler, eller med noen kanalen mutant. De generelle fordelene og ulempene av RNAi (f.eksversus mutagenese) for generering av tap-av-funksjon fenotyper, og ledning og diskusjon av forskjellige typer genetisk skjermer i C. elegans blir diskutert andre steder 34. RNAi produserer et spekter av fenotyper, inkludert mildere fenotyper, en bestemt fordel for analyse av ofte dødelig tubulogenesis gener. Dette er beskrevet og diskutert i tilhørende papir på intestinal tubulogenesis3. Måter å generere gevinst og tap-av-funksjon mutanter og klassisk genetisk prosedyrer som kors, er detaljert og diskutert i generelle genetikk metoder litteratur20.

Mikroskopi og evaluering av tubulogenesis fenotyper
Visuelt evaluering og scoring endring av en veldefinert kanalen fenotypen under en fluorescerende dissekere mikroskopet ved hjelp av enkle scoring parametere (for eksempel kanalen lengde og lumen diameter), som beskrevet her, kan oppnås i en kort periode selv ved behandling av større antall dyr på en målrettet eller systematiske genetisk eller RNAi skjermen. Derimot en lignende skjermen romanen kanalen morphogenesis fenotyper i en stamme som er vill-type (bortsett fra dens kanalen-merking transgene), er mer tidkrevende, men kan i prinsippet utføres på samme måte (vi har gjennomført slike en skjermen på genomet-bred basis i flere måneder). Slike skjermer vil identifisere flere forskjellige kanalen fenotyper (ikke vist her), og derfor må utvikle tilsvarende ulike scoring parametere, f.eks, en kvalitativ klassifisering ordningen (se 9,11, 35,36,37,38 for forskjellige måter å score kanalen fenotyper ved å dissekere mikroskopi). Når tolke noen kanalen fenotype, er det viktig å huske på at cyste formasjonen kan være en uspesifikke effekt av mange forskjellige fornærmelser til denne tynne rørformet struktur, og det er ofte en mindre informativ terminal fenotypen. Cyste størrelse og plassering, derimot, kan være informativ, f.eks, en cyste nær canal cellen (i starten av kanalen forlengelsen), cyster langs kanalens lengde eller cyster på kanalen tips, gir ledetråder til den underliggende mekanismen av feil. Kanalen cyster (her definert som intra-lumenal væskefylte spheroids omgitt av en apikale/lumenal membran) bør skilles fra blemmer (liten cytoplasmatiske membran-bundet væske fylt spheroids) eller vacuoles (forstørret cytoplasmatiske membran-bundet Fluid fylte spheroids), ikke er omgitt av en lumenal membran, som kan alle se overfladisk identisk (figur 4A-D). Cytoplasmatiske vacuoles finnes likeledes sekundært, f.eksvia toksiske effekter av monteringsløsninger (Natriumazid). Både store cyster og cytoplasmatiske vacuoles kan ta opp nesten størrelsen på dyret, og må skilles ytterligere fra den klassiske "clear (Clr)" canal fenotypen som skyldes opphopning av væske i kroppens hulrom. Endelig må kanalen lengde er nesten alltid sekundært utsatt i cystisk kanalene, derfor sann kanalen forlengelsen feil påvises i cyste gratis omgivelser.

Til tross for deres liten diameter, subcellular komponenter av excretory kanaler som apikale versus basale membraner, intracellulær endosomal versus canalicular blemmer, intracellulær organeller og cellen cytoskjelett komponenter, kan visualiseres høyere forstørrelse, f.eksAC confocal mikroskopi (figur 2, Figur 4). AC confocal imaging er en GFP positiv kanalen cytoplasma alene tilstrekkelig til å skille lumen fra kanalen cytoplasma via en ikke-fluorescerende linje (figur 2A, figur 4E). Identitet markører bidrar til å løse canalicular fra endosomal blemmer (også påfallende forskjellige i størrelse), selv om definitive tildeling vil kreve immunoelectronmicroscopy39. Dobbel og trippel merking kan avgjøre den subcellular lokaliseringen av et molekyl av interesse og for subcellular komponenter til hverandre (figur 2). Enkelt merket lumenal kanalen membraner produsere samme dobbelt linje som cytoplasma eller basale membranen, men kan skilles via dobbel eller trippel merking. AC confocal analyse, gitt riktig montering er viktig, skjørhet kanalen struktur, sensitiviteten osmotisk endringer og sårbarheten til de hyppigste cystisk fenotypen. Cyster sprakk lett med osmotisk endringer eller fysisk press, er følsomme for membran giftstoffer som Natriumazid og også sensitive til noen anestesi brukes for immobilisering (det kan også gi cytoplasmatiske vacuoles). I våre hender fungerer 5% lidocaine M9 buffer best for mest excretory kanalen analyser. Bildebehandling prosedyrer og alle håndtering bør være mild, som beskrevet. For å unngå gjenstander som etterligner fenotyper (f.eks, cyster og vacuoles), er det best umiddelbart hente bilder etter montering. Hvis det ikke er mulig, bør cyste bilder hentes først før imaging andre fenotyper. Denne protokollen diskuterer standard skanning AC confocal mikroskopi som gir overlegen confocality, sammenlignet med spinning disk AC confocal mikroskopi som derimot reduserer Phototoksisitet og er mikroskopi valgfrihet for analyse av dynamiske endringer av subcellular komponenter over tid. Slike spørsmål på subcellular dynamics kan også rettes ved å bruke photobleaching teknikker eller merking fusion proteiner med foto-valgbar fluorophores som endrer farge40. Endelig området oppløsning kan økes ytterligere ved å legge til overføring elektronmikroskop (TEM, gir den høyeste strukturelle men ikke molekylær oppløsningen), super-oppløsning mikroskopi (gi molekylær oppløsning i området nanometer); eller immunoelectronmicroscopy (gi både)39,41. 3D tomografi kan kombineres med TEM føljetong deler og er spesielt nyttig for analyse av canalicular-plasma-membran grensesnittet av excretory kanalene9,10. Forbedret teknikker for disse typer mikroskopi og kombinasjoner av disse ulike tenkelig tilnærminger fortsetter å bli utviklet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Vi takker M. Buechner (University of Kansas, Kansas, USA), K. Nehrke (University of Rochester Medical Center, Rochester, New York, USA) og Caenorhabditis genetikk sentrum, finansiert av National Institutes of Health, Office for forskningsinfrastruktur Programmer (P40 OD010440). Dette arbeidet ble støttet av tilskudd NIH GM078653 og MGH er 224570 SAA 223809 til V.G.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cloning
Plasmid pPD95.75 Addgene Cat. No. 37464
PCR Kit Qiagen Cat. No. 27106
Ligation kit New England Biolabs Cat. No. E2611L
DNA marker Thermo Scientific Cat. No. SM1331
Agarose DNA grade Fisher Scientific Cat. No. BP164-100
Competent cells New England Biolabs Cat. No. C2987H
Tris Fisher Scientific Cat. No. BP154-1
EDTA Sigma Cat. No. ED-1KG
Acetic acid Fisher Scientific Cat. No. A38S-500
Ethidium bromide Fisher Scientific Cat. No. BP1302-10
Equipments
PCR machine  MJ Research Cat. No. PTG-200 
Centrifuge Eppendorf  Cat. No. 5415C
Water Bath Precision Scientific  Cat. No. 666A3 
Gel running instrument Fisher Scientific Cat. No. 09-528-165
Gel running power supply Fisher Scientific Cat. No. 45-000-465
Molecular Imager Gel Doc XR System Bio-Rad Cat. No. 1708195EDU
Nanodrop Spectrophotometer Thermo Scientific Cat. No. ND1000
C. elegans related1 1see reference19 for standard C. elegans culture and maintenance procedures.
LB Medium and plates2 2see reference19 for protocols.
Tryptone  Acros Organics Cat. no. 611845000
Yeast Extract BD Biosciences Cat. no. 212750
NaCl Sigma Cat. no. S7653
Bacto Agar  BD Biosciences Cat. no. 214040
Ampicillin Sigma Cat. no. A0116
Tetracycline Fisher Scientific Cat. no. BP912
M9 Medium2 2see reference19 for protocols.
NaCl Sigma Cat. no. S7653
KH2PO4 Sigma Cat. no. P0662
Na2HPO4 Sigma Cat. no. S7907
MgSO4 Sigma Cat. no. M2773
NGM plates 2 2see reference19 for protocols.
NaCl Sigma Cat. no. S7653
Peptone  BD Biosciences Cat. no. 211677
Tryptone  Acros Organics Cat. no. 611845000
Bacto Agar  BD Biosciences Cat. no. 214040
MgSO4 Sigma Cat. no. M2773
CaCl2 Sigma Cat. no. C3881
Cholesterol  Sigma Cat. no. C8667
K2HPO4  Sigma Cat. no. P3786
KH2PO4 Sigma Cat. no. P0662
RNAi plates3 3see reference21 for protocols.
NaCl Sigma Cat. no. S7653
Peptone  BD Biosciences Cat. no. 211677
Tryptone  Acros Organics Cat. no. 611845000
Bacto Agar  BD Biosciences Cat. no. 214040
MgSO4 Sigma Cat. no. M2773
CaCl2 Sigma Cat. no. C3881
Cholesterol  Sigma Cat. no. C8667
K2HPO4  Sigma Cat. no. P3786
KH2PO4 Sigma Cat. no. P0662
IPTG  US Biological Cat. no. I8500
Carbenicillin Fisher Scientific Cat. no. BP2648
NaOH Fisher Scientific Cat. no. SS266-1
Sodium hypochlorite Fisher Scientific Cat. no. 50371500
Bacteria
OP50 bacteria CGC
HT115 bacteria CGC
Genome-wide RNAi libraries
Ahringer genome-wide RNAi feeding library (ref21,58,59) Source BioScience
C. elegans ORF-RNAi feeding library (ref60) Source BioScience
Imaging related
Lidocaine MP Biomedicals,LLG Cat. no. 193917
Materials
Vacuum Grease Silicone Beckman Cat. no. 335148
Microscope slides  Fisher Scientific Cat. no. 4448
Tissue culture plate, 6 well  Corning Inc. Cat. no. 08-772-33
Equipment
SMZ-U dissecting microscope (Nikon)
SZX12 dissecting microscope (Olympus), equipped with a high-power stereo fluorescence attachment (Kramer Scientific), CCD camera with Q capture software and X-Cite fluorescent lamp (Photonic Solutions).
TCS SL Laser-scanning confocal microscope (Leica Microsystem)
C2 laser-scanning confocal mounted on an ECLIPSE Ti-E inverted microscope (Nikon)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lubarsky, B., Krasnow, M. A. Tube morphogenesis: making and shaping biological tubes. Cell. 112 (1), (2003).
  2. Sundaram, M. V., Cohen, J. D. Time to make the doughnuts: Building and shaping seamless tubes. Semin. Cell Dev. Biol. S1084-9521, 30130-30136 (2016).
  3. Zhang, N. The C. elegans intestine as a model for intercellular lumen morphogenesis and in vivo polarized membrane biogenesis at the single-cell level. JoVE. , (2017).
  4. Andrew, D. J., Ewald, A. J. Morphogenesis of epithelial tubes: Insights into tube formation, elongation, and elongation. Dev. Biol. 341 (1), 34-55 (2010).
  5. Nelson, F. K., Albert, P. S., Riddle, D. L. Fine structure of the Caenorhabditis elegans secretory-excretory system. J. Ultrastruct. Res. 82 (2), 156-171 (1983).
  6. Sundaram, M. V., Buechner, M. The Caenorhabditis elegans Excretory System: A Model for Tubulogenesis, Cell Fate Specification, and Plasticity. Genetics. 203 (1), 35 (2016).
  7. Altun, Z. F., Hall, D. H. Excretory system. WormAtlas. , (2009).
  8. Buechner, M. Tubes and the single C. elegans excretory cell. Trends Cell Biol. 12 (10), 479-484 (2002).
  9. Khan, L. A. Intracellular lumen extension requires ERM-1-dependent apical membrane expansion and AQP-8-mediated flux. Nat. Cell Biol. 15 (2), 143-156 (2013).
  10. Kolotuev, I., Hyenne, V., Schwab, Y., Rodriguez, D., Labouesse, M. A pathway for unicellular tube extension depending on the lymphatic vessel determinant Prox1 and on osmoregulation. Nat. Cell Biol. 15 (2), 157-168 (2013).
  11. Buechner, M., Hall, D. H., Bhatt, H., Hedgecock, E. M. Cystic canal mutants in Caenorhabditis elegans are defective in the apical membrane domain of the renal (excretory) cell. Dev. Biol. 214 (1), 227-241 (1999).
  12. Fehon, R. G., McClatchey, A. I., Bretscher, A. Organizing the cell cortex: the role of ERM proteins. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11 (4), 276-287 (2010).
  13. Gobel, V., Barrett, P. L., Hall, D. H., Fleming, J. T. Lumen morphogenesis in C. elegans requires the membrane-cytoskeleton linker erm-1. Dev. Cell. 6 (6), 865-873 (2004).
  14. Boulin, T., et al. Reporter gene fusions, WormBook. The C. elegans Research Community, WormBook. , April 5, 2006 http://www. wormbook.org (2006).
  15. Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. Sambrook, J., DW, R. ussell , Cold Spring Harbor Laboratory Press . (2006).
  16. Fire, A., Harrison, S. W., Dixon, D. A modular set of lacZ fusion vectors for studying gene expression in Caenorhabditis elegans. Gene. 93 (2), 189-198 (1990).
  17. Ahringer, J. Reverse genetics, WormBook. The C. elegans Research Community, WormBook. 6, April 6, 2006 http://www. wormbook.org (2006).
  18. Transformation and microinjection, WormBook. The C. elegans Research Community, WormBook. Evans, T. C. , April 6, 2006 http://www.wormbook.org (2006).
  19. Maintenance of C. elegans, WormBook. The C. elegans Research Community, WormBook. Stiernagle, T. , February 11, 2006 http://www.wormbook.org (2006).
  20. Genetic mapping and manipulation: Chapter 7-Making compound mutants, WormBook. The C. elegans Research Community, WormBook. Fay, D. , February 17, 2006 http://www.wormbook.org (2006).
  21. Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30 (4), 313-321 (2003).
  22. Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
  23. Pawley, J. B. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , Springer. (2006).
  24. Hibbs, A. R. Confocal Microscopy for Biologists. , Springer. US. (2004).
  25. Bankhead, P. Analyzing fluorescence microscopy images with ImageJ. , (2014).
  26. Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetics. 157 (3), 1217-1226 (2001).
  27. Frøkjaer-Jensen, C. Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans. Nat. Genet. 40 (11), 1375-1383 (2008).
  28. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10 (12), 3959-3970 (1991).
  29. Barrangou, R. Cas9 Targeting and the CRISPR Revolution. Science. 344 (6185), 707-708 (2014).
  30. Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering. Genetics. 202 (3), 885-901 (2016).
  31. Esposito, D., Garvey, L. A., Chakiath, C. S. Gateway cloning for protein expression. Methods Mol. Biol. 498, 31-54 (2009).
  32. Gibson, D. G. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat. Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  33. Hobert, O. PCR fusion-based approach to create reporter gene constructs for expression analysis in transgenic C. elegans. Biotechniques. 32 (4), 728-730 (2002).
  34. Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nat. Rev. Genet. 3 (5), 356-369 (2002).
  35. Berry, K. L., Bulow, H. E., Hall, D. H., Hobert, O. A. C. elegans CLIC-like protein required for intracellular tube formation and maintenance. Science. 302 (5653), 2134-2137 (2003).
  36. Mattingly, B. C., Buechner, M. The FGD homologue EXC-5 regulates apical trafficking in C. elegans tubules. Dev. Biol. 359 (1), 59-72 (2011).
  37. Shaye, D. D., Greenwald, I. The disease-associated formin INF2/EXC-6 organizes lumen and cell outgrowth during tubulogenesis by regulating F-actin and microtubule cytoskeletons. Dev. Cell. 32 (6), 743-755 (2015).
  38. Lant, B. CCM-3/STRIPAK promotes seamless tube extension through endocytic recycling. Nat. Commun. 6 (6), 6449 (2015).
  39. Paupard, M. C., Miller, A., Grant, B., Hirsh, D., Hall, D. H. Immuno-EM localization of GFP-tagged yolk proteins in C. elegans using microwave fixation. J. Histochem. Cytochem. 49 (8), 949-956 (2001).
  40. Lukyanov, K. A., Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Verkhusha, V. V. Photoactivatable fluorescent proteins. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (11), 885-891 (2005).
  41. Bates, M., Huang, B., Dempsey, G. T., Zhuang, X. Multicolor super-resolution imaging with photo-switchable fluorescent probes. Science. 317 (5845), 1749-1753 (2007).
  42. Sherman, T. The abts and sulp families of anion transporters from Caenorhabditis elegans. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 289 (2), C341-C351 (2005).
  43. Caenorhabditis Genetics Center (CGC). , http://cbs.umn.edu/cgc/home (2017).
  44. Wormbase. , http://www.wormbase.org/ (2017).
  45. Transgeneome website. , https://transgeneome.mpi-cbg.de/transgeneomics/index.html (2017).
  46. C. elegans expression pattern. , http://gfpworm.org/ (2017).
  47. National BioResource Project (NBRP)::C. elegans. , https://shigen.nig.ac.jp/c.elegans/ (2017).
  48. Heppert, J. K. Comparative assessment of fluorescent proteins for in vivo imaging in an animal model system. Mol. Biol. Cell. 27 (22), 3385-3394 (2016).
  49. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
  50. GeneMANIA. , http://genemania.org/ (2017).
  51. AceView. , http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ieb/research/acembly/ (2017).
  52. iHOP. , http://www.ihop-net.org/UniPub/iHOP / (2017).
  53. Saccharomyces Genome Database. , http://www.yeastgenome.org (2017).
  54. Flybase. , http://www.flybase.org (2017).
  55. Mouse Genome Database. , http://www.informatics.jax.org (2017).
  56. Human Genome Database. , http://www.gdb.org (2017).
  57. BLAST. , https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (2017).
  58. Kamath, R. S., Martinezcampos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 2 (1), RESEARCH0002 (2001).
  59. Kamath, R. S. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
  60. Rual, J. F. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome research. 14 (10B), 2162-2168 (2004).

Tags

Utviklingspsykologi biologi problemet 128 encellede tubulogenesis intracellulær lumen morphogenesis enkelt celle i vivo analyse utviklingsmessige genetikk dissecting fluorescens mikroskopi AC confocal mikroskopi
<em>C. elegans</em> Excretory kanalen som modell for intracellulær Lumen Morphogenesis og <em>I Vivo</em> polarisert membran Biogenesis i en enkeltcelle: merking av GFP-fusjoner, RNAi interaksjon skjermen og bildebehandling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, N., Membreno, E., Raj, S.,… More

Zhang, N., Membreno, E., Raj, S., Zhang, H., Khan, L. A., Gobel, V. The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging. J. Vis. Exp. (128), e56101, doi:10.3791/56101 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter