Uma plataforma de único-molécula magnética pinças para manipular G-quadruplexes é relatada, o que permite o estudo da estabilidade de G4 e regulamento por várias proteínas.
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Artigo de método
Manipulação de único-molécula de G-quadruplexes por pinça magnética
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Estrutura secundária não-canônicos do ácido nucleico que g-quadruplexes (G4) estão envolvidos em diversos processos celulares, tais como a replicação do DNA, transcrição, processamento de RNA e alongamento do telômero. Durante estes processos, várias proteínas ligam e resolver estruturas G4 para desempenhar a sua função. Como a função do G4 muitas vezes depende da estabilidade de sua estrutura dobrada, é importante investigar como proteínas obrigatórias do G4 regulam a estabilidade do G4. Este trabalho apresenta um método para manipular o único G4 moléculas usando uma pinça magnética, que permite estudos do Regulamento das proteínas de ligação G4 em uma única molécula de G4 em tempo real. Em geral, este método é adequado para uma ampla gama de aplicações em estudos para interações de proteínas/ligantes e regulamentos sobre várias estruturas secundárias DNA ou RNA.
Introdução
Quatro-hélice do DNA ou RNA G4 estruturas desempenham um papel crítico em muitos processos biológicos importantes1. Muitas proteínas envolvidas no G4 vinculação e regulamento, incluindo proteínas obrigatórias do telômero (telomerase, POT1, RPA, TEBPs, TRF2)1,2, fatores de transcrição (nucleolin, PARP1)3, proteínas (hnRNP A1, de processamento de RNA hnRNP A2)4, helicases (BLM, FANCJ, RHAU, AVI, Dna2, Pif1)5e replicação de DNA relacionadas com proteínas (Rif1, REV1, PrimPolymerase)6. Emperramen....
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Protocolo
1. preparação de DNA G4 para único-molécula esticão
- Prepare 5 '-tiol rotulado e 5 '-biotina etiquetado dsDNA alças por PCR usando polimerase DDNA em um modelo de ADN do fago lambda usando 5 '-tiol e 5 '-biotina as primeiras demão 14 ( Figura 1). As duas alças de dsDNA tem alto teor de GC (> 60%) para evitar DNA derretendo quando o DNA é realizada em altas forças ou durante a distensão excessiva DNA transição 15.
- Produtos de PCR purify usando um kit de purificação comercial e digest com enzima de restrição BstXI de acordo com o fabricante ' protocolo de s.
- G4 ....
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Resultados
A montagem da experiência de uma única molécula de G4 de alongamento é mostrada na Figura 4. Uma sequência de formação single-stranded G4 que se expandiu entre duas alças de dsDNA foi amarrada entre uma lamela e um grânulo paramagnético. Para encontrar uma pérola de dsDNA único amarrados, realizou-se um ensaio overstretching, aumentando a força em taxas de carga constante. Três tipos de medidas muitas vezes foram usados para estudar o dobramento e o desdobram.......
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Discussão
Conforme descrito acima, uma plataforma para estudar a estabilidade mecânica do ADN do G4 e as interações da proteína para G4 usando pinças de único-molécula magnética é relatada. Que acompanha a plataforma, são desenvolvidos protocolos altamente eficientes de encontrar DNA G4 baraço e medição da dobradura-revelação dinâmica e estabilidade da estrutura G4 com resolução especial nanômetros. O plano focal de travamento permite controle de anti drift altamente estável, que é importante para a detecção de uma transição de es.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Os autores agradecer Meng Pan para revisão do manuscrito. Este trabalho é apoiado por Singapura Ministério da educação acadêmica pesquisa fundo Tier 3 (MOE2012-T3-1-001) a JY; a Fundação Nacional de pesquisa através da Cingapura Mechanobiology Instituto de JY; Fundação Nacional de pesquisa, escritório, Singapura do primeiro-ministro, sob seu programa de Investigatorship da NRF (NRF Investigatorship Award no. NRF-NRFI2016-03, a JY; o fundo de investigação Fundamental para as universidades Central (2017KFYXJJ153) para H. Y.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Primers de PCR | de DNA IDT | Preparações de DNA | |
| PCR Produtos químicos | de PCR NEB | Enzimas de | |
| restrição BstXI | NEB | R0113S | Preparações de DNA |
| lamínulas (# 1,5, 22 * 32 mm e 20 * 20 mm) | BMH. BIOMEDIA | 72204 | preparação do canal de fluxo |
| Decon90 | Decon Laboratories Preparação limitada | canal de fluxo | |
| APTES | Sigma | 440140-500ML | preparação do canal de fluxo |
| Sulfo-SMCC | ThermoFisher Scientific | 22322 | preparação do canal de fluxo |
| M-280, esferas paramganéticas, estreptavidina | ThermoFisher Scientific | 11205D | Preparação do canal de fluxo |
| Microesferas de Amino Polybead 3.00 μ m | Polysciences, Inc | 17145-5 | preparação do canal de fluxo |
| 2-Mercaptoetanol | Sigma | M6250-250ML | preparação do canal de fluxo |
| Microscópios Olympus IX71 | Olympus | IX71 | Configuração de pinças magnéticas |
| Piezo-Z Stages P-721 | Physik Instrumente | P-721 | Configuração de pinças magnéticas |
| Olympus Lente objetiva MPLAPON-Oil 100X | Olympus | MPLAPON-Oil 100X | Configuração de pinças magnéticas |
| Câmera CCD/CMOS | AVT | Pike F-032B Configuração de | pinças magnéticas |
| Estágio linear de tradução | Physik Instrumente | MoCo DC | Configuração de pinças magnéticas |
| LED | Thorlabs | MCWHL | Configuração de pinças magnéticas |
| Ímãs cúbicos | Supermagnete | Configuração de pinças magnéticas | |
| Labview | National Instruments | Configuração de pinças magnéticas | |
| OriginPro/Matlab | OriginLab/MathWorks | Análise de dados |
Referências
- Rhodes, D., Lipps, H. J. G-quadruplexes and their regulatory roles in biology. Nucleic Acids Res. 43 (18), 8627-8637 (2015).
- Brazda, V., Haronikova, L., Liao, J. C., Fojta, M. DNA and RNA quadruplex-binding proteins. Int J Mol Sci. 15 (10), 17493-17517 (2014).
- Gonzalez, V., Hurley....
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Reimpressões e permissões
