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Artigo de método

Baseado em dendrímeros Nanopatterns desigual de adesividade de superfície de controle localmente: um método para direcionar Chondrogenic diferenciação

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DOI:

10.3791/56347

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20 de janeiro de 2018

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1Institute for Bioengineering of Catalonia (IBEC), The Barcelona Institute of Science and Technology (BIST), 2Department of Engineering Electronics, University of Barcelona (UB), 3Networking Biomedical Research Center (CIBER), 4Instituto de Investigacin Biomédica de Málaga (IBIMA), Department of Organic Chemistry, Universidad de Málaga (UMA), 5Andalusian Centre for Nanomedicine and Biotechnology-BIONAND, 6Unidad de Bioingeniería Tisular y Terapia Celular (GBTTC-CHUAC), Grupo de Reumatolog ía, Instituto de Investigación Biomèdica de A Coruña (INIBIC), Complexo Hospitalario Universitario de A Coruña (CHUAC), Sergas, Universidade da Coruña (UDC), 7Institució Catalana de Recerca i Estudis Avançats (ICREA), 8Instituto de Investigación Biomédica de Málaga (IBIMA), Department of Cell Biology, Genetics and Physiology, Universidad de Málaga (UMA)

Neste artigo

Resumo

Um método para obter a nanopatterns baseada em dendrímeros irregulares que permitem o controle de escala nanométrica de local arginina-glicina-aspártico ácido (RGD) densidade de superfície é descrito e aplicado para o estudo da diferenciação celular de adesão e chondrogenic.

Resumo

Diferenciação e adesão celular é condicionado pela disposição dos componentes da matriz extracelular (ECM), escala nanométrica com concentrações locais, tendo um efeito importante. Aqui nós apresentamos um método para obter nanopatterns desigual em grande escala de arginina-glicina-aspartato (RGD)-densidade de superfície funcionalizados dendrímeros que permitem o controle de escala nanométrica de RGD local. Nanopatterns são formados por superfície adsorção de dendrímeros de soluções em diferentes concentrações iniciais e caracterizam-se por água ângulo de contacto (CA), espectroscopia de fotoelétron de raios x (XPS), e digitalização sonda técnicas de microscopia, tais como microscopia de tunelamento (STM) e microscopia de força atômica (AFM). A densidade da superfície local da RGD é medida usando imagens AFM através de mapas de contorno de probabilidade de distâncias mínimas interpartícula e então correlacionados com diferenciação e resposta de adesão celular. O método de nanopatterning apresentado aqui é um procedimento simples que pode ser escalado de uma maneira simples para grandes áreas de superfície. Assim, é totalmente compatível com protocolos de cultura de células e pode ser aplicado a outros ligantes que exercem efeitos de concentração-dependente em células.

Introdução

Aqui descrevemos um procedimento simples e versátil baseado em dendrímeros nanopatterning para obter superfícies de cultura de células que permitem o controle de aderência local à escala nanométrica. Nanoescala detalhes de organização de ECM foram relatados,1,2,3 e o nanopatterning de aderência de célula forneceu insights profundos sobre os celulares requisitos relativos à adesão4, 5. Experimentos utilizando micélica baseada em litografia nanopatterns revelaram um valor limite de cerca de 70 nm para RGD peptídeo nanospacing, adesão celular, sendo significativamente atrasada acima deste valor6,7,8 ,9. Estes estudos também destacou a maior influência do local do que a densidade global do ligante na aderência de célula9,10,11.

Durante a morfogênese, interações célula com o meio ambiente desencadear os eventos de primeira diferenciação, que continuam até estruturas de tecido complexo final tem sido formadas. Neste âmbito, as superfícies de nanopatterned têm sido utilizadas para combater a influência das interações da pilha-superfície iniciais na morfogênese. Baseado em litografia RGD nanopatterns com um espaçamento lateral de 68 nm no tipo β-Ti-40Nb ligas de ajuda para manter o fenótipo indiferenciado de células-tronco não confirmada12, enquanto RGD nanospacings de entre 95 e 150 nm realçar a diferenciação de células-tronco mesenquimais (MSCs) no sentido de adipogenic/osteogênica13,14,15 e chondrogenic destinos16. Também, auto-montagem macromoléculas modificadas com sinalização componentes foram mostradas para direcionar a aderência de célula e diferenciação fornecendo nanoescala Regulamento arquitectónico a sinalização de pistas17. A este respeito, a deposição de dendrímeros com metades de célula-interagindo em sua esfera exterior18,19,20 nas superfícies tem sido usada para estudar a célula adesão21,22, morfologia de23,24e migração eventos25,26. No entanto, a falta de caracterização de superfície nestes estudos torna difícil estabelecer qualquer correlação entre superfície configuração dendrímeros e resposta das células.

Nanopatterns de dendrímeros com líquido, como ordem e espaçamento definido podem ser obtidos quando dendrímeros adsorver às superfícies de baixo-carregado de soluções com baixa força iônica. 27 com base nesta propriedade, aqui apresentamos um método para obter nanopatterns desigual em grande escala de dendrímeros RGD-acrescida em superfícies de baixo-carregado que permitem o controle de escala nanométrica de densidade de superfície RGD local. Ângulo de contato de água (CA), espectroscopia de fotoelétron de raios x (XPS) e sonda microscopia técnicas (nanopatterns STM e AFM) mostrar que densidades locais ligante podem ser ajustadas modificando a concentração inicial de dendrímeros em solução de digitalização. A densidade da superfície local RGD é quantificada de imagens AFM pela probabilidade de mapas de contorno de distâncias mínimas interpartícula e então correlacionada com experimentos de célula. Em comparação com outras técnicas de nanopatterning4, nanopatterning baseados em dendrímeros é simples e pode ser facilmente ampliado para grandes áreas de superfície, sendo assim totalmente compatível com aplicações de cultura de células. Nanopatterns são utilizados como substratos bioativos para avaliar o efeito da densidade de superfície do local RGD na aderência de célula28 e na indução de adulto humano MSCs29chondrogenic. Nossos resultados mostram que o RGD baseada em dendrímeros nanopatterns sustentar o crescimento celular e que adesão celular é reforçada pelas altas densidades de superfície RGD locais. Nas experiências de diferenciação, adesividade intermediária de células para os substratos favoreceu MSC condensação e diferenciação de chondrogenic cedo. Devido à facilidade com que dendrímeros grupos periféricos podem ser modificados, o método descrito aqui pode ser estendido para outros ligantes de ECM que exercem efeitos de concentração-dependente em células ainda mais.

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Protocolo

1. os preparadores

  1. Recozimento de 1.4 x 1.1 cm Au(111) em substratos de Mica.
    1. Coloque o substrato Au(111) sobre uma placa de vitrocerâmica e recoze-lo com uma chama de butano de 3 min. permitir o substrato arrefecer sob uma atmosfera de argônio. Repita esta etapa para cada substrato Au(111).
      Nota: Au(111) substratos devem ser usados imediatamente após recozimento.
  2. Preparação de poli (ácido L-láctico) (pilão)-revestido de substratos de vidro.
    1. Cortar e lavar as lâminas de vidro.
      1. Corte lâminas de microscopia em 18 slides de 1,25 x 1,25 cm com um cortador de ponta de diamante. Fazer um pequeno recorte na parte inferior de cada slide, de modo que os lados superiores e inferiores podem ser distinguidos mais tarde.
      2. Lave os slides com água desionizada, seguida de etanol a 96%. Permita-lhes secar ao ar livre.
    2. Prepare a solução de pilão de 2%.
      1. Adicione 200 mg de pilão para 10 mL de 1,4-dioxano em um tubo de pressão. Adicionar uma barra de agitação e fechar o tubo firmemente.
      2. Coloque o tubo de pressão em um banho de glicerina, um prato quente a 60 ° C, sob agitação suave durante 24 h e em seguida, transferir a solução para um frasco de vidro de 15 mL.
    3. Revestimento de lâminas de vidro com a solução de pilão.
      1. Coloque as lâminas de vidro e o frasco com a solução de pilão sobre uma chapa quente limpa a 60 ° C. Certifique-se de colocar os slides virado para cima e permitir-lhes permanecer pelo menos 10 minutos atingir a temperatura necessária.
      2. Preparar o aplicador girar e definir o programa especificado na tabela 1.
      3. Coloque um dos slides a face para cima sobre o aplicador de rotação, usando um sistema de vácuo. Com uma pipeta Pasteur, aplica 0,25 mL da solução de pilão para o slide, certificando-se de que toda a superfície está coberta. Execute o programa de revestimento. Repita esta etapa para cada slide.

2. dendrímeros Nanopatterning

  1. Preparação de soluções de 28 RGD-acrescida dendrímeros (RGD-Cys-D1).
    1. Dissolva 5 mg dos dendrímeros em 6,494 mL de água desionizada. Esta é a solução A.
      Nota: Use solução dendrímeros dentro de 6 meses de preparação.
    2. Proceda à sonicação solução-A por 10 min e preparar soluções B e C tabela 2a seguir.
    3. Proceda à sonicação solução C por 10 min e preparar soluções, D, E e F tabela 2a seguir.
    4. Loja soluções B, C, D, E e F a 4 ° C até o uso. Solução pode ser armazenada a-20 ° C para uso posterior.
  2. Nanopatterning de dendrímeros RGD-Cys-D1 sobre os substratos
    1. Em uma capa de cultura de tecidos, esterilize os substratos por irradiação-los com a luz UV para 13 min.
      Nota: Este passo só é necessário quando substratos nanopatterned vão ser utilizados como substratos de cultura de células. Neste caso, manter as condições estéreis (capuz de cultura de tecidos, materiais estéreis, soluções e técnicas) para as etapas seguintes.
    2. Coloque cada substrato de face para cima em poços de uma placa, manuseá-los cuidadosamente com uma pinça.
    3. Proceda à sonicação soluções B, C, D, E e F por 10 min.
    4. Passe as RGD-Cys-D1 dendrímeros soluções através de um filtro de 0,22 µm de diâmetro usando uma seringa diretamente nos poços contendo os substratos (2 mL/poço). Pelo menos três réplicas por dendrímeros concentração são recomendadas. Fechar e selar a placa e deixar à temperatura ambiente (RT) para 16 h.
    5. Retire e descarte as soluções. Lave os substratos com água desionizada estéril e seca. Substratos de loja a 4 ° C.
      Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.

3. preparação de substratos de controle

Nota: Todas as medidas foram realizadas em uma capa de cultura de tecidos estéreis e apenas material esterilizado, soluções e técnicas foram utilizadas. Pelo menos, seis controlam substratos foram usadas (três réplicas do controlo positivo) e três réplicas do controle negativo.

  1. Em uma capa de cultura de tecidos, esterilize os substratos por irradiação-los com a luz UV para 13 min.
  2. Substratos de controle para o experimento de adesão dos fibroblastos.
    1. Use chama-recozido Au(111) substratos como controlo negativo. O ouro tem um efeito bem conhecido de desnaturação de proteínas que confere propriedades adesivas anti-celular28. Proceda à sonicação todas as soluções e filtrar antes da incubação do substrato.
    2. Para os controles positivos, mergulhe a flama-recozido substratos de Au(111) em uma solução de PEG modificado RGD tiol, Ac-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Asp-NH-ethylene glicol mono-11-mercaptoundecanamide (RGD-PEG-SH)30 e glicol do triethylene mono-11-mercaptoundecyl éter (PEG-SH) na proporção molar de 1: 100 em etanol a 96% para 16 h na RT
    3. Lave substratos em álcool etílico e secá-las com argônio. Substratos de loja a 4 ° C.
  3. Controle de substratos para a condrogênese.
    1. Use substratos de pilão imaculados como controlo negativo. Sem qualquer tratamento de superfície, pilão mostra interface pobre com células vivas. 31
    2. Para os controles positivos, prepare-se 5 mL de fibronectina 0,1 mg/mL de tampão fosfato salino (PBS) e incube cada substrato pilão com 1,6 mL da solução de fibronectina por 1h no RT
    3. Remover e descartar a solução de fibronectina e lavar os substratos com PBS. Substratos de loja a 4 ° C.

4. superfície caracterização

  1. Imagens de AFM
    1. Realize imagens de AFM de substratos de pilão para uma análise de rugosidade. Desde que os dendrímeros têm um diâmetro de 4-5 nm, valores de rugosidade de 1 nm deve ser obtida para a visualização adequada do nanopatterns. Além disso, realize imagens de AFM do nanopatterns. Em ambos os casos, execute o AFM em batendo modo no ar.
    2. Selecione um cantilever de silício com constante da mola k = 40 N/m e uma frequência ressonante ν = 300 kHz e monte-a no equipamento AFM.
    3. Monte a amostra no palco do microscópio de força atômica. Dependendo da configuração do aparelho, ajuste e especificações de imagem podem variar. Consulte o manual do fabricante.
    4. Abordagem da amostra com a ponta do microscópio até o contato.
    5. Para pilão de imagem para análise de rugosidade, selecione pelo menos quatro áreas representativas de 20 x 20 µm por substrato de três substratos independentes. A imagem nanopatterns de dendrímeros, escolher pelo menos três imagens representativas de 5 × 5 µm por substrato de três substratos independentes por condição (concentração inicial dendrímeros em solução). Para evitar danificar a camada de dendrímeros enquanto imagem, ajuste o ponto de ajuste para manter a força no mínimo.
      Nota: A escolha da área de imagem também depende da escala de trabalho do scanner piezoelétrico. Por favor consulte o manual do instrumento nesse sentido.
    6. Processo a altura AFM imagens por encaixe cada varredura linha de polinômio nivelamento funções utilizando o software proprietário do fabricante do aparelho AFM e analisar os do pilão para calcular a rugosidade da superfície. Raiz da média quadrado (RMS) análise pode fornece uma opção adequada.
  2. Medição de densidade de superfície RGD local.
    1. Obter os limiares da imagem das imagens processadas altura AFM para selecionar os dendrímeros na superfície.
    2. Determinar as posições de partículas usando uma software de processamento de imagem e usá-los para obter as distâncias mínimas interpartícula (d.min).
    3. Lote dmin valores em z para as posições de partícula correspondente para obter os mapas de contorno de probabilidade para dmin. Ajuste a escala de cores da trama para visualizar as regiões de maior local RGD densidade de superfície (dmin < 70 nm).
    4. Quantificar a área das regiões com maior local RGD superfície densidade usando uma software de processamento de imagem. Incluem as áreas de dendrímeros agregados no cálculo.
  3. Imagem de STM.
    Nota: Imagens STM podem ser executada somente para nanopatterns em substratos de Au(111) condutoras. As medições são feitas no ar.
    1. Coloque o substrato nanopatterned no suporte de amostra do equipamento STM. Verifique a conexão elétrica entre a amostra e titular com um testador.
    2. Etch uma dica do material selecionado sonda (i. e. Pt 0,8: IV 0,2) com um diâmetro que assegura o adequado encaixe na cabeça do equipamento STM. Gravura pode ser realizada por corte manual ou pelo ataque eletroquímico. 32
      Nota: Gravura eletroquímica processa mais dicas simétricas.
    3. Monte a ponta na cabeça do equipamento STM e conectar-se a amostra.
    4. Definir "atual" no canal de retorno (neste tipo de medição, atual será constante por gabarito tuning). Ajuste a tensão de polarização e atual ponto de ajuste e tamanho de varredura para obter uma imagem bem resolvida, uma vez que a ponta está envolvida.
      Nota: A escolha da área de imagem também depende da escala de trabalho do scanner piezoelétrico. Por favor consulte o manual do instrumento nesse sentido.
    5. Processo, as imagens topográficas STM encaixando cada linha de varredura de nivelamento polinomial funções utilizando o software proprietário do fabricante do aparelho STM.
  4. Medições de CA.
    1. CA medida sobre os substratos de nanopatterned pelo método de gota séssil em três posições diferentes em três substratos independentes por condição (concentração inicial dendrímeros em solução) com um sistema óptico de CA.
    2. Encher o microseringa com água desionizada e definir os parâmetros do software de CA para produzir gotas de 1 µ l.
    3. Coloque a amostra no palco para que a superfície da amostra é claramente visível no computador para a imagem latente.
    4. Mover a seringa com o micromanipulador até chegar perto da superfície e dispense a cair sobre a superfície. Grave a imagem imediatamente após a estabilização da gota.
      Nota: Nas medições de CA, é muito importante controlar a umidade a fim de obter resultados reprodutíveis.
    5. Analise o CAs medido com o software proprietário do fabricante do aparelho de CA. O método de encaixe pode ser ajustado às exigências do usuário. O método de montagem elíptica pode ser uma opção.

5. cultura celular

Nota: Todas as medidas foram realizadas em uma capa de cultura de tecidos e apenas o material esterilizado, soluções e técnicas foram utilizadas.

