Este manuscrito descreve o zWEDGI (zebrafish Wounding e dispositivo de uma armadilha para o crescimento e a geração de imagens), que é um dispositivo compartimentado, projetado para orientar e restringir as larvas zebrafish. O projeto permite a transecção de cauda e a longo prazo coleção de imagens de alta resolução de microscopia fluorescente de cicatrização e regeneração.
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Artigo de método
A longo prazo dispositivo de imagens ao vivo para melhor manipulação Experimental de larvas de Zebrafish
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A larva de peixe-zebra é um organismo modelo importante para biologia do desenvolvimento e cicatrização de feridas. Além disso, a larva de peixe-zebra é um sistema valioso para ao vivo de alta resolução imagem microscópica dos fenômenos biológicos dinâmicos no espaço e no tempo com resolução de celular. No entanto, o tradicional método de encapsulamento de agarose para geração de imagens ao vivo pode impedir o desenvolvimento larval e regeneração do tecido. Portanto, este manuscrito descreve o zWEDGI (zebrafish Wounding e dispositivo de uma armadilha para o crescimento e a geração de imagens), que foi projetado e fabricado como um dispositivo funcionalmente compartimentado para orientar as larvas para microscopia de alta resolução, permitindo transecção da barbatana caudal dentro do dispositivo e desenvolvimento subsequente de cauda desenfreada e re-crescimento. Este dispositivo permite a imagem a longo prazo, mantendo a viabilidade e ferindo. Dado que o molde de zWEDGI 3D impresso, a personalização de suas geometrias torná-lo facilmente modificado para zebrafish diversos aplicativos de imagem. Além disso, o zWEDGI oferece que inúmeros benefícios, tais como o acesso para a larva durante a experimentação ferindo ou para a aplicação de reagentes, em paralelo a orientação de várias larvas para a imagem latente simplificada e reusabilidade do dispositivo.
Introdução
A capacidade regenerativa de larvas de peixe-zebra Danio rerio tornam um organismo modelo ideal examinar a resposta de ferida, bem como a cura e regeneração do1,2,3,4. Acesso a uma matriz de linhas zebrafish transgênicos e anatômica transparência do zebrafish ainda mais aumentar sua utilidade para estudos em vivo da ferida resposta eventos, bem como de longo prazo processos regenerativos4. O estudo desses processos biológicos usando microscopia de fluorescência de lapso de tempo de alta resolução, po....
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Protocolo
Nota: O projeto de zWEDGI base foi formulado para larvas de zebrafish pós-fertilização de 2 a 4 dias (dpf) e sigam as orientações do centro de recursos da Universidade de Wisconsin-Madison pesquisa animais.
1. design e impressão 3D de moldes
- modelo o PDMS componente do dispositivo com geometrias desejadas e atributos em um 3D modelagem de software 5. Criar um assembly de um molde em branco e a parte PDMS e gerar um molde negativo para a parte PDMS, criando uma cavidade no molde correspondente à parte PDSM. Salve o molde como um arquivo. STL para impressão 3D ( Figura 2, etap....
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Resultados
O dispositivo de microfluidic zWEDGI PDMS é um dispositivo funcionalmente compartimentado projetado para acomodar quatro funções principais (listadas abaixo) associadas com imagens ao vivo da barbatana caudal, ferindo a cura e a rebrota nas larvas de peixe-zebra. PDMS foi escolhido para a fabricação de zWEDGI porque não só é prontamente disponível e um padrão da indústria para biocompatibilidade, mas também funciona bem em moldes. Além disso, PDMS torna o dispositivo reutilizável e vazia .......
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Discussão
A finalidade do dispositivo zWEDGI é capturar o lapso de tempo 3D estabilizando e orientando os peixes dentro a pequena distância de trabalho de um objectivo de microscópio de alta resolução de imagem. Ao mesmo tempo atender a estas especificações de projeto, acabou também uma melhoria tradicional baseada em ágar preparação para geração de imagens ao vivo. Existem três passos críticos (abaixo) na fabricação do zWEDGI, que, se não for feito corretamente, pode resultar em dispositivos com defeito:
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Os autores gostaria de reconhecer o projeto principal financiamento do Instituto Morgridge para pesquisa e o laboratório de óptica e instrumentação computacional. Reconhecemos também que o financiamento do NIH # R01GM102924 (AH e KWE). KH, JMS, RS, AH e KWE concebido e desenvolvido o estudo. KH e JMS executada todas as experiências com o apoio do DL, KP e RS. KH, JS, RS, AH e KWE contribuiram para a escrita do manuscrito.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Fabricar moldes | |||
| Solidworks Professional Accedemic Research Software de modelagem 3D | Dassault Systemes | SPX0117-01 | Fisher Unitech |
| Viper Si2 SLA impressora | 3D Systems Inc. | 23200-902 | 3D Systems Inc. |
| Resina fotopolimérica Accura 60 3D | Systems Inc. | 24075-902 | 3D Systems Inc. |
| álcool desnaturado | Sunnyside | 5613735 | Menards |
| aparelho de pós-cura UV | 3D Systems Inc. | 23363-101-00 | 3D Systems Inc. |
| Luvas de nitrilo TouchNTuff | Ansell | 92-600 | McMaster Carr |
| 220B, 400B, 600 grão T414 lixa azul-bak | Norton | 66261139359, 54, 52 | MSC |
| disco de vidro borossilicato, diâmetro de 2" | McMaster-Carr | MIL-G-47033 | McMaster-Carr |
| Branson | 1510R-MTH | ||
| álcool isopropílico 70% | Hydrox | 54845T43 | McMaster-Carr |
| 10oz | WNA Masterpiece | 557405 | Amazon |
| Vara de artesanato de 6" | Perfect Stix | Craft WTD-500 | Amazon |
| Nome< | strong>Company | Número do Catálogo | Comentários |
| Fabricate zWEDGI PDMS device | |||
| Sylgard 184 silicon elastomeric kit | Dow-Corning | 4019862 | Ellworth Adesivos |
| Seringa de 10mL | Becton Dickinson | 305219 | Vitality Medical Inc |
| dessecador | Bel-Art Scienceware | F42027-0000 | Amazon |
| 4 in grampo de barra de catraca | Pittsburgh | 68974 | Harbor Freight |
| forno de laboratório | Quincy Lab Inc. | 20GC | Global Industrial |
| Aven | 549825 | McMaster-Carr | |
| bico filtrado de ar comprimido | Innotech | TA-N2-2000FT | Cleanroom Supply |
| torno de bancada a vácuo | Wilton Tool Group | 63500 | MSC Industrial |
| Prato de fundo de vidro de 55 mm; vidro de cobertura de micro-poço # 1.5 de 30 mm | Cellvis | D60-30-1.5-N | Cellvis |
| limpador de plasma | Harrick Plasma | PDC-001 | Harrick Plasma |
| Nome | Empresa | Número de Catálogo | Comentários |
| Loading Larvas | |||
| Pipetteman, P200 | Gilson | F123601 | |
| 100% etanol (diluído a 70% com água antes do uso) | de 111000200 | Pharmco-aaper | |
| Fisherbrand | 13-711-5A | Fisher Scientific | |
| desnatado | 2902887 | MP Biomedicals | |
| água | |||
| N-feniltioureia | Sigma-Aldrich | P7629 | Sigma-Aldrich |
| tricaína (etil 3-aminobenzoato) | C-FINQ-UE | Western Chemical | |
| baixo ponto de fusão agarose | Sigma-Aldrich | A0701 | Sigma-Aldrich |
| heat block (incubadora de banho seco) | Fisher Scientific | 11-718-2 | Fisher Scientific |
| E3 buffer | |||
| ponta de pipeta de orifício grande, 200 uL | Fisherbrand | 02-707-134 | |
| pipeta de propósito geral Fisher Scientific, 200 uL | Fisherbrand | 21-197-8E | Fisher Scientific |
| #15 lâmina de bisturi; | Feather | 2976 | Amazon |
| 25G seringa agulha | BD | BD305122 | Fisher Scientific |
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Imaging | |||
| microscópio invertido | |||
| Imaris imaging software | Bitplane |
Referências
- Yoo, S. K., Freisinger, C. M., LeBert, D. C., Huttenlocher, A. Early redox, Src family kinase, and calcium signaling integrate wound responses and tissue regeneration in zebrafish. J. Cell Biology. 199 (2), 225-234 (2012).
- Kawakami, A., Fukazawa, T., Takeda, H.
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Reimpressões e permissões
