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Developmental Biology

Engenharia de tecido corneal: Um em Vitro modelo das interações nervo-estromal da córnea humana

Published: January 24, 2018 doi: 10.3791/56308
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 1,2
1Department of Cell Biology, University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Department of Ophthalmology/Dean McGee Eye Institute, University of Oklahoma Health Sciences Center, 3Department of Physiology, Harold Hamm Diabetes Center, University of Oklahoma Health Sciences Center

Summary

Este protocolo descreve um romance tridimensional em vitro modelo, onde as células do estroma corneana e diferenciada de células neuronais são cultivadas juntos para ajudar na análise e compreensão das interações dos tipos de célula de dois.

Abstract

Engenharia de tecidos ganhou reconhecimento substancial devido à alta demanda para as substituições de córnea humana com cerca 10 milhões de pessoas no mundo sofrem de perda de visão da córnea1. Para atender a demanda de córneas humanas viáveis, progressos significativos em tecido tridimensional (3D) engenharia foi feita2,3,4. Estes córnea modelos variam de sistemas monocamada simples até modelos de várias camados, levando a 3D cheio-espessura corneal equivalentes2.

No entanto, o uso de uma córnea 3D engenharia de tecidos, no contexto dos modelos de doença em vitro estudou a semelhança de falta de data para a estrutura de várias camadas de tecido corneal 3D, função e a interconexão dos diferentes tipos de células (ou seja, nervo, epitélio, estroma e endotélio)2,3. Além disso, a procura de modelos de tecido em vitro córnea tem aumentado na tentativa de reduzir a testes em animais para produtos farmacêuticos. Assim, modelos mais sofisticados são necessários para melhor coincidir com sistemas às exigências fisiológicas humanas e o desenvolvimento de um modelo que é mais relevante para a população de pacientes seja absolutamente necessário. Dado que vários tipos de células na córnea são afetados por doenças e distrofias, tais como ceratocone, ceratopatia diabética e Fuchs, este modelo inclui um modelo 3D co-cultura de fibroblastos da córnea humanos primários (HCFs) de doadores saudáveis e os neurônios de a linha de celular de SH-SY5Y. Isto permite-pela primeira vez investigar as interações entre os tipos de dois célula dentro do tecido da córnea humano. Acreditamos que este modelo poderia potencialmente dissecar os mecanismos subjacentes associados com as interações de nervo do estroma corneal doenças que apresentam danos do nervo. Este modelo 3D espelha a natureza básica de anatômica e fisiológica do tecido corneal na vivo e pode ser usado no futuro como uma ferramenta para investigar defeitos da córnea, bem como a eficácia dos vários agentes de triagem antes de testes em animais.

Introduction

No corpo humano, a córnea é o tecido mais densamente inervado. Os nervos são responsáveis por várias sensações como o toque, dor, temperatura e também têm um papel essencial na cicatrização de feridas, piscar reflexos, rasgar a produção e secreção de5,6,7. Na córnea, estromais troncos nervosos surgem do plexo limbal e insira o estroma da córnea periférico radialmente. A organização do nervo do estroma é paralela as lamelas de colágeno e eles ainda mais ramificam em fascículos menores como proceder para o estroma superficial5,8. As fibras nervosas mais penetrar a camada epitelial e assim, inervação é amplamente espalhada por todo o epitélio corneano e o estroma. Portanto, a inervação tem um papel essencial no estado saudável e doente da córnea. Neste protocolo, revelamos o avanço de um modelo novela 3D em vitro , que é a primeira de seu tipo para imitar as interações do estroma-nervo na vivo . A linha de celular de SH-SY5Y foi utilizada para este estudo, como é uma das linhas mais estabelecidas, bem caracterizadas usadas para estudar o crescimento neuronal. A linha de celular de SH-SY5Y tem sido descrita para produzir ambos os aderentes do substrato (tipo S) e neuroblastic (N-tipo) de células que podem sofrer transdiferenciação celular9. Como resultado, mesmo que esta linha de celular é derivada de uma seleção de triplo subclone sucessivas de células de tipo N, ele também contém um pequeno número de células do tipo S capazes de sofrer diferenciação em neurônios através do uso de retinoico ácido e derivado do cérebro Neurotrophic factor9. Isso fornece uma ferramenta que pode levar a uma melhor compreensão das complicações da córnea associado com retinopatia diabética (DM) e outras doenças oculares. Devido as dificuldades associadas com a obtenção e cultivo de neurônios de pacientes com doença ocular, este modelo 3D em vitro fornece implicações substanciais em estudar as interações neuronais e sinalizando com o estroma corneano.

