Desenvolvimento de um modelo humano pré-clínicos de Osteoclastogenesis de monócitos do sangue periférico co cultivados com linhas de células de câncer de mama

Resumo

Este protocolo descreve o desenvolvimento de uma em vitro humana pré-clínicos modelo de osteoclastogenesis de monócitos do sangue periférico cultivados com linhas de células de câncer de mama para simular a interação de osteoclasto-célula de câncer. O modelo pode ser usado para promover nossa compreensão da formação de metástase óssea e melhorar as opções terapêuticas.

Resumo

O crosstalk entre células tumorais e células ósseas no microambiente do osso é crucial para a compreensão do mecanismo de formação de metástase óssea. Desenvolvemos um em vitro totalmente pré-clínicos modelo humano de um co-cultura de células de câncer de mama e monócitos, passando por diferenciação no sentido de osteoclastos. Nós aperfeiçoamos um modelo de osteoclastogenesis a partir de uma amostra de sangue periférico coletada de doadores saudáveis. Células mononucleares de sangue periférico (PBMC) primeiro foram separadas por centrifugação gradiente de densidade, semeadas em uma densidade elevada e induzidas a diferenciar-se pela adição de dois fatores de crescimento (GFs): ativador do receptor do ligante fator nuclear-κB (RANKL) e macrófagos fator colônia-estimulando (MCSF). As células foram deixadas na cultura durante 14 dias e então fixo e analisadas pela análise a jusante. Em metástases ósseas osteolíticas, um dos efeitos da chegada de células de câncer no osso é a indução de osteoclastogenesis. Assim, desafiamos nosso modelo com colegas de culturas de células de câncer de mama para estudar o poder de diferenciação de células de câncer com relação a GFs. Uma maneira simples de estudar a interação de osteoclasto-célula de câncer é realizar culturas co indirectas, baseadas na utilização do meio condicionado colhidos em culturas de células de câncer de mama e misturado com meio fresco. Esta mistura é usada para induzir a diferenciação do osteoclast. Nós também Aperfeiçoamos um método de co-cultura direto no qual câncer células e passando por diferenciação de monócitos compartilham o meio em trocam de fatores secretados. Isto é uma melhoria significativa sobre o método indireto co-cultura original como pesquisadores podem observar as interações recíprocas a tipos de duas células e realizar análises a jusante para as células cancerosas e osteoclastos. Este método permite-nos estudar o efeito das drogas sobre o microambiente metástase óssea e às linhas de célula semente que não sejam aqueles derivados de câncer de mama. O modelo também pode ser usado para estudar outras doenças como a osteoporose ou outras condições de osso.

Introdução

Osso é um local comum de metástases para diferentes tipos de tumores primários, como o câncer de próstata, pulmão e mama, com 20-25% dos pacientes desenvolvendo metástases ósseas durante o curso da doença.^1,2,3. Em particular, 70% dos pacientes de câncer de mama carregar evidências de metástases ósseas em morte⁴. Tumor e células estromais interação é essencial para a progressão do câncer em câncer primário e lesões secundárias. No microambiente do osso, metástases ósseas osteolíticas de câncer de mama dependem do estabelecimento de um ciclo vicioso patológico ocorrendo entre as células cancerosas, células ósseas e o microambiente do osso. As células cancerosas perturbam o equilíbrio do osso, aumentando a reabsorção de osso^5,6,7.

Em condições normais e patológicas, osteoclastos são as células responsáveis pela reabsorção óssea, enquanto que os osteoblastos, em depositar a nova matriz, são responsáveis pela formação de osso novo⁸. Atividade do osteoclasto é regulada por osteoblastos através da expressão de RANKL, que liga a seu receptor RANK na superfície de pre-osteoclasto, induzindo pre-osteoclast fusão, um processo necessário para diferenciação em osteoclastos maduros. A indução de osteoclastogenesis aumenta a reabsorção óssea. Um grande número de estudos em vivo melhoraram significativamente a nossa compreensão da metástase óssea formação^9,10,de¹¹. Células de câncer de mama do tumor primário e o microambiente ósseo perturbam a homeostase do osso, promovendo osteoclastogenesis e osso reabsorção⁸. Neste cenário, todas as interações moleculares que ocorrem entre as células cancerosas e osteoclastos são de importância crucial. Como já mencionado, o mecanismo de formação de metástase óssea já foi elucidado em modelos de ratos na vivo . No entanto, para além da necessidade de aprovação de todos na vivo as experiências com animais pelo Comitê de ética, existem vários outros inconvenientes para realizar experimentos na vivo incluindo altos custos e demorados métodos. Vários autores têm combinado pré-clínicos modelos in vivo e in vitro de osteoclastogenesis usando uma linha de murino de pre-osteoclastos chamado RAW246.7^9,10,11. As desvantagens deste modelo derivam do fato de que as células já estão empenhadas em tornar-se pre-osteoclastos e não são de origem humana. Por estas razões, pesquisa translacional poderia beneficiar grandemente a disponibilidade em vitro plenamente humano modelos pré-clínicos para estudar interações de célula de câncer de osso.

Nós aperfeiçoamos um método de osteoclastogenesis em vitro a partir de amostras de sangue periférico humano^12,13. Os osteoclastos derivam de monócitos, que estão presentes, embora em pequeno grau, em amostras de sangue periférico. Células mononucleares são primeiro separou os eritrócitos e granulócitos presentes em sangue total por gradiente de densidade Ficoll; Eles são então selecionados graças a sua capacidade de aderir ao substrato plástico, ao contrário dos linfócitos. Após a semeadura, as células são cultivadas por 14 dias. MCSF e RANKL são o GFs exigido por monócitos para diferenciar primeiro em macrófagos e depois em osteoclastos^14,15. MCSF é necessária para toda a duração do ensaio, enquanto RANKL é usado para induzir o processo de diferenciação em estágios finais de osteoclastogenesis. Na fase inicial de diferenciação, MCSF ajuda monócitos proliferam e sobreviver^14,15. Durante a segunda parte do osteoclastogenesis, as células se fundem e amadurecem como osteoclastos, mostrando a distribuição característica de actina F em anéis e expressando marcadores específicos tais como a fosfatase ácida tartarato-resistente (TRAP) e receptor de calcitonina (CTR) ^{14 , 15}. nosso método consiste em Adicionar MCSF para a cultura de monócitos para os primeiros 7 dias do experimento e uma combinação de MCSF e RANKL dos dias 7 a 14. No final do experimento, osteoclastogenesis é analisado pela contagem de células diferenciadas, conforme detalhado abaixo.

As culturas de monócitos induzidas para diferenciar pelo GFs formam a base do nosso modelo pré-clínicos. Nós aperfeiçoamos um sistema co-cultura sem GFs para entender melhor o poder de osteoclastogenic de células de câncer de mama. Primeiro desenvolvemos um modelo de culturas co indiretos adicionando uma média (80% α-meio essencial mínimo (α-MEM) e 20% condicionado médio coletado de uma cultura de células de câncer de mama que foram confluente cerca de 90% de células em fase de diferenciação¹² . O meio condicionado (não recolhido em condições de privação de soro) foi coletado após 24 horas e misturado com meio fresco em uma proporção de 1:4. O meio condicionado induzido diferenciação osteoclast significativa em relação ao controle negativo. No entanto, como as informações sobre a interação recíproca entre as células cancerosas e células ósseas são perdidas quando utilizar culturas co indiretas, melhoramos nosso sistema efectuando culturas co diretas. Temos semeado células cancerosas em 0,4 µM insere e colocou-os em poços onde as células mononucleares foram banhadas. Usando esse método, as células compartilham o mesmo meio e trocam proteínas secretadas. Assim, criamos um modelo totalmente humano pré-clínicos de osteoclastogenesis induzida por câncer células¹³.

Este sistema é extremamente versátil e pode ser usado para fins de investigação diferentes, por exemplo, em estudos farmacológicos, investigando o papel das drogas na metástase óssea. Nosso modelo torna possível estudar a eficácia e os mecanismos de ação das terapias de osso-alvo e/ou drogas antitumorais no microambiente de osso na presença de células de câncer¹³. Projetando os experimentos com os controles corretos, ou seja, as células cancerosas e osteoclastos cultivados individualmente, torna mais fácil compreender o impacto da cultura co na atividade de drogas. Esta abordagem se torna ainda mais interessante quando ambos câncer células e osteoclastos, por exemplo, everolimus¹⁶destina-se a droga em estudo. Este modelo também pode ser usado para identificar novos caminhos de interação entre as células cancerosas e células ósseas.

Protocolo

osteoclastos humanos foram diferenciados de PBMC de doadores saudáveis que deu consentimento escrito para participar no estudo. O protocolo de estudo foi aprovado pelo Comitê de ética local, em conformidade com os padrões éticos estabelecidos na declaração de Helsinque 1964.

1. diferenciação osteoclast

Nota: coletar sangue periférico ou casacos de buffy de doadores humanos saudáveis em EDTA. Não use a menos de 20 mL de sangue periférico. Casacos de Buffy são preferíveis porque eles têm uma maior abundância de células mononucleares. Executar todas as etapas a seguir em uma capa de cultura de tecido estéril.

1. Sangue total de EDTA diluir 1:1 com 1 x tampão fosfato salino (PBS). Re-suspender bem.
2. Camada na mídia de separação de linfócitos (PBS de sangue: mídia de separação de linfócitos, 2:1) em tubos de 50 mL.
   1. Pipetar 30 mL de sangue diluído em PBS em um tubo de 50 mL.
   2. Suavemente subjacência 15 mL de mídia de separação de linfócitos na parte inferior do tubo de 50 mL.
3. Centrifugar 757 × g por 10 min à temperatura ambiente (sem freios).
4. Coleta as células mononucleares:
   1. recolher a camada branca de células mononucleares com uma pipeta de 5 mL, sem agitação e colocá-lo em um novo tubo de 50 mL.
   2. Diluir os PBMCs coletados com 20 mL de PBS.
5. Lavar o PBMC:
   1. centrifugar 225 x g por 5 min à temperatura ambiente.
   2. Desprezar o sobrenadante por inversão do tubo. Repetir uma vez.
6. Lise RBC:
   Nota: se o centrifugado é vermelho, tratar as células com células vermelhas do sangue solução-tampão de lise (ver Tabela de materiais).
   1. Colocar o tubo de 50 mL na Ice.
   2. Adicionar 5 mL de tampão de Lise glóbulo vermelho.
   3. Esperar 3-5 min para completar a lise de eritrócitos. O tempo varia de acordo com o grau de contaminação eritrocitária.
   4. Pare a reação adicionando 20 mL de PBS.
   5. Centrífuga em 225 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Descartar o sobrenadante por inversão do tubo.
      Nota: Opcional: se a Lise RBC é executada, lave os PBMCs conforme descrito abaixo.
7. Lavagem PBMCs:
   1. Adicionar 20 mL de PBS e centrifugar a 225 x g durante 5 min à temperatura ambiente.
   2. Desprezar o sobrenadante por inversão do tubo.
8. Re-suspender as células em completa α-MEM (suplementados com glutamina 1% (concentração inicial 100 X) e 10% de soro fetal bovino).
9. Contar as células com uma câmara de Neubauer.
   1. Diluir a amostra 1: 100 em ácido acético glacial e usar 10 µ l da diluição para contar células.
   2. Contar pelo menos duas vezes e calcular a média de repetições para obter o número médio total de células coletadas.
10. Células da placa:
    1. placa de células em uma concentração de 750.000 PBMC por cm ².
    2. Armazenar células chapeadas em uma incubadora a 37 ° C numa atmosfera 5% CO ₂.
       Nota: Design o experimento para incluir controles negativos, que são as células que são tratadas com α-MEM completa normal sem MCSF ou RANKL GFs. Lembre-se para realizar cada condição pelo menos 3 técnicos de Replica. Realizar pelo menos 3 réplicas biológicas.
11. Alterar o suplementado com GFs:
    1. esperar cerca de 3 h após a semeadura da célula e remova o meio com uma pipeta (200-1.000 µ l) para descarte de detritos, células desanexadas e eritrócitos.
       Nota: Tenha cuidado ao alterar o meio para evitar o desprendimento celular.
    2. Adicionar novo completo α-MEM suplementado com 20 ng/mL de MCSF (500 µ l/poço).
       Nota: Quando co cultivo com células cancerosas, semente do câncer células o dia após a semeadura de PBMC.
12. Alterar os meios de comunicação a cada 2-3 dias (α-MEM suplementado com 20 ng/mL de MCSF):
    1. descartar o meio de uma pipeta de µ l 200-1.000.
    2. Add novo meio fresco por pipeta 200-1.000 µ l.
13. 6-7 dias após a semeadura de células, adicionar 20 ng/mL de RANKL para α completa-MEM + MCSF.
14. Mudar o médio (α completa-RANKL + MEM + MCSF) cada 2-3 dias:
    1. descartar o meio de uma pipeta de µ l 200-1.000.
    2. Adicionar novo meio de uma pipeta de µ l 200-1.000. Pare de indução de diferenciação 14 dias após a semeadura de célula.
    3. Meio de descarte e lavar duas vezes com PBS.
15. Corrigir células com paraformaldeído:
    1. deixar células secar.
    2. Adicionar paraformaldeído 4% (ver Tabela de materiais).
    3. Incubar por 20 min em temperatura ambiente.
16. Descartar paraformaldeído e lavar duas vezes com 500 µ l de PBS.
    Cuidado: Paraformaldehyde é tóxico; por favor, usar luvas, máscara e óculos.
17. Permitir que células secar.
18. Armadilha realizar a coloração de acordo com o fabricante ' instruções de s (veja a Tabela de materiais).
19. Contar células osteoclasto manualmente sob o microscópio ampliação de 10x; AT 0,30.
    Nota: Células osteoclasto são definidas como armadilha + polycarion células com pelo menos 4 núcleos.

2. Culturas de células de câncer

Nota: as experiências podem ser executadas com diferentes tipos de linhas de células de adenocarcinoma de mama como SCP2 ¹⁷, uma linha de celular osteotropic originários do triplo negativo humano linhagem de células de câncer de mama (MDA-MB-231) e a linha hormonal positivo do receptor celular MCF7.

1. Cultura as células como um monolayer 75cm ² frascos.
   1. Semente 1.000.000 células cancerosas em um frasco de 75 cm ².
   2. Armazenar as células a 37 ° C em meio α completa-MEM suplementado com 1%-glutamina e 10% o soro bovino fetal numa atmosfera 5% CO ₂.
2. Separar as células em uma confluência de cerca de 90%:
   1. descartar o meio de lavagem com PBS e adicionar 2-3 mL de tripsina 1 X em PBS.
   2. Incubar células para 3-5 min a 37 ° C.
   3. Recolher as células desanexadas de 75cm ² frasco de uma pipeta de 10 mL, adicionar 8 mL de meio completo para parar a reação enzimática.
   4. Centrifugar a 225 x g por 5 min.
3. Lavar as células cancerosas:
   1. Adicionar 10 mL de PBS.
   2. Centrifugar a 600 x g por 5 min.
4. Contar as células de câncer com uma câmara de Neubauer.
   1. Contar as células de câncer de pelo menos duas vezes e calcular a média de repetições para obter o número médio total de células coletadas.

3. Direto co culturas de células cancerosas um nd monócitos submetidos à diferenciação no sentido de osteoclastos

1. propagar as células cancerosas em inserções (poros de diâmetro 0.4 µm):
   1. propagar as células cancerosas em uma concentração de 4.000 células por cm ².
   2. Incubar a 37 ° C e 5% de CO ₂.
      Nota: Semente do câncer células o dia depois de PBMC semeando para o experimento de co-cultura em 0,4 µm inserções.
2. Esperar 24 h permitir que as células aderir.
3. Lugar o semeado inserir cultura sobre as culturas mononucleares para iniciar a cultura co (ver secção 1.10 do protocolo).
4. Mudar a mídia cada 2-3 dias com α-MEM completa.
   1. Descartar o meio de uma pipeta de µ l 200-1.000.
   2. Adicionar 500 µ l de fresco médio.
      Nota: O objectivo principal da cultura co é entender o poder de osteoclastogenic das células cancerosas, portanto, o GFs não é adicionado ao α-MEM. Em cada experimento de co-cultura, incluem necontroles gative (ver nota na etapa 1.10 do protocolo) e controlos positivos de osteoclastos diferenciados por RANKL e MCSF (sem células cancerosas). As células cancerosas semeadas nas bulas não colocadas sobre células mononucleares são usadas como um controle negativo da cultura co.
5. Pare a co-cultura e usar células cancerosas para análise a jusante:
   1. 13 dias após a semeadura de PBMC e 12 dias após câncer célula de semeadura, coloque a inserção em um prato novo.
   2. Parar de cultura de células de câncer com base nos quais a jusante análises devem ser executadas (ver discussão).
6. No dia 14, pare de diferenciação osteoclasto e reparar as células, como relatado na etapa 1.15.
7. Armadilha realizar coloração imediatamente ou no prazo de 14 a 30 dias.
   Nota: Coloração opcional: para confirmar que a armadilha + polycarion células são os osteoclastos, pesquisadores podem realizar coloração adicional para detectar CTR, um marcador de osteoclast-específicos. A detecção de anéis de F-Actina é mais específico osteoclast coloração ensaio ^{12 , 13 , 14}.

Resultados

Um método foi otimizado para diferenciar facilmente osteoclastos dos monócitos do sangue periférico humano. A cultura de monócitos foi cultivada com células cancerosas, confirmando (conforme descrito na literatura¹⁸) que as células cancerosas são capazes de sustentar osteoclastogenesis em metástases ósseas. Osteoclastos, diferenciadas das células cancerosas e GFs são mostrados na Figura 1. Uma célula tipo osteoclasto é uma célula com 4...

Discussão

Modelos pré-clínicos em vitro estudando os mecanismos de interferência entre células cancerosas e células ósseas são necessários para identificar mecanismos de metástase óssea que pode ser usado para criar novas estratégias terapêuticas. Desenvolvemos um modelo totalmente humano em vitro de osteoclastogenesis de sangue periférico humano (Figura 3). Durante a otimização da metodologia, um número de pontos críticos foram identificado e resolvido. O primeiro diz respeito à qua...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
&alfa; MEM	Euroclone	BE12-169F
Glutamina	Life-technologies	ECB3000D
Soro fetal bovino	Life-technologies	ECS0180DPR
hMCSF	Peprotech	300-25	indicações de armazenamento devem ser respeitadas
hRANKL	Peprotech	310-01	indicações de armazenamento devem ser respeitadas
Fosfatase ácida, Kit de leucócitos (TRAP)	Sigma Aldrich	387 A
Meio de separação de linfócitos	Biowest	L0560-100
Tampão de lise de glóbulos vermelhos	SIgma	11814389001 ROCHE
Tripsina	EuroClone	COD. ECB3052D
Solução aquosa de paraformaldeído a 4%,	microscopia eletrônica	157-4-100
MDA-MB-231 linha celular	ATCC	CRM-HTB-267
MCF7	ATCC	HTB-22
Transwell	Corning	3470-Clear	Estes insertos são para placas de 24 poços; 6,5 mm, 0,4 μ Tamanho do poro M;