Extração de amostra e quantificação cromatográfica simultânea de doxorrubicina e mitomicina C após entrega de combinação de drogas em nanopartículas para ratos de Tumor-rolamento

Summary

Este protocolo descreve um processo analítico eficiente e conveniente de extração de amostra e determinação simultânea de múltiplas drogas, doxorrubicina (DOX), mitomicina C (MMC) e um metabólito tóxico cardio DOX, doxorubicinol (DOXol), no biológico amostras de um modelo de tumor de mama pré-clínico tratadocom com formulações de nanopartículas de combinação sinérgica de drogas.

Abstract

Quimioterapia de combinação é frequentemente usada na clínica para tratamento de câncer; no entanto, os efeitos adversos associados ao tecido normal podem limitar seu benefício terapêutico. Combinação de drogas baseados em nanopartículas foi mostrada para atenuar os problemas encontrados pela terapia de combinação livre de drogas. Nossos estudos anteriores têm demonstrado que a combinação de duas drogas anticâncer, doxorrubicina (DOX) e mitomicina C (MMC), produziu um efeito sinérgico contra ambos murino e células de câncer de mama humano em vitro. Nanopartículas de híbrido de polímero carregado co-lipídico DOX e MMC (DMPLN) através de várias bombas de transportador de efluxo que conferem multirresistência e demonstrada eficácia reforçada em modelos de tumor de mama. Em comparação com formas de solução convencional, tal eficácia superior de DMPLN foi atribuída à farmacocinética sincronizada de DOX e MMC e biodisponibilidade de aumento intracelular de drogas dentro de células de tumor habilitado pelo nanocarreador PLN.

Para avaliar a farmacocinética e bio-distribuição de co administrado DOX e MMC em solução livre e formas de nanopartículas, um método de análise de múltiplas drogas simples e eficiente usando reverso-fase de alto desempenho foi de cromatografia líquida (HPLC) desenvolvido. Em contraste com os métodos anteriormente relatados que analisaram DOX ou MMC individualmente no plasma, esse novo método HPLC é capaz de dosar simultaneamente DOX, MMC e um metabolito principal de DOX cardio-tóxico, doxorubicinol (DOXol), em diferentes matrizes biológicas ( por exemplo, sangue total, tumor de mama e coração). Uma dupla sonda fluorescente e ultravioleta de absorvente 4-methylumbelliferone (4-MU) foi usado como um padrão interno (I.S.) para a deteção de uma etapa de análise de drogas múltiplas com comprimentos de onda diferentes da deteção. Este método foi aplicado com sucesso para determinar as concentrações de DOX e MMC entregado por abordagens tanto nanopartículas e solução no sangue e vários tecidos em modelo murino de tumor de mama um ortotópico. O método analítico apresentado é uma ferramenta útil para a análise pré-clínico de entrega baseados em nanopartículas de combinações de drogas.

Introduction

A quimioterapia é uma modalidade de tratamento primário para muitos tipos de câncer ainda é frequentemente associado com efeitos adversos graves e eficácia limitada devido a resistência às drogas e outros fatores^1,2,3. Regimes de combinação de drogas para melhorar o resultado da quimioterapia, foram aplicados na clínica com base em considerações como toxicidades não-sobreposição, diferentes mecanismos de ação de drogas e drogas não-cruz resistência^{4,5 , 6}. em ensaios clínicos, uma me....

Protocol

todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Animal conta Comissão de University Health Network no Ontario Cancer Institute e conduzidos de acordo com o Conselho canadense sobre as orientações de cuidado Animal.

1. preparação da amostra biológica

1. coletar o sangue total, os principais órgãos e tumor de mama nos pontos de tempo predeterminados após administração intravenosa (IV) de contendo fármaco formulações (por exemplo, DMPLN, DOX lipossomal)
   1. injetar um peito tumor-rolamento do mouse IV com uma formulação contendo fármaco preparada.
   2. Anestesiar o mouse nos pontos tempo desi....

Results

Duas drogas anticâncer, DOX e MMC, bem como o metabólito DOX, DOXol, foram detectado simultaneamente sem qualquer interferência biológica sob a condição HPLC aplicada mesma gradiente usando 4-MU como o I.S. para os detectores de UV e fluorescência. DOX, MMC, DOXol e 4-MU foram bem separados uns dos outros com tempos de retenção de 5,7 min para MMC, 10,4 min para DOXol, 10,9 min para 4-MU e 11,1 min para DOX (Figura 2). Cada fármaco no sangue e vários tecidos .......

Discussion

Em comparação com outros métodos cromatográficos que permitem a detecção de uma espécie única droga de cada vez, o presente protocolo HPLC é capaz de dosar simultaneamente três compostos de drogas (DOX, MMC e DOXol) na mesma matriz biológica sem a necessidade de mudar a fase móvel. Esse método de preparação e análise tem sido aplicado com sucesso para determinar a farmacocinética e bio-distribuição de dois sistemas de entrega de drogas baseados em nanopartículas (i.e., lipossomal DOX e DMPLN)^22.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Doxorrubicina	Polymed Theraeutics	111023	medicamento anticâncer
Mitomicina C	Polymed Theraeutics	060814	medicamento anticâncer
Doxorrubicinol (DOXol)	Toronto Research Chemicals	D558020	Metabólito do
sal de sódio DOX 4-metilumbeliferona	Sigma-Aldrich	M1508	Padrão interno
Myristic Acid	Sigma-Aldrich	544-63-8	Materiais para nanopartículas híbridas polilipídicas
Espectro de estearato de polioxietileno (100)		M1402	Materiais para nanopartículas híbridas polilipídicas
Polioxietileno (40) Estearato	Sigma-Aldrich	P3440	Materiais para nanopartículas híbridas polilipídicas
Pluronic F68 (PF68)	BASF Corp.	9003-11-6	Materiais para nanopartículas híbridas polilipídicas
Ultrassom (UP100H)	Hielscher, Tecnologia de Ultrassom	NA	Preparação de nanopartículas
Banho-maria (ISOTEMP 3016HS)	Fisher Scientific	NA	Preparação de nanopartículas
Doxorrubicina lipossomal  (Caelyx)	Janssen	Comprado na farmácia Princess Margaret Hospital	Formulação de nanopartículas clinicamente aprovada
Metanol graduado por HPLC	Caledon Chemicals	6701-7-40	Composição de fase móvel HPLC
Classificação HPLC H2O	Caledon Chemicals	8801-7-40	HPLC composição de fase móvel
Acetonitrila graduada por HPLC	Caledon Chemicals	1401-7-40	Composição da fase móvel da HPLC
Ácido trifluoroacético	Sigma-Aldrich	302031	Composição da fase móvel da HPLC
0,45 μ m Papel de filtro de membrana de nylon	Whatman	WHA7404004	HPLC preparação de fase móvel
1cc Seringas de plástico	Becton, Dickinson and Company	2606-309659	Injeção de tratamento
5cc Seringas de plástico	Becton, Dickinson and Company	2608-309646	Coleções de tecidos
30G 1/2 agulhas	Becton, Dickinson and Company	305106	injeção de tratamento
Agulhas 25G 5/8	Becton, Dickinson and Company	305122	Coleções de tecidos
Estéril 0,9% Salino	Universidade de Toronto Marca da Casa	1011	Perfusão de tecidos
13 ml Tubo cônico de fundo arredondado	SARSTEDT	62.515.006	Proliproleno, homogeneização de tecidos
Meio Essencial Mínimo Alfa (MEM)	Gibco	12571063	Cell medium
1 x Tampão de fosfato Salino	Gibco	10010023	Homogeneização de tecidos
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-100 ML	Homogeneização de tecidos
Ácido fórmico	Caledon Chemicals	1/5/3840	Ajuste o pH para solvente de extração
Tubos de plástico pulverizados com heparina sódica	Becton, Dickinson and Company	367878	Coleta de Sangue
Balança de Pesagem Analítica	Sartório	CPA225D	medidores de
pH NA	Fisher Scientific	13-637-671	accumet BASIC
Vortex Mixter	Fisher Scientific	02-215-365	Amostras de vórtice na velocidade desejada
1.5 ml  Tubo de microcentrífuga	Fisherbrand	2043-05408129	Homogeneizador Prolyprolene
Modelo 1000	Fisher Scientific	08-451-672	Centrifugador de homogeneização de tecidos
5702R	Eppendorf	5702R	Preparação de extração
Sistema de evaporador aquecido	Glas-Col	NA	Reconstituição de amostras
Frascos de rosca de parafuso HPLC	DIKMA	5320	Injeção de amostra de HPLC
Tampas de rosca HPLC com septos de silicone branco PTFE	DIKMA	5325	Injeção de amostra de HPLC
Inserção de polipropileno HPLC	Agilent Technologies	5182-0549	Volume máximo 250 μ l, injeção de amostra de HPLC
Xbridge C18 Column	Waters Corporation	186003117	Análise de drogas
Bomba gradiente	Waters Corporation	W600	Amostrador automático de análise de drogas
	Waters Corporation	W2707
Detector de matriz de fotodiodos de análise de drogas	Waters Corporation	W2998	Análise de medicamentos
Multi λ detector de fluorescência	Waters Corporation	W2475	Análise de drogas
EMPOWER 2	Waters Corporation	NA	Software de análise de dados
Scientist	Micromath	NA	Análise farmacocinética
Camundongos Balb/c fêmeas	Jackson Laboratory	001026	In vivo
EMT6/WT Células de câncer de mama	fornecidas pelo Dr. Ian Tannock; Instituto do Câncer de Ontário	NA	In vivo