Condições de doentes frequentemente afetam vários tecidos do corpo a uma escala muito grande, levando a uma qualidade de vida comprometida. Distrofias oculares são complicações comuns, frequentemente associadas com doenças sistêmicas e levam à perda de acuidade visual ou perda de visão até mesmo permanente. Estudos exaustivos muitas vezes são essenciais para uma melhor compreensão da condição da doença, bem como os efeitos a nível celular basal. Para estudar os efeitos de tais doenças, foram desenvolvidos vários modelos in vivo e in vitro com a ajuda de aplicações de engenharia de tecidos. Aplicações da engenharia do tecido corneal tem atraído grande interesse através dos vários campos da ciência10,11,12,13,14, mas existem ainda grandes limitações durante aplicação real, incluindo corneal enxerto rejeições, infecções e cicatrizes10,11,12,13,14. Existem vários estudos que desenvolveram com sucesso e estabeleceu várias em vitro modelos3,15,16,17,18, 19,20,21,22,23,24,25,26. Os modelos 3D em vitro são os mais promissores e de grande interesse científico. Modelos 3D são conhecidos para melhor espelhar na vivo celular e fisiológico eventos que são essenciais durante a fibrose e o ferimento de28,de27,de15,cura29. Estes modelos em vitro desempenham um papel integral na busca de novas abordagens terapêuticas para o tratamento de condições diferentes da doença, incluindo complicações da córnea. Apesar do papel crítico da inervação em funções da córnea, fez pouco esforço para promover a proliferação de nervo periférico dentro de construções de engenharia de tecido corneal2,3. No entanto, as construções propostas 3D em vitro celular imitam o tecido-alvo para atingir a funcionalidade do tecido desejado.

Enquanto keratopathy diabética é uma aplicação óbvia para o modelo aqui descrito por defeito neuronal, existem várias outras doenças da córnea que podem se beneficiar de um modelo humano em vitro incluindo distrofias ceratocone e Fuchs. Nosso modelo 3D emerge esta perspectiva e propõe o desenvolvimento de uma representação em vitro do tecido da córnea para avaliar a administração de medicamentos e segurança de novos medicamentos oculares.

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Protocol

Este protocolo segue as diretrizes do Conselho de revisão de Universidade de Oklahoma Health Sciences Center/institucional (IRB #4509). Todas as partes do protocolo de conheceram os princípios da declaração de Helsinki. Corneais amostras foram obtidas de desenvolvimento nacional e Instituto de pesquisa (NDRI) e o banco de olhos do Lions de Oklahoma.

1. isolamento de células primárias

  1. Após a recepção de amostras de tecido da córnea humana, transferir os tecidos em um 21,5 cm2 placa de Petri contendo 2 mL de fosfato salino de estéril Dulbecco (DPBS) (1x).
  2. Raspar e remover o epitélio corneano posicionando a córnea cúpula viradas para cima. Para garantir a remoção completa, raspar a camada epitelial cuidadosamente, usando uma lâmina de barbear em um ângulo de 45°. Em seguida, virar a córnea cúpula virada para baixo e completamente raspar o endotélio do estroma com uma lâmina de barbear em um ângulo de 45° para assegurar a completa remoção. Lave o tecido estromal com DPBS.
  3. Corte os tecidos stromal em pedaços pequenos, usando uma lâmina cirúrgica n º 10, mantendo as peças do estroma molhadas em todo tempo usando DPBS. Pegar peças do estroma com pinça estéril e coloque em um frasco de cultura T25 sem mídia (4 ou 5 pedaços de tecido de 2 x 2 mm por balão).
  4. Permitir que os explantes aderir ao fundo do balão a 37 ° C por cerca de 30-40 min. Uma vez aderido, lentamente adicione mínimo essencial meio do águia (EMEM) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% antibiótico/Antimycotic no balão sem perturbar os explantes.
  5. Delicadamente, coloque o frasco na incubadora a 37 ° C, 5% de CO2. Deixe os explantes imperturbado até as células começam a isolar e a migração do balão. Após aproximadamente 2-4 semanas, as células devem alcançar confluência de 100%. Após a confluência de 100%, passagem as células, removendo os meios de cultura de tecido e lave as células com DPBS.
  6. Adicionar tripsina para as células e então eles incubar a 37° C. Após cerca de 5 min, ver as células sob microscopia de luz, para confirmar que eles têm destacado e depois parará a proteólise adicionando mídia fresca.
  7. Transferir a suspensão de células para um tubo cônico de 15 mL por centrifugação a x 1.000 g. remover o sobrenadante cuidadosamente sem perturbar o sedimento e suspender as células no EMEM fresco 10% FBS 1% antibiótico. Contar as células e propagar a cerca de 1 x 106 células no frasco de cultura T75 para expansão ainda mais com EMEM fresco 1% FBS 1% antibiótico.

2. primário HCFs cultura e montagem de construções 3D

  1. Para montar 3D construções do explants EMEM anteriormente cultivado em 10% FBS 1% antibiótico/Antimycotic, passagem e contagem HCFs.
  2. 10% de sementes aproximadamente 1 x 106 células/poço de HCFs primários em policarbonato inserções de membrana com poros de 0,4 µm das construções 3D, juntamente com 1,5 mL de fresco EMEM FBS 1% antibiótico/Antimycotic para o topo da construção. Adicione outro 1,5 mL do mesmo meio para o fundo de cada construção.
  3. Após 24h de célula semeadura, cultura de células com EMEM 10% FBS 1% antibiótico/Antimycotic, estimulados com o ácido 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic (vitamina C) de 0,5 mM por adicionar 1,5 mL no topo e 1,5 mL na parte inferior de cada construção.
  4. Manter as culturas em uma incubadora a 37 ° C, 5% de CO2 por 3 semanas e fornecer mídia fresca todos os dias durante o período de estudo inteiro. Nenhuma passagem adicional é necessária.

3. diferenciação e co culturas de pilha

  1. Após 3 semanas, adicionar 8 x 103 células/poço de células de neuroblastoma humano SH-SY5Y no topo o 3D previamente montado constrói com 1,5 mL do EMEM contendo 10% FBS, 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic 1% antibiótico/Antimycotic e 0,5 mM ácido (vitamina C).
    1. Permitir que as células de neuroblastoma de SH-SY5Y de crescer em cima de células do estroma da córnea pelo menos 24 h antes de iniciar a diferenciação celular.
  2. Iniciar a diferenciação de células SH-SY5Y, estimulando as células com EMEM contendo 1% FBS e 1,5 mL de 10 µM ácido retinoico no topo da construção. Adicione 1,5 mL do EMEM 10% FBS 1% antibiótico/Antimycotic 0.5 mM 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic ácido (vitamina C) para o fundo de construção. Observe que o passo ácido retinoico deve ser realizado no escuro.
    1. Continue a cultura de células na mídia diferenciação por 5 dias.
  3. Quando as células atingem a fase de diferenciação, alternar as células a 1,5 mL de soro livre mídia contendo 2 nM de fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e 1% antibiótico/Antimycotic adicionado para o EMEM, adicionando ao topo da construção. Adicione 1,5 mL do EMEM 10% FBS 1% antibiótico/Antimycotic 0.5 mM 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic ácido (vitamina C) para o fundo de construção. Observe que a etapa BDNF deve ser realizada no escuro.
  4. Cultura de células para 2 dias adicionais antes do processamento para qualquer análise mais aprofundada como indicado na tabela 1.

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Representative Results

A Figura 1 é uma passo a passo imagem representativa do modelo de trabalho 3D em vitro . Na primeira etapa, as células são isoladas da córnea humana. Em seguida, são cultivadas em uma membrana de policarbonato e estimuladas com vitamina C para montar uma matriz 3D auto secretado. Este sistema de construção 3D induz a síntese de um várias camadas celulares na vivo-como matriz do estroma. Posteriormente, as células de neuroblastoma são semeadas em cima das células do estroma seguidas de diferenciação celular neuronal a iniciar. Isto leva à cultura co das células do estroma corneana e células neuronais diferenciadas no modelo 3D em vitro . A Figura 2 é a imagem de microscopia eletrônica (TEM) de transmissão de alta magnificação da construção 3D auto montada (Figura 2A), mostrando a membrana de policarbonato e as células do estroma corneana semearam no topo, secretando uma matriz auto montado seguido por (Figura 2B) diferenciada de células neuronais semearam em cima mostrando um arranjo do estroma celular neuronal. As setas na imagem mostram as células neuronais. Tendo em conta a interferência direta entre o estroma corneana e células neuronais, acreditamos que os jogadores-chave que afetam o Regulamento dos defeitos corneais existem na camada de estroma. Portanto, este modelo apresenta um humano neuronal em vitro modelo diferenciador SH-SY5Y neuroblastoma células em uma morfologia neuronal sustentável combinando-a com o nosso modelo 3D previamente estabelecido de matriz extracelular (ECM) cultivo com vários factores de diferenciação. Assim, suspeitamos que este modelo vai permitir que futuros estudos das diferenças morfológicas e moleculares entre ECM saudável e doente. Acreditamos que este modelo de romance 3D em vitro ajudará dissecar aspectos cruciais das interações estroma corneano-nervo associados com patologia da córnea e pavimentar o caminho para o desenvolvimento de novas terapias.

Figure 1
Figura 1: Imagem ilustrativa mostrando o modelo 3D em vitro co-cultura de forma faseada. Esta imagem mostra o isolamento de células da córnea humana e células estromais semeado em uma membrana de policarbonato, localizado na construção 3D, cultivadas no EMEM e estimulada com vitamina c. Além disso, diferenciada de células neuronais são mostradas para ser semeado em cima das células do estroma. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Imagem de temperatura alta ampliação do sistema 3D em vitro . (A) arranjo de células do estroma em cima da membrana de policarbonato. (B) Seeded diferenciadas células neuronais em cima das células do estroma. Escala de barras = 500 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Técnicas para análise Potenciais implicações
Reação em cadeia da polimerase em tempo real quantitativa Investigar os marcadores de colágeno (Col I, Col III e V Col), actina de músculo liso-alfa marcador fibróticas (α-SMA) e os principais mediadores no DM, incluindo o fator de crescimento de insulina-1 (IGF-1) e é o receptor (IGF1-R)
Microscopia eletrônica de transmissão Mudanças estruturais são investigadas como fibrilhas de colagénio e interações célula-ECM
Imunofluorescência Uso de anticorpos específicos, conjugado quimicamente a tintura fluorescente para investigar antígenos celulares

Tabela 1: Técnicas de análise.

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Discussion

Vários estudos têm sido focados no desenvolvimento de vários modelos de animais que podem ajudar a desenvolver uma melhor compreensão de doenças da córnea, bem como descobrir tratamentos. No entanto, um valor significativo para os seres humanos destes estudos não foi verificado. Até à data, vários em vitro modelos foram desenvolvidos e amplamente investigadas devido a sua notável importância clínica. Nosso modelo estabelecido anteriormente 3D em vitro é um sistema inovador que significativamente contribui para os avanços da ciência médica na pesquisa de visão e mostra habilidade imaculada de sintetizando na vivo eventos em vitro28 , 29 , 30. o objectivo do presente protocolo é desenvolver a próxima geração em vitro modelo da córnea que pode ser usado para estudar os mecanismos celulares e moleculares de complicações associadas a doenças da córnea como diabética bulhosa, ceratocone e Fuchs. Tal avanço pode fornecer bases sólidas para a descoberta de novos tratamentos que são muito necessárias clinicamente.

Este modelo pode ajudar na identificação de diferentes alterações estruturais e celulares no DM e outras doenças da córnea. Isto fornece implicações substanciais, incluindo a possibilidade de rastreio para estas doenças na fase inicial de potencialmente ajudar com gestão de doença. O modelo proposto aqui é simples, mas altamente inovador. Uma das vantagens mais significativas é que as células do estroma da córnea podem secretar e montar seu próprios ECM em vez de sendo propagada em um ambiente artificial. Além disso, os nervos podem diferenciar a com mais precisão as interações do nervo do estroma corneano modelo. Portanto, este método fornece a capacidade de estudar o estroma da córnea humano e rede do nervo, bem como as células que residem dentro do ambiente do estroma. Esta plataforma cultural permitirá futuras investigações de complexas interações célula-célula e célula-matriz que influenciam os Estados doentes da córnea. Esta abordagem de modelo 3D em vitro é antecipada fornecer melhorada e novos insights sobre mecanismo de doença, particularmente quando comparado à corrente convencional cultura sistemas ou modelos animais.

A geração descrita deste modelo 3D em vitro irá pavimentar o caminho para o futuro tratamento terapêutico e descobertas.

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Disclosures

Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros.

Acknowledgments

Gostaríamos de estender nossos sinceros agradecimentos ao Dr. Ben Fowler para sua ajuda técnica com os experimentos de temperatura.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Healthy corneal tissue NDRI Samples from donors with no ocular trauma or systemic disease
Dulbecco’s Phosphate Buffered Solution (1X) Gibco by Life Technologies 14190-144
Sterile forceps Fischer Scientific 13-812-42 Fisherbrand Dissecting Extra-Fine-Pointed Splinter Forceps
Single edge razor blades Personna 270100
Sterile surgical scalpel blades No.10 Feather Surgical Blade 2976#10
Eagle’s Minimum Essential Medium ATCC 30-2003
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11550 10% FBS is required for media preparation
Antibiotic-Antimycotic (100X) Gibco by Life Technologies 15240-062 1% Antibiotic-Antimycotic is required for media preparation
0.05% Trypsin EDTA(1X) Gibco by Life Technologies 25300062
Polycarbonate membrane inserts with 0.4-μm pores Corning Costar 3412
2-O-α-Dglucopyranosyl-L-ascorbic acid (Vitamin C) Sigma-Aldrich SMB00390-14 A concentration of 0.5 mM should be used for the study
Wax block VWR 50-949-027
SH-SY5Y Neuroblastoma cells ATCC SHSY5YATCC CRL-2266
Retinoic Acid Sigma-Aldrich SRP3014-10UG Final concentration of 10uM needs to be used
BDNF Sigma-Aldrich R2625-100MG Final concentration of 2nM needs to be used
Dimethyl Sulfoxide(DMSO) VWR-Alfa Aesar 67-68-5 Ultra Pure Grade-Sterile DMSO to be used
Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T25) Fisher Scientific 12-565-351
Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T75) Fisher Scientific 12-565-349

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References

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Sharif, R., Priyadarsini, S.,… More

Sharif, R., Priyadarsini, S., Rowsey, T. G., Ma, J. X., Karamichos, D. Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea. J. Vis. Exp. (131), e56308, doi:10.3791/56308 (2018).

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