Um método geral para detectar a formação de Nitrosamide no metabolismo In Vitro de nitrosaminas por citocromo P450s

Resumo

Α-hidroxilação de nitrosaminas cancerígenas pelo citocromo P450s é a aceita via metabólica que produz o DNA de danos intermediários, que causam mutações. No entanto, novos dados indicam mais pode ocorrer oxidação para nitrosamides. Descrevemos um general método para a detecção de nitrosamides produzidos a partir de em vitro citocromo P450-catalisada metabolismo de nitrosaminas.

Resumo

N-nitrosaminas são um grupo bem estabelecido de agentes cancerígenos ambientais, que requerem a oxidação do citocromo P450 que apresentam atividade. O mecanismo aceito de activação metabólica envolve a formação de α-hydroxynitrosamines que decompõem espontaneamente para agentes de alquilação de DNA. Acúmulo de danos ao DNA e mutações resultantes, em última análise, pode levar ao câncer. Novas evidências indicam que α-hydroxynitrosamines pode ser ainda mais oxidado para nitrosamides processively pelo citocromo P450s. Porque nitrosamides são geralmente mais estáveis do que α-hydroxynitrosamines e pode também alquilação de DNA, nitrosamides pode desempenhar um papel na carcinogênese. Neste relatório, descrevemos um protocolo geral para avaliar a produção de nitrosamide em vitro citocromo P450-catalisada do metabolismo de nitrosaminas. Este protocolo utiliza uma abordagem geral para a síntese da nitrosamides relevantes e um em vitro citocromo P450 metabolismo ensaio utilizando espectrometria de massa em tandem de ionização de alta resolução da cromatografia líquida-nanospray para a deteção. Esse método detectado n'- nitrosonorcotinine como um metabólito menor de n- nitrosonornicotine no estudo de exemplo. O método tem alta sensibilidade e deteção de massa seletivamente devida à precisão. Aplicação deste método para uma grande variedade de sistemas de nitrosamina-citocromo P450 ajudará a determinar a generalidade desta transformação. Porque citocromo P450s são polimórficos e variar em atividade, uma melhor compreensão da formação de nitrosamide poderia ajudar na avaliação do risco individual de câncer.

Introdução

N-nitrosaminas são uma grande classe de substâncias cancerígenas encontradas na dieta, produtos do tabaco e o ambiente em geral; Eles também podem ser formados endogenamente no corpo humano¹. Mais de 300 N -nitroso compostos foram testados e > 90% foram avaliados como sendo cancerígenos em animais modelos^2,3. Para expor sua carcinogenicidade, estes compostos primeiro devem ser ativados pelo citocromo P450s^1,2,3. A pesquisa mostra que citocromo P450s oxidar prontamente nitrosam....

Protocolo

1. materiais e procedimentos gerais

1. Synthesize NNN conforme descrito anteriormente ¹⁵. Obter norcotinine, P450 2A6 Baculosomes, sistema de regeneração de NADPH, amortecedor da reação de 0,5 x e todos os outros produtos químicos ou solventes de fontes comerciais em grau reagente.
2. Espectro RMN de registro em um espectrômetro de 500 MHz. Produto químico relatório turnos como partes por milhão (ppm). Usar a picos de solventes residuais como referências internas para ¹ H-NMR (7,26 ppm CDCl ₃) e ¹³ C-NMR (77,2 ppm CDCl ₃).
   Nota: Pico divisão utilizada as seguintes abreviações: s....

Resultados

Baseado no trabalho de branco et al. ¹⁹, norcotinine nitrosados para NNC foi limpa e de alto rendimento (80-92%) para produzir um padrão para o experimento em vitro . Evidências estruturais para uma bem sucedida reação foi obtida a partir de análises espectroscópicas, incluindo ¹H-NMR, ¹³C-NMR, acolhedor e HSQC (informações de apoio), juntamente com o HRMS que confirmou a massa pai [M + H]⁺ dentro de 5 ppm do valor.......

Discussão

Elucidação do metabolismo de nitrosaminas é um componente crítico para a compreensão de sua carcinogenicidade. Desde que os envolvidos citocromo P450s e outras enzimas metabólicas são polimórficas, mais aplicação deste conhecimento potencialmente poderia identificar indivíduos de alto risco^1,4. Novos dados indica que mais oxidação do α-hydroxynitrosamines, os presumíveis principais metabolitos de nitrosaminas envolvidos na ligação de DNA, para nitrosamides é poss.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Norcotinina	AKoS GmbH (Steinen, Alemanha)	CAS 17708-87-1, AKoS AK0S006278969
Ácido acético	Sigma-Aldrich	695092
Anidrido acético	Sigma-Aldrich	242845
Acetato de amônio	Sigma-Aldrich	431311
Hidróxido de bário	Sigma-Aldrich	433373
D-clorofórmio	Sigma-Aldrich	151823
HPLC Acetonitrila	Sigma-Aldrich	34998
Sulfato de magnésio	Sigma-Aldrich	M7506
Cloreto de metileno	Sigma-Aldrich	34856
Nitrito de sódio	Sigma-Aldrich	237213
ViVid CYP2A6 Blue Screening	Kit Life Technologies	PV6140
Sulfato de zinco	Sigma-Aldrich	221376
tubos de 0,5 mL	Fisher	AB0533
Balão de fundo redondo de 100 mL	Sigma-Aldrich	Z510424
Balão Erlenmeyer de 125 mL	Sigma-Aldrich	CLS4980125
Funil Separatório de 125 mL	Sigma-Aldrich	Z261017
25 mL redondo frasco inferior	Sigma-Aldrich	Z278262
500 MHz NMR Espectrômetro	Bruker
Allegra X-22R Centrífuga	Beckman-Coulter
LC vials	ChromTech	CTC– 0957– BOND
LTQ Orbitrap Velos	Thermo Scientific
Barra de agitação magnética	de Z127035		Sigma-Aldrich
	Pipetas Sigma-Aldrich	Z274682
P1000, P200 e P10	Evaporador rotativo Eppendorf
RSLCnano UPLC	Thermo Scientific
Banho de Água Agitador	Fisher	FSSWB15
Placa de agitação	Sigma-Aldrich	CLS6795420
Coluna PicoFrit	Novo objetivo	PF3607515N5
Luna C18, 5 um	Phenomenex	535913-1