Aqui nós descrevemos um método comum para induzir lesão hepática crônica em ratos, alimentando-se de uma dieta deficiente em colina e ethionine-complementado do (CDE). Demonstramos que o monitoramento de integridade, perfusão hepática, isolamento e preservação. Um curso de tempo de seis semanas pode informar sobre a lesão hepática, pathohistology, fibrose, inflamatória e respostas de células progenitoras de fígado.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
O murino colina deficiente, Ethionine-completada (CDE) dieta modelo de lesão hepática crônica
Neste artigo
Resumo
Resumo
Doenças crônicas do fígado, como hepatite viral, doença hepática alcoólica ou doença hepática gordurosa não-alcoólica, são caracterizadas por inflamação contínua, destruição progressiva e regeneração da célula progenitora de parênquima hepático, fígado proliferação e fibrose. O estágio final de cada doença crónica do fígado é a cirrose, um importante factor de risco para o desenvolvimento de carcinoma hepatocelular. Para estudar os processos que regulam a progressão, estabelecimento e iniciação da doença, vários modelos animais são utilizados em laboratórios. Aqui descrevemos um curso de seis semanas de tempo do deficiente em colina e ethionine-completados (CDE) modelo de mouse, que envolve seis semana de idade camundongos C57BL/6J machos de alimentação com deficiente em colina chow e 0,15% DL-ethionine-completar água potável. Monitoramento da saúde animal e uma curva de perda de peso de corpo típica são explicados. O protocolo demonstra a análise bruta de uma coleção de fígado e sangue CDE-tratados por punção cardíaca para análises subsequentes de soro. Em seguida, a técnica de perfusão de fígado e coleção de diferentes lóbulos hepáticos para avaliações padrão são mostrados, incluindo histologia hepática avaliações por hematoxilina e eosina ou Sirius vermelho citológicas, imunofluorescência deteção de populações de células hepáticas assim como transcriptome perfilamento do microambiente do fígado. Este modelo de rato é adequado para estudar inflamatória, fibrogênicos e células progenitoras fígado dinâmica induzida através de doença hepática crônica e pode ser usada para testar potenciais agentes terapêuticos que podem modular a estes processos.
Introdução
O fígado é o maior órgão glandular de metabólico do corpo e tem muitas funções complexas. Papéis-chave para o fígado incluem a digestão, desintoxicação, metabolismo, armazenamento de nutrientes essenciais, produção de componentes de proteínas do plasma sanguíneo e imunidade mediada por macrófagos residentes ou células de Kupffer. O fígado tem uma grande capacidade de se regenerar mesmo que cerca de 70-90% da sua massa total é perdida. Em caso de lesão hepática aguda, como visto a seguir uma hepatectomy parcial ou paracetamol envenenamento, os restantes saudáveis hepatócitos proliferam para reparar os danos num processo altamente coordenada1. No entanto, quando os hepatócitos são cronicamente feridos devido a uma infecção viral a longo prazo, alcoólica ou não alcoólicas esteatose hepática, o microambiente inflamatório desencadeia a ativação das células estreladas hepáticas fibrose de condução e a proliferação de células progenitoras de fígado (LPCs) com o potencial de se diferenciar em hepatócitos ou cholangiocytes2,3,4,5. A origem exacta, destino de diferenciação da LPCs, contribuam para a regeneração hepática e hepatocarcinogenesis foram temas de debate intenso e provavelmente depende da gravidade da lesão e contexto2. A ordem dos eventos precoce associada a regeneração é discutida também controversa, com alguns investigadores, informando que a ativação de células estreladas hepáticas e remodelação da matriz é essencial para a geração de um LPC-favorecendo nicho6, enquanto outros relatório que a expansão do LPC e o so-called reação Ductular são necessários para gatilho fibrogenesis7. Existem inúmeros modelos animais para estudar aspectos específicos da lesão e regeneração, na tentativa de compreender todos os factores subjacentes que regulam a progressão da doença e, finalmente, desenvolver novas estratégias de tratamento para pacientes8.
O modelo dieta deficiente em colina e ethionine-completados (CDE) foi originalmente desenvolvido para uso em ratos e posteriormente modificado para indução de lesão hepática crônica em ratos9,10. Deficiência dietética de colina resulta em assembly prejudicada e secreção das lipoproteínas de baixa densidade muito. Combinado com o hepatocarcinogen DL-ethionine, este regime leva a excessiva gordura hepática, carregamento, inflamação contínua, fibrose periportal, resposta LPC e a longo prazo para hepatocelular carcinoma desenvolvimento11,12 . No entanto, importante, cepas de mouse diferente apresentam padrões distintos de inflamatórias, fibrogênicos e LPC resposta dinâmica13. Este protocolo descreve a cepa de rato de indução em camundongos C57BL/6J, o mais comumente usado e mais uns de lesão hepática crônica.
Na investigação de doença hepática crônica, análises típicas incluem avaliação histológica pela hematoxilina e eosina, bem como Sirius vermelho coloração para visualizar depoimentos de colágeno, imuno-histoquímica ou imunofluorescência detecção de populações de células hepáticas, e análises de transcriptomic do fígado microambiente que coordena as mudanças celulares induzidas pelo complexo fator de crescimento e citocinas redes14,15,16,17 , 18.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
1. a experimentação animal
todos os estudos animais descritos nesta investigação foram aprovados pelo Comitê de ética Curtin University Animal (número de aprovação: AEC_2014_28) antes do início da experiências e executadas em conformidade com o código australiano para o cuidado e o uso de animais.
- Animais
- usar seis semana de idade camundongos C57BL/6J machos para os experimentos.
- Desenho experimental
- após chegada à instalação de Animal, permitem que os ratos se adapte para quatro dias antes do início de qualquer experimentos. Ratos de casa
- na cama de wheaten joio, que foi esgotado de caules e grãos visíveis e manter os ratos em ciclos de dia/noite 12 horas individualmente ventilado gaiolas. Mudança de roupa de cama nos dias três e sete, então semanal depois. Dieta
- fornecer ratos com acesso ad libitum para o deficiente em colina e suplementado com 0,15% de DL-ethionine de água potável. Manter o DL-ethionine-completar água a 4° C e substituir a água potável cada segundo dia para garantir a frescura e incentivar a beber. Top-up o deficiente em colina chow cada segundo dia com uma completa mudança de comida uma vez por semana.
- Observar ratos em repouso e durante a manipulação. Monitor de sinais padrão de sanidade animal, incluindo a aparência geral, postura, interação social, aliciamento, revestir a condição e peso corporal. Ratos de pesar
- diariamente durante as duas primeiras semanas do experimento para garantir que todos os animais exibindo mais de 20% perda de peso corporal são sacrificados para limitar o sofrimento indevido. Este é tipicamente o caso em menos de 5% dos animais. Depois de duas semanas, a frequência de pesagem pode ser reduzida a três vezes por semana (por exemplo, segunda-feira, quarta-feira, sexta-feira).
- Isolamento e perfusão de fígado
- anestesiar os ratos em pontos de tempo indicado (no presente estudo, uma, duas e seis semanas na dieta do CDE) com cetamina (100 mg/kg) e xilazina (10mg/kg) por injeção intraperitoneal. Testar o reflexo de retirada do pedal para garantir a adequada anestesia.
- Molhar a pele com 70% de etanol e fazer uma incisão vertical na parede abdominal até o diafragma com uma tesoura de Mayo. A caixa torácica pode ser removida para facilitar o acesso ao coração.
- Coleta de sangue por punção cardíaca lenta, usando uma 25 x 1/2 " agulha de parede regular para evitar o colapso do coração. Permitir que o sangue a coagular em um tubo de microcentrifugadora à temperatura ambiente para obter amostras de soro após centrifugação a 2.000 x g durante 10 minutos. Mais tarde, medir níveis de alanina transaminase do soro por procedimentos padrão 12.
- Mover o estômago e intestino delgado para o lado e expor a veia porta. Cortar o coração, usando a tesoura de Mayo para permitir que fluidos sair e perfundir o fígado com tampão de fosfato estéril salina (pH = 7,4) por canulação da veia portal usando um 27 x 1/2 " agulha de parede regular. Um fígado branqueado uniformemente indica perfusão bem sucedida de todos os lóbulos fígados.
- Cuidadosamente desanexar o fígado e coloque-o em um prato de petri usando fórceps e a tesoura de Mayo. Remover o tecido em excesso, não-fígado e vesícula biliar.
- Preservação do fígado
- depois que o peso total do fígado foi gravado, cortar um pequeno lóbulo em vários pedaços pequenos de alguns milímetros quadrados, transferi-los para tubos estéreis e snap-congelamento em nitrogênio líquido para posterior do RNA e extração da proteína, conforme protocolos padrão. Snap-congelar esses pedaços de tecido, logo que possível após a colheita de órgãos para evitar qualquer degradação do tecido.
- Recolher um lobo em 10% de formalina tamponada neutro para posterior processamento e incorporação de parafina, como por protocolos padrão.
- Coloque um lobo em um molde cheio de corte óptima temperatura cryomatrix incorporação de resina e snap-congelamento em nitrogênio líquido.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Ao longo do curso do tempo de seis semanas de lesão hepática crônica induzida pelo CDE, parâmetros foram avaliados nos dias 7 (fase de indução), 14 e 21 (fase de criação) e 42 (fase de manutenção). Comparado com o controle de ratos, camundongos tratados com CDE perderam até 20% de seu peso inicial em uma fase de adaptação inicial e tendem a recuperar o peso nas fases de estabelecimento e manutenção (Figura 1). O peso corporal foi inversamente...
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Doença hepática crônica é muitas vezes uma doença silenciosa com a maioria dos pacientes, sendo assintomática e é um dos maiores contribuintes para a morbidade e mortalidade em todo o mundo. Alcoolismo crônico e infecção pelo vírus da hepatite C são as principais causas. Lesão hepática crônica é caracterizada por inflamação hepática, fibrose e em casos severos cirrose, carcinoma e, finalmente, cirrose. Atualmente não existe cura disponível e embora grandes avanços foram feitos para compreender os mecanismos da doença hep...
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Não há nada a ser divulgada pelos autores.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado por doações da saúde nacional e Conselho de pesquisa médica (NHMRC) da Austrália (APP1042370, APP1061332, APP1087125). Os autores gostaria de agradecer a equipe Curtin saúde inovação Research Institute para obter assistência técnica.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Camundongos C57BL/6J machos de seis semanas de idade | Centro de Recursos Animais da Austrália Ocidental, Murdoch, WA, Austrália | N/A | |
| 10 Kg Corte a Vapor Wheaten Chaff | Alimentos Especiais, Glen Forrest, WA, Austrália | N/A | |
| Água para irrigação garrafa de 1000ml (Baxter) | Surgical House, Perth, WA, Austrália | ||
| Dieta deficiente em colina, modificada (pellets) | MP Biomedicals Australasia Pty Limited, WA, Austrália 02960210 | ||
| DL-Etionina | Sigma-Aldrich, Castle Hill, NSW, Austrália | E5139-25G | |
| Ketamil injeção | Troy Laboratories Pty Limited, Glendenning, NSW, Austrália | N/A | |
| Ilum Xylazil-20 injeção | Troy Laboratories Pty Limited, Glendenning, NSW, Austrália | N/A | |
| 27G x 1/2", Agulha de Parede Regular | Terumo Australia Pty Limited, NSW, Austrália | NN-2713R | |
| Seringas Terumo 1ml e 10ml | Terumo Australia Pty Limited, Macquarie Park, NSW, Austrália | 1018242, 1018037 | |
| composto OCT Tissue-Tek | VWR International Pty Limited, Tingalpa, QLD, Austrália | 25608-930 | |
| Formalina tamponada neutra | Amber Scientific, Midvale, WA, Austrália | NBF-2.5L | |
| Etanol absoluto anaLaR normalpur | VWR International Pty Limited, Tingalpa, QLD, Austrália | 20821.33 | |
| Chinelos Superfrost Plus | Grale Scientific Pty Limited, Ringwood, VIC, Austrália | ||
| Dako Protein Block, sem soro | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Austrália | X090930-2 | |
| Diluente de anticorpos Dako | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Austrália | s0809 | |
| rato anti-CD45 | eBioscience, San Diego, Califórnia, EUA | m0701 | Diluição de 1/200 |
| coelho anti-panCK | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Austrália | Z0622 | Diluição 1/300 |
| Cabra anti-coelho (Alexa Fluor 488) | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Austrália | A-11008 | Diluição 1/500 |
| Cabra anti-rato IgG (Alexa Fluor 594) | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Austrália | A-11007 | diluição 1/500 |
| com DAPI | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Austrália | Pág. 36935 | |
| Kit de Mancha Vermelha Picrosirius | Polysciences Inc., Warrington, PA, EUA | ab150681 |
Referências
- Taub, R. Liver regeneration: from myth to mechanism. Nat Rev Mol Cell Biol. 5, 836-847 (2004).
- Kohn-Gaone, J., Gogoi-Tiwari, J., Ramm, G. A., Olynyk, J. K., Tirnitz-Parker, J. E. The role of liver progenitor cells during liver regeneration, fibrogenesis, and carcinogenesis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 310, G143-G154 (2016).
- Lu, W. Y., et al. Hepatic progenitor cells of biliary origin with liver repopulation capacity. Nat Cell Biol. 17, 971-983 (2015).
- Prakoso, E., et al. Analysis of the intrahepatic ductular reaction and progenitor cell responses in hepatitis C virus recurrence after liver transplantation. Liver Transpl. 20, 1508-1519 (2014).
- Tirnitz-Parker, J. E., Tonkin, J. N., Knight, B., Olynyk, J. K., Yeoh, G. C. Isolation, culture and immortalisation of hepatic oval cells from adult mice fed a choline-deficient, ethionine-supplemented diet. Int J Biochem Cell Biol. 39, 2226-2239 (2007).
- Van Hul, N. K., Abarca-Quinones, J., Sempoux, C., Horsmans, Y., Leclercq, I. A. Relation between liver progenitor cell expansion and extracellular matrix deposition in a CDE-induced murine model of chronic liver injury. Hepatology. 49, 1625-1635 (2009).
- Clouston, A. D., et al. Fibrosis correlates with a ductular reaction in hepatitis C: roles of impaired replication, progenitor cells and steatosis. Hepatology. 41, 809-818 (2005).
- Forbes, S. J., Newsome, P. N. Liver regeneration - mechanisms and models to clinical application. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 13, 473-485 (2016).
- Akhurst, B., et al. A modified choline-deficient, ethionine-supplemented diet protocol effectively induces oval cells in mouse liver. Hepatology. 34, 519-522 (2001).
- Shinozuka, H., Lombardi, B., Sell, S., Iammarino, R. M. Early histological and functional alterations of ethionine liver carcinogenesis in rats fed a choline-deficient diet. Cancer Res. 38, 1092-1098 (1978).
- Knight, B., Tirnitz-Parker, J. E., Olynyk, J. K. C-kit inhibition by imatinib mesylate attenuates progenitor cell expansion and inhibits liver tumor formation in mice. Gastroenterology. 135, 969-979 (2008).
- Kohn-Gaone, J., et al. Divergent Inflammatory, Fibrogenic, and Liver Progenitor Cell Dynamics in Two Common Mouse Models of Chronic Liver Injury. Am J Pathol. 186, 1762-1774 (2016).
- Knight, B., et al. Attenuated liver progenitor (oval) cell and fibrogenic responses to the choline deficient, ethionine supplemented diet in the BALB/c inbred strain of mice. J Hepatol. 46, 134-141 (2007).
- Dwyer, B. J., Olynyk, J. K., Ramm, G. A., Tirnitz-Parker, J. E. TWEAK and LTbeta Signaling during Chronic Liver Disease. Front Immunol. 5, 39(2014).
- Karin, M., Clevers, H. Reparative inflammation takes charge of tissue regeneration. Nature. 529, 307-315 (2016).
- Ruddell, R. G., et al. Lymphotoxin-beta receptor signaling regulates hepatic stellate cell function and wound healing in a murine model of chronic liver injury. Hepatology. 49, 227-239 (2009).
- Tirnitz-Parker, J. E., et al. Tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis is a mitogen for liver progenitor cells. Hepatology. 52, 291-302 (2010).
- Viebahn, C. S., Yeoh, G. C. What fires prometheus? The link between inflammation and regeneration following chronic liver injury. Int J Biochem Cell Biol. 40, 855-873 (2008).
- Hayner, N. T., Braun, L., Yaswen, P., Brooks, M., Fausto, N. Isozyme profiles of oval cells, parenchymal cells, and biliary cells isolated by centrifugal elutriation from normal and preneoplastic livers. Cancer Res. 44, 332-338 (1984).
- Tee, L. B., Smith, P. G., Yeoh, G. C. Expression of alpha, mu and pi class glutathione S-transferases in oval and ductal cells in liver of rats placed on a choline-deficient, ethionine-supplemented diet. Carcinogenesis. 13, 1879-1885 (1992).
- Chayanupatkul, M., et al. Hepatocellular carcinoma in the absence of cirrhosis in patients with chronic hepatitis B virus infection. J Hepatol. 66, 355-362 (2017).
- Mittal, S., et al. Hepatocellular Carcinoma in the Absence of Cirrhosis in United States Veterans is Associated With Nonalcoholic Fatty Liver Disease. Clin Gastroenterol Hepatol. 14, 124-131 (2016).
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