  1. Experimento de adesão dos fibroblastos.
    1. Cultura de fibroblastos embrionários de NIH 3T3 rato de passagens precoce (< 10) a 37 ° C e atmosfera de 4,6% CO2 em meio basal com glicose alta, suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 1% L-glutamina, piruvato de sódio penicilina-estreptomicina e 1% 1% (meio de crescimento). T75 frascos para uma propagação total de 500.000 células por balão em 10 mL do meio de crescimento são recomendados.
    2. Remover antigo médio com uma pipeta de 10 mL a cada 2 dias e substitua com 10 mL de meio de cultura preparados na hora.
    3. Células de cultura no meio de crescimento, até que chegam em torno de 80% de confluência, em seguida, remover o meio e adicionar 5 mL de tripsina por balão. Para garantir o desprendimento de célula apropriada do fundo do frasco, manter a solução de tripsina em contacto com as células por 5 min a 37 ° C.
    4. Adicionar 5 mL de meio de cultura por frasco e coletar as células num tubo de centrífuga. Centrifugar as células a 470 x g durante 5 min. Retire o sobrenadante e ressuspender as células em 10 mL do meio de crescimento. Determine a concentração de células usando um hemocytometer.
    5. Transferi os substratos para bem placas não tratadas para cultura de tecidos (não aderente).
    6. As células sobre os substratos em uma densidade de 4.000 células/cm2 no meio de crescimento de sementes e incube-os por 4,5 horas a 37 ° C e 10% CO2 atmosfera.
  2. Chondrogenic indução do MSCs.
    1. Cultura humanas MSCs de passagens antecipadas (< 5) a 37 ° C e 4,6% CO2 atmosfera meio de crescimento de MSC. T75 frascos para uma propagação total de 500.000 células por balão em 10 mL do meio de crescimento são recomendados.
    2. Alterar médio cada 3 dias (conforme descrito em 5.1.2).
    3. Trypsinize células antes de confluência de 80% é atingido e centrifugue e ressuspendê-los no meio de crescimento de MSC (conforme descrito em 5.1.3). Determine a concentração de células usando um hemocytometer.
    4. Centrifugar as células novamente e Resuspenda-los em 10 mL de meio de indução condrogênese.
    5. Transferi os substratos das placas para novas placas bem não tratadas para cultura de tecidos (não aderente). As sementes das células sobre os substratos em uma densidade de 3.000 células/cm2.
    6. Altere o meio de chondrogenic cada 3 dias (conforme descrito em 5.1.2).

6. fixação e imunocoloração de celular

Nota: As seguintes etapas podem ser executadas em condições não estéreis.

  1. Remova a mídia e lavar as células suavemente com PBS. Corrigi-los, adicionando uma solução de formalina 10% por 20 min no RT
  2. Remover o formol e lavar as células com PBS.
  3. Bloquear os grupos aldeído livre pela adição de uma solução de 50 mM de cloreto de amónio (NH4Cl) em PBS. Deixar as células por 20 min em solução de NH4Cl de RT. Remova e lave as células com PBS.
    Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. Armazenar as amostras em PBS a 4 ° C.
  4. Remover PBS e permeabilize as células, adicionando uma solução de 0,1% de saponina na solução de bloqueio (1% em PBS de albumina) por 10 min no RT. Wash as células com PBS e transferir amostras para um prato bem novo.
  5. Incubar as células com uma solução de anticorpos primários na solução de bloqueio (tabela 3) por 1h no RT Em seguida, remover a solução de anticorpo primário e lavar as células com PBS.
  6. Incubar as células com anticorpos secundários na solução de bloqueio (tabela 3) por 1h no RT
    Nota: Evite luz exposição.
  7. Remover a solução de anticorpo secundário e lavar as células com PBS e seco.
    Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. Armazene as amostras em PBS a 4 ° C, no escuro.
  8. Montagem da amostra para a observação do microscópio: usando um cortador de ponta de diamante, corte as lamelas em 1,25 cm x 1,25 cm. aplicar 50 µ l de montagem média para as amostras de microscopia e cobri-los suavemente com as lamelas de corte.
  9. Transferir as amostras para um destinatário conveniente, cubra com papel alumínio e guarde no escuro a 4 ° C até observação.

7. célula de imagem e análise de dados

Nota: Para Au(111) opaco e espessos substratos microslide-baseado, um microscópio vertical deve ser utilizado.

  1. Experimento de adesão dos fibroblastos.
    1. Uso de um microscópio de epifluorescência equipado com uma câmera digital e ampliação de alta (ou seja, 40 X) e baixa (ou seja, 10 X) objectivos. Fazer medições no ar.
    2. Coloca a amostra sobre o palco e a imagem do núcleo de células com o objectivo de X 10 usando uma excitação ultravioleta, filtro de emissão longpass para visualizar a mancha Hoechst/DAPI.
    3. Imagem célula citoesqueleto e aderências focais (FAs) com o objetivo de X 40, selecionando o filtro de microscópio que corresponda às especificações de fluorocromo anticorpo correspondente.
    4. Para a quantificação de FA, use uma software de processamento de imagem para converter imagens em arquivos de 8 bits. Remova as imagens de fundo e converter para binário, definindo um limite. Calcular pelo menos 30 imagens por exemplo e considerar FAs de 1 µm2 para cálculo.
  2. Chondrogenic indução do MSCs.
    1. Condensados de célula de imagem nas fases iniciais de indução chondrogenic (< 5 dias), com um microscópio de epifluorescência vertical equipado com uma câmera digital e um baixo (ou seja, 10 X) objetivo de ampliação. Use o filtro ultravioleta de excitação e longpass de emissão para visualizar a mancha Hoechst/DAPI.
    2. Para medir a área de condensado, use um software de processamento de imagem, converter imagens em arquivos de 8 bits, remover o fundo e selecione um limiar que destaca o contorno de agregação. Calcule a área das partículas.
    3. Amostras de imagem immunostained para FAs, fibras de actina do citoesqueleto e cartilagem-específicas do colágeno tipo II alfa 1 (COL2A1) com um microscópio confocal vertical em alta ampliação (ou seja, 40-60 X). Recolha as seções em um intervalo representante (ou seja, 0,5-1 µm).
    4. Para processar a pilha, use uma software de processamento de imagem. Converter imagens em arquivos de 8 bits, remover o fundo e torná-los binário, definindo um limite. Trate um mínimo de três condensados de célula por condição de três amostras independentes.
    5. Quantificar a proteína FA manchada de áreas da zona basal de condensados de célula e expressá-las como a porcentagem correspondente da área dividida pelo número de núcleos de célula na imagem.
    6. Para medir COL2A1 coloração, usar z-projeções confocal e quantificar a soma da área projetada (área máxima de COL2A1 por amostra). Normalize o valor de área obtido contra a área do condensado correspondente.

8. quantitativa análise de reação em cadeia (qRT-PCR) transcrição-polimerase reversa

Nota: Para evitar a contaminação de RNase, use utensílios de plástico descartável, estéril e luvas descartáveis quando manusear reagentes e RNA. Sempre usar técnicas assépticas microbiológicas adequadas e usar uma solução de descontaminação adequada para remover a contaminação de RNase de superfícies de trabalho e itens não-descartáveis, tais como pipetas e centrífugas.

  1. Isolar o RNA total e pulverizá-lo em um disruptor de RNA. Tratar as amostras de RNA com DNase e convertê-los em cDNA usando um kit de síntese do cDNA.
  2. Conduta qRT-PCR utilizando primers para o fator de transcrição SOX9. Beta-2-microglobulina (B2M) e proteínas ribossomais L13a (RPL13a) pode ser usado como genes das tarefas domésticas.
  3. Calcular os níveis de expressão e normalizá-los contra o controlo negativo (pilão).

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Resultados

Apresentamos um método nanopatterning que permite aderência superficial ser endereçado à escala nanométrica (Figura 1). A estrutura química da RGD-Cys-D1 é mostrada na figura 1A. Dendrímeros foram estampados em superfícies condutoras elétricas do Au(111) para caracterização do STM de alta resolução. Dendrímeros baixas concentrações em solução (até 10-5% w/w) processado dendrímeros isolados de 4-5 nm de diâmetr...

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Discussão

Durante o desenvolvimento do protocolo descrito, deve ser considerado um número de passos críticos. O primeiro refere-se a caracterização de nanopattern com sonda técnicas de microscopia de varredura. Para visualizar o nanopatterns, a superfície onde a padronização é produzida deve ter um valor de rugosidade abaixo o diâmetro médio dos dendrímeros, que é em torno de 4-5 nm, medida pelo STM (figura 1B). Além disso, ele deve ter em conta que imagens de alta resolução STM é restrita aos substratos condutora...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Os autores reconhecem Oriol Font-Bach e Albert G. Castaño por sua ajuda na quantificação demin d. Eles também reconhecem a unidade de microscopia Digital avançado no Instituto de pesquisa em biomedicina (IRB Barcelona) para deixar os autores a gravar o vídeo em suas instalações. Este trabalho foi apoiado pelo Networking biomédica Research Center (CIBER), Espanha. CIBER é que uma iniciativa financiada pelo VI nacional R & D & i plano 2008-2011, Iniciativa Ingenio 2010, consolidar programa, CIBER acções e Instituto de Salud Carlos III, com o apoio do Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional. Este trabalho tem sido apoiado pela Comissão para universidades e investigação do departamento de inovação, universidades e Enterprise da Generalitat de Catalunya (2014 SGR 1442). Ele também foi financiado pelos projetos OLIGOCODES (n. º MAT2012-38573-C02) e CTQ2013-41339-P, concedido pelo Ministério espanhol de economia e competitividade, além de INTERREG do v Espanha-Portugal 2014-2020 POCTEP (0245_IBEROS_1_E). C.R.P. reconhece o apoio financeiro de subvenção Ministério da economia e competitividade espanhol (n. º IFI15/00151).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Ouro (111) sobre mica. 1.4x1.1 cm Spi Supplies466PS-AB
Micro lâminas de vidro, simplesCorning2947-75x25
Água deionizadaMillipore18MΩ cm
Etanol 96%PanReac131085.1212
Copolímero L-Lactide/DL-LactideCorbion95/05 razão molar
1,4 - dioxanoSigma-Aldrich296309-1L
Óleo de silicone, alta temperaturaAcros Organics174665000
SpinnerLaurellWS-650MZ-23NPP/Lite
Capuz de fluxo laminar para cultura de tecidosTelstarBio II AdvanceClass II unidade de filtro de cabine de segurança biológica
Millex-GPSLGP033RB0.22 µ m
Seringa 10 mLDiscardit309110
Microscópio de Força AtômicaVeeco InstrumentsDimension 3000 AFM instrumento
Silício AFM sondasSensores de orçamentoTap300AI-GRessonante Freq. 300 kHz, k = 40 N / m
Microscópio de tunelamento de varreduraMicroscópio Molecular ImagingPicoSPM Pt0.8
: Ir0.2 fioAdventPT671012Diâmetro 0,25 mm
WSxM 4.0 softwareNanotec electronica
Sistema de ângulo de contato óptico (CA)Dataphysics
SCA20 softwareDataphysics
Espectrômetro de fotoelétrons de raios XPhysical ElectronicsPerkin-Elmer PHI 5500 Sistema
Fibronectina de plasma bovinoSigma-AldrichF1141-1MGSolução de 1,0 mL
Tampão fosfato salino de Dulbecco (DPBS)Gibco21600-10Pó
Fibroblastos de embrião de camundongoATCCATCC CRL-1658NIH / 3T3
Meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM) líquido alto glicoseGibco11960044líquido alto glicose, sem glutamina, 500 mL
Soro fetal bovino (FBS)Gibco16000044500 mL
de L-GlutaminaInvitrogen25030200 mM (100X)
Penicilina-estreptomicinaInvitrogen15140
Piruvato de sódioInvitrogen11360039100 mL
Frascos de cultura T75Nunclon156499
TrypsinLife Technologies252000720,25% EDTA
CentrífugaHermle LabortechnikZ 206 A
Placa tratada com cultura de tecidos, 12 poçosFalcon351143Não aderente
hMSCs derivados do tecido adiposoATCCATCC PCS-500-011Frasco celular 1 mL
MSC meio basalATCC ATCCPCS-500-030
Kit de crescimento MSCATCC ATCCPCS-500-040Soro baixo
Ferramenta de diferenciação de condrócitosATCCATCC PCS-500-051
Solução de formalinaSigma-AldrichHT5011-15MLtamponado neutro, cloreto
amônioSigma-AldrichA9434-500Gpara biologia molecular, adequado para cultura de células, ≥ 99,5%
SaponinaSigma-Aldrich47036-50G-Fpara biologia molecular, usado como surfactante não iônico, adjuvante
Albumina de soro bovino (BSA)Sigma-AldrichA3059-50G
Anticorpo monoclonal de coelho [Y113] anti-paxilinaAbcamab32084Diluído 1:200
Cadeia monoclonal de camundongo [1F5] anti-colágeno alfa-1 XX Anticorpos AcrisAM00212PU-NDiluídos: 1:400
Alexa Fluor 488-conjugado cabra anti-camundongo IgG (H + L) anticorpo secundárioInvