Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Hornhinnans Tissue Engineering: En In Vitro modell av Stromal-nerv interaktioner av mänskliga hornhinnan

Published: January 24, 2018 doi: 10.3791/56308
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 1,2
1Department of Cell Biology, University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Department of Ophthalmology/Dean McGee Eye Institute, University of Oklahoma Health Sciences Center, 3Department of Physiology, Harold Hamm Diabetes Center, University of Oklahoma Health Sciences Center

Summary

Det här protokollet beskriver en roman tredimensionella in vitro- modell, där hornhinnan stromaceller och differentierade neuronala celler odlas tillsammans att bistå i undersökning och förståelse för samspelet mellan de två celltyper.

Abstract

Vävnadsteknik har fått betydande erkännande på grund av den höga efterfrågan på mänskliga hornhinnan ersättare med uppskattningsvis 10 miljoner människor i världen lider av hornhinnans vision förlust1. För att möta efterfrågan på livskraftiga mänskliga hornhinnor, betydande framsteg i tredimensionella (3D) vävnad har engineering gjorts2,3,4. Dessa hornhinnan modeller sträcker sig från enkla enskiktslager system multilayered modeller, leder till 3D full-tjocklek korneal medel2.

Men användningen av en 3D-vävnadstekniska hornhinnan i samband med in vitro- sjukdomsmodeller studerade till datum saknar likhet med multilayered 3D hornhinnans vävnad struktur, funktion och nätverksbyggande mellan olika celltyper (dvs, det nerv, epitel, stroma och endotel)2,3. Dessutom ökat efterfrågan på in vitro- hornhinnan vävnad modeller i ett försök att minska djurförsök för farmaceutiska produkter. Således, mer sofistikerade modeller krävs att bättre matcha system till människans fysiologiska krav, och utvecklingen av en modell som är mer relevant för patientgruppen är absolut nödvändigt. Med tanke på att flera celltyper i hornhinnan påverkas av sjukdomar och dystrofier, såsom keratokonus, diabetiker keratopati och Fuchs, innehåller denna modell en 3D samtidig kultur modell av primära mänskliga korneal fibroblaster (HCF) från friska donatorer och nervceller från SH-SY5Y cell linje. Detta gör att vi för första gången att undersöka samspelet mellan de två celltyper inom mänskliga hornhinnans vävnad. Vi anser att denna modell potentiellt kunde dissekera de bakomliggande mekanismerna är associerad med stromaceller-nerv interaktioner av hornhinnans sjukdomar som uppvisar nerv skador. Denna 3D modellen speglar den grundläggande anatomiska och fysiologiska naturen i hornhinnans vävnad i vivo och kan användas i framtiden som ett verktyg för att undersöka hornhinnan defekter samt screening effekten av olika agenter innan djurförsök.

Introduction

I den mänskliga kroppen är hornhinnan tätast innerverade vävnaden. Nerverna är ansvariga för olika förnimmelser som beröring, smärta, temperatur och har även en viktig roll i sårläkning, blinka reflexer, Riva produktion och sekretion5,6,7. I hornhinnan, stromal nerv stammar uppstår från limbala plexus och ange perifera hornhinnestroman radiellt. Stromaceller nerv organisationen är parallell med de kollagen lamellerna och de ytterligare filial till mindre fascicles när de fortsätter mot den ytliga stroma5,8. Nervfibrerna ytterligare tränger epitelskiktet och således innervation är allmänt spridda över hornhinneepitelet och stroma. Innervation har därför en viktig roll i det friska och sjuka tillståndet av hornhinnan. I detta protokoll avslöjar vi befordran av en roman 3D in vitro- modell, som är först i sitt slag att efterlikna de i vivo stromaceller-nerv interaktionerna. SH-SY5Y cell raden användes för denna studie, eftersom det är en av de mest etablerade, som väl kännetecknas linjer som används för att studera neuronal tillväxt. SH-SY5Y cell linjen har beskrivits att producera båda substrat anhängare (S-typ) och neuroblastic (N-typ) celler som kan genomgå transdifferentiation9. Som ett resultat, även om denna cellinje härleds från en trippel successiva subclone urval av N-typ celler, innehåller den också ett litet antal S-typ celler kan genomgå differentiering in nervceller genom användning av retinoic acid och hjärnan som härrör neurotrofa faktor9. Detta ger ett verktyg som kan leda till en bättre förståelse av hornhinnans komplikationer i samband med diabetesretinopati (DM) och andra ögonsjukdomar. På grund av svårigheterna med att erhålla och odlingsskålar nervceller från patienter med okulär sjukdom, ger denna 3D in vitro- modell betydande effekter i studera de neuronala interaktionerna och signalering med hornhinnestroman.

Sjuka villkor påverkar ofta olika vävnader i kroppen i mycket stor skala, vilket leder till en nedsatt livskvalitet. Okulär dystrofier är vanliga komplikationer som ofta förknippas med systemiska sjukdomar och leda till förlust av synskärpa eller ens permanent synbortfall. Omfattande studier är ofta avgörande för en bättre förståelse av sjukdomstillstånd samt effekterna på basal cellnivå. För att studera effekterna av sådana sjukdomar, har olika i vivo och in vitro- modeller utvecklats med hjälp av vävnad tekniska tillämpningar. Hornvävnad engineering program har rönt stort intresse inom olika områden av vetenskap10,11,12,13,14, men det finns fortfarande stora begränsningar under faktiska tillämpningen, inklusive korneal ympa avslag, infektioner och ärrbildning10,11,12,13,14. Det finns flera studier som har framgångsrikt utvecklat och etablerat olika in vitro- modeller3,15,16,17,18, 19,20,21,22,23,24,25,26. 3D in vitro- modellerna är de mest lovande och av stort vetenskapligt intresse. 3D-modeller är kända för att bättre spegla i vivo cellulära och fysiologiska händelser som är kritiska under fibros och såret helande15,27,28,29. Dessa in vitro- modeller spelar en viktig roll i att hitta nya terapeutiska metoder för behandling av olika sjukdomstillstånd inklusive korneal komplikationer. Trots den kritiska rollen innervation i hornhinnan funktioner gjorts lite ansträngning att främja perifer nerv spridning inom korneal vävnadstekniska konstruktioner2,3. Dock efterlikna de föreslagna 3D i vitro cell konstruktioner målvävnaden för att uppnå önskad vävnad funktionaliteten.

Även diabetiker keratopati är ett uppenbart program för den modell som beskrivs här på grund av de neuronala defekterna, finns det flera andra sjukdomar i hornhinnan som kan dra nytta av en mänsklig in vitro- modell inklusive keratokonus och Fuchs dystrofier. Vår 3D modell framgår detta framtidsperspektiv och föreslår utveckling av ett in vitro- representation av Hornvävnad att bedöma drug delivery och säkerhet av nya okulära läkemedel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Detta protokoll följer riktlinjerna för styrelsens (IRB nr 4509) universitetar av Oklahoma Health Sciences Center/institutionella granskning. Alla delar av protokollet träffade grundsatserna för förklaringen av Helsingfors. Hornhinnans prover erhölls från nationella utveckling och forskning Institutet (NDRI) och den Oklahoma Lions Eye Bank.

1. isolering av primära celler

  1. Vid mottagandet av mänskliga hornhinnan vävnadsproverna, överföra vävnader i en 21,5 cm2 petriskål innehållande 2 mL steril Dulbeccos fosfatbuffrad koksaltlösning (DPBS) (1 x).
  2. Skrapa och ta bort hornhinneepitelet genom att placera den hornhinnan dome uppåtvänt. För att säkerställa fullständig borttagning, skrapa bort epitelskiktet noga med ett rakblad i 45° vinkel. Nästa, vänd det hornhinnan dome nedåt och noggrant skrapa bort endotelet från stroma med ett rakblad i 45° vinkel att säkerställa fullständig borttagning. Tvätta den stromal vävnaden med DPBS.
  3. Skär stromal vävnader i små bitar, med hjälp av en nummer 10 kirurgiska blad, att hålla stromal bitar våt på all tid med DPBS. Hämta stromal bitar med steril pincett och placera i en T25 kultur kolv utan media (4 eller 5 bitar 2 x 2 mm vävnad per kolv).
  4. Låt de bladsticklingar att följa längst ned i kolven vid 37 ° C i ca 30-40 min. När följs, långsamt lägga till örnens minsta viktigt medium (EMEM) innehållande 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% antibiotika/Antimycotic till kolven utan att störa bladsticklingar.
  5. Försiktigt placera kolven i inkubatorn vid 37 ° C, 5% CO2. Lämna bladsticklingar ostört tills cellerna börjar isolera och migrera i kolven. Efter cirka 2-4 veckor, bör celler nå 100% sammanflödet. Vid 100% confluence, passage cellerna genom att ta bort vävnad kulturmassmedia och tvätta cellerna med DPBS.
  6. Lägg till trypsin i cellerna och sedan ruva dem vid 37° C. Visa cellerna under ljusmikroskop att bekräfta att de har lossnat efter cirka 5 minuter, och sedan stoppa proteolys genom att lägga till färska media.
  7. Överföra cellsuspensionen i en 15 mL koniska rör för centrifugering vid 1000 x g. avlägsna supernatanten försiktigt utan att störa pelleten och avbryta cellerna i färska EMEM 10% FBS 1% antibiotika. Räkna cellerna och utsäde ca 1 x 106 celler i T75 kultur kolv för vidare expansion med färska EMEM 1% FBS 1% antibiotika.

2. primär HCF kultur och 3D konstruktioner församling

  1. För att montera 3D konstruktioner från explants tidigare odlade i EMEM 10% FBS 1% antibiotika/Antimycotic, passage och räkna HCF.
  2. Utsäde ca 1 x 106 celler per brunn av primära HCF på polykarbonat membran skär med 0,4 µm porer från 3D konstruktioner, tillsammans med 1,5 mL färsk EMEM 10% FBS 1% antibiotika/Antimycotic till toppen av konstruktionen. Lägga till ytterligare 1,5 mL av samma media i botten av varje konstruktion.
  3. Efter 24 h av cell sådd, odla cellerna med EMEM 10% FBS 1% antibiotika/Antimycotic, stimuleras med 0,5 mM 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic syra (Vitamin C) genom att lägga till 1,5 mL på toppen och 1,5 mL på undersidan av varje konstruktion.
  4. Upprätthålla kulturerna i en inkubator vid 37 ° C, 5% CO2 i 3 veckor och leverera färska media varannan dag under hela studietiden. Det behövs ingen ytterligare passage.

3. cell differentiering och samtidig kulturer

  1. Lägg till 8 x 103 celler per brunn av SH-SY5Y mänskliga neuroblastomceller på toppen av den tidigare monterade 3D konstruerar innehållande 1,5 mL av den EMEM som innehåller 10% efter 3 veckor, FBS, 1% antibiotika/Antimycotic och 0,5 mM 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic syra (Vitamin C).
    1. Att SH-SY5Y neuroblastomceller att växa ovanpå de hornhinnan stromaceller under minst 24 h innan celldifferentiering.
  2. Initiera SH-SY5Y celldifferentiering genom att stimulera cellerna med EMEM som innehåller 1% FBS och 1,5 mL 10 µM retinoinsyra ovanpå konstruktionen. Tillsätt 1,5 mL av EMEM 10% FBS 1% antibiotika/Antimycotic 0,5 mM 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic syra (Vitamin C) till botten av konstruktionen. Observera att steget retinoinsyra bör utföras i mörkret.
    1. Fortsätta att odla cellerna i denna differentiering media i 5 dagar.
  3. När cellerna når fasen differentiering, växla cellerna till 1,5 mL serum-fria medier som innehåller 2 nM till hjärnan som härrör neurotrofa faktorn (BDNF) och 1% antibiotika/Antimycotic tillsätts EMEM, genom att lägga till toppen av konstruktionen. Tillsätt 1,5 mL av EMEM 10% FBS 1% antibiotika/Antimycotic 0,5 mM 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic syra (Vitamin C) till botten av konstruktionen. Observera att BDNF steget bör utföras i mörkret.
  4. Odla cellerna för ytterligare 2 dagar innan de bearbetas för vidare analys som anges i tabell 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 är en stegvisa representativ bild av 3D i vitro arbetsmodellen. Vid det första steget är celler isolerade från mänskliga hornhinnor. Sedan, de odlas på en polykarbonat membran och stimuleras med Vitamin C för att montera en egen utsöndrade 3D matrix. Denna 3D konstruera systemet inducerar syntesen av en multilayered cellulära i vivo-som stromal matris. Därefter är neuroblastomceller seedade ovanpå de stromaceller som följt genom att initiera neuronala celldifferentiering. Detta leder till samtidig kulturen av hornhinnans stromaceller och differentierade neuronala celler i 3D in vitro- modellen. Figur 2 är hög förstoring överföring elektronmikroskopi (TEM) bilden av den 3D själv monterade Konstrukt (figur 2A) visar polykarbonat membranet och de hornhinnan stromaceller seedade ovanpå, utsöndrar en själv monterade matris följt av (figur 2B) differentierade neuronala celler seedade på toppen visar en stromal neuronala cell arrangemang. Pilarna i bilden visar de neuronala cellerna. Tanke direkt överhörning mellan hornhinnestroman och neuronala celler, anser vi de viktigaste aktörerna som påverkar regleringen av hornhinnans defekterna finns i stroma lagret. Därför, denna modell presenterar en mänsklig neuronala in vitro- modell särskiljande SH-SY5Y neuroblastoma celler till en hållbar neuronala morfologi genom att kombinera det med våra tidigare etablerade 3D-modell av extracellulär matrix (ECM) odling med olika särskiljande faktorer. Således, vi misstänker att denna modell kommer att möjliggöra framtida studier av morfologiska och molekylära skillnaderna mellan frisk och sjuk ECM. Vi tror att denna nya 3D in vitro- modell kommer att dissekera avgörande aspekter av hornhinnans stroma-nerv interaktioner är associerad med hornhinnan patologi och bana väg för utvecklingen av nya therapeutics.

Figure 1
Figur 1: belysande bild visar samtidig kultur 3D in vitro- modellen i en stegvis sätt. Denna bild visar den cell isoleringen från mänskliga hornhinnan och stromaceller seedade på en polykarbonat membran, ligger i den 3D-konstruktionen, odlade i EMEM och stimuleras med Vitamin C. Dessutom visas differentierade neuronala celler vara seedad ovanpå stromaceller. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Hög förstoring TEM bild av 3D in vitro- systemet. (A) stromaceller arrangemang ovanpå polykarbonat membranet. (B) Seeded differentierade neuronala celler ovanpå stromaceller. Skala barer = 500 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Tekniker för analys Potentiella implikationer för
Kvantitativ realtids Polymerase Chain Reaction Undersöka kollagen markörer (Col I, Col III och Col V), fibrotiska markör alpha-Smooth muscle aktin (α-SMA) och viktiga mediatorer i DM inklusive Insulin tillväxtfaktor-1 (IGF-1) och det är receptor (IGF1-R)
Transmissionselektronmikroskopi Strukturella förändringar utreds såsom kollagen fibriller och cell-ECM interaktioner
Immunofluorescens Användning av specifika antikroppar kemiskt konjugerat med fluorescerande färg att undersöka cellulära antigener

Tabell 1: Analystekniker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Flera studier har fokuserat på att utveckla olika djurmodeller som kan bidra till att utveckla en bättre förståelse av sjukdomar i hornhinnan samt upptäcka behandlingar. Dock har ett betydande värde för människor från dessa studier inte verifierats. Hittills har har olika in vitro- modeller utvecklats och allmänt utreds på grund av deras anmärkningsvärda klinisk betydelse. Vår tidigare etablerade 3D in vitro- modell är en roman system som avsevärt bidrar till medicinsk vetenskap framsteg inom vision forskning och visar obefläckade förmåga går igenom i vivo händelser in vitro-28 , 29 , 30. Syftet med detta protokoll är att utveckla nästa generation av denna i vitro korneal modell som kan användas för att studera cellulära och molekylära mekanismer av komplikationer i samband med hornhinnan sjukdomar såsom diabetes keratopati, keratokonus , och Fuchs. Sådana avancemang kunde ge solida grunder mot upptäckten av nya behandlingar som behövs mycket kliniskt.

Denna modell kan hjälpa att identifiera olika strukturella och cellulära förändringar som sker i DM och andra sjukdomar i hornhinnan. Detta ger betydande effekter, inklusive möjligheten för screening för dessa sjukdomar i ett inledande skede att eventuellt hjälpa till med hantering av sjukdomar. Modellen som föreslås här är enkel, men det är mycket innovativa. En av de viktigaste fördelarna är att de hornhinnan stromaceller tillåts att utsöndra och montera sin egen ECM i stället för att bli seedad till en konstgjord miljö. Dessutom tillåts nerver att differentiera till mer exakt modell korneal stromal nerv interaktioner. Därför ger denna metod möjlighet att studera mänskliga hornhinnestroman och nerven knyter, samt de celler som finns i stroma-miljön. Denna kulturella plattform kommer att tillåta framtida utredningar för komplexa cell-cell och cell-matrix interaktioner som kan påverkar sjuka påstår av hornhinnan. Denna 3D i vitro modellstrategi förväntas för att ge förbättrad och romanen insikt sjukdom mekanism, särskilt jämfört med nuvarande konventionella kultur system eller djurmodeller.

Den beskrivna generationen av denna 3D in vitro- modell kommer att bana väg för framtida terapeutisk behandling och upptäckter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar inget konkurrerande finansiella intressen.

Acknowledgments

Vi vill utöka vårt uppriktiga tack Dr Ben Fowler för hans tekniska hjälp med TEM experimenten.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Healthy corneal tissue NDRI Samples from donors with no ocular trauma or systemic disease
Dulbecco’s Phosphate Buffered Solution (1X) Gibco by Life Technologies 14190-144
Sterile forceps Fischer Scientific 13-812-42 Fisherbrand Dissecting Extra-Fine-Pointed Splinter Forceps
Single edge razor blades Personna 270100
Sterile surgical scalpel blades No.10 Feather Surgical Blade 2976#10
Eagle’s Minimum Essential Medium ATCC 30-2003
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11550 10% FBS is required for media preparation
Antibiotic-Antimycotic (100X) Gibco by Life Technologies 15240-062 1% Antibiotic-Antimycotic is required for media preparation
0.05% Trypsin EDTA(1X) Gibco by Life Technologies 25300062
Polycarbonate membrane inserts with 0.4-μm pores Corning Costar 3412
2-O-α-Dglucopyranosyl-L-ascorbic acid (Vitamin C) Sigma-Aldrich SMB00390-14 A concentration of 0.5 mM should be used for the study
Wax block VWR 50-949-027
SH-SY5Y Neuroblastoma cells ATCC SHSY5YATCC CRL-2266
Retinoic Acid Sigma-Aldrich SRP3014-10UG Final concentration of 10uM needs to be used
BDNF Sigma-Aldrich R2625-100MG Final concentration of 2nM needs to be used
Dimethyl Sulfoxide(DMSO) VWR-Alfa Aesar 67-68-5 Ultra Pure Grade-Sterile DMSO to be used
Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T25) Fisher Scientific 12-565-351
Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T75) Fisher Scientific 12-565-349

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. Br J Ophthalmol. 96 (5), 614-618 (2012).
  2. Rönkkö, S., Vellonen, K. -S., Järvinen, K., Toropainen, E., Urtti, A. Human corneal cell culture models for drug toxicity studies. Drug Delivery and Translational Research. 6 (6), 660-675 (2016).
  3. Ghezzi, C. E., Rnjak-Kovacina, J., Kaplan, D. L. Corneal tissue engineering: recent advances and future perspectives. Tissue Eng Part B Rev. 21 (3), 278-287 (2015).
  4. Shafaie, S., Hutter, V., Cook, M. T., Brown, M. B., Chau, D. Y. S. In Vitro Cell Models for Ophthalmic Drug Development Applications. BioResearch Open Access. 5 (1), 94-108 (2016).
  5. Shaheen, B. S., Bakir, M., Jain, S. Corneal nerves in health and disease. Surv Ophthalmol. 59 (3), 263-285 (2014).
  6. Beuerman, R. W., Schimmelpfennig, B. Sensory denervation of the rabbit cornea affects epithelial properties. Exp Neurol. 69 (1), 196-201 (1980).
  7. Heigle, T. J., Pflugfelder, S. C. Aqueous tear production in patients with neurotrophic keratitis. Cornea. 15 (2), 135-138 (1996).
  8. Wang, S., et al. In vitro 3D corneal tissue model with epithelium, stroma, and innervation. Biomaterials. 112, 1-9 (2017).
  9. Ross, R. A., Spengler, B. A., Biedler, J. L. Coordinate morphological and biochemical interconversion of human neuroblastoma cells. J Natl Cancer Inst. 71 (4), 741-747 (1983).
  10. Griffith, L. G., Naughton, G. Tissue engineering - Current challenges and expanding opportunities. Science. 295 (5557), (2002).
  11. Guo, X., et al. Morphologic characterization of organized extracellular matrix deposition by ascorbic acid-stimulated human corneal fibroblasts. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (9), 4050-4060 (2007).
  12. Karamichos, D. Ocular tissue engineering: current and future directions. J Funct Biomater. 6 (1), 77-80 (2015).
  13. Karamichos, D., Brown, R. A., Mudera, V. Collagen stiffness regulates cellular contraction and matrix remodeling gene expression. J Biomed Mater Res A. 83 (3), 887-894 (2007).
  14. Ruberti, J. W., Zieske, J. D. Prelude to corneal tissue engineering - gaining control of collagen organization. Prog Retin Eye Res. 27 (5), 549-577 (2008).
  15. Karamichos, D., Guo, X. Q., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Human corneal fibrosis: an in vitro model. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (3), 1382-1388 (2010).
  16. Chen, F. M., Liu, X. Advancing biomaterials of human origin for tissue engineering. Prog Polym Sci. 53, 86-168 (2016).
  17. Priyadarsini, S., Sarker-Nag, A., Rowsey, T. G., Ma, J. X., Karamichos, D. Establishment of a 3D In Vitro Model to Accelerate the Development of Human Therapies against Corneal Diabetes. PLoS One. 11 (12), e0168845 (2016).
  18. Karamichos, D., Hjortdal, J. Keratoconus: tissue engineering and biomaterials. J Funct Biomater. 5 (3), 111-134 (2014).
  19. Wilson, S. L., Yang, Y., El Haj, A. J. Corneal Stromal Cell Plasticity: In Vitro Regulation of Cell Phenotype Through Cell-Cell Interactions in a Three-Dimensional Model. Tissue Engineering Part A. 20 (1-2), 225-238 (2014).
  20. Proulx, S., et al. Reconstruction of a human cornea by the self-assembly approach of tissue engineering using the three native cell types. Molecular Vision. 16 (234-236), 2192-2201 (2010).
  21. Gonzalez-Andrades, M., et al. Establishment of a novel in vitro model of stratified epithelial wound healing with barrier function. Sci Rep. 6, 19395 (2016).
  22. Hopkins, A. M., DeSimone, E., Chwalek, K., Kaplan, D. L. 3D in vitro modeling of the central nervous system. Prog Neurobiol. 125, 1-25 (2015).
  23. Schulz, S., et al. Natural Corneal Cell-Based Microenvironment as Prerequisite for Balanced 3D Corneal Epithelial Morphogenesis: A Promising Animal Experiment-Abandoning Tool in Ophthalmology. Tissue Engineering Part C-Methods. 20 (4), 297-307 (2014).
  24. Gao, J., Wang, Y., Zhao, X., Chen, P., Xie, L. MicroRNA-204-5p-Mediated Regulation of SIRT1 Contributes to the Delay of Epithelial Cell Cycle Traversal in Diabetic Corneas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (3), 1493-1504 (2015).
  25. Koulikovska, M., et al. Enhanced regeneration of corneal tissue via a bioengineered collagen construct implanted by a nondisruptive surgical technique. Tissue Eng Part A. 21 (5-6), 1116-1130 (2015).
  26. Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in retinal and eye research. 49, 17-45 (2015).
  27. Zieske, J. D. Extracellular matrix and wound healing. Curr Opin Ophthalmol. 12 (4), 237-241 (2001).
  28. Karamichos, D., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Transforming growth factor-beta3 regulates assembly of a non-fibrotic matrix in a 3D corneal model. J Tissue Eng Regen Med. 5 (8), e228-e238 (2011).
  29. Karamichos, D., Lakshman, N., Petroll, W. M. An experimental model for assessing fibroblast migration in 3-D collagen matrices. Cell Motil Cytoskeleton. 66 (1), 1-9 (2009).
  30. Karamichos, D., et al. Novel in Vitro Model for Keratoconus Disease. J Funct Biomater. 3 (4), 760-775 (2012).

Tags

Utvecklingsbiologi fråga 131 hornhinnan 3D in vitro- modell mänskliga korneal fibroblaster samtidig kultur neuronala celler C-vitamin
Hornhinnans Tissue Engineering: En <em>In Vitro</em> modell av Stromal-nerv interaktioner av mänskliga hornhinnan
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sharif, R., Priyadarsini, S.,… More

Sharif, R., Priyadarsini, S., Rowsey, T. G., Ma, J. X., Karamichos, D. Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea. J. Vis. Exp. (131), e56308, doi:10.3791/56308 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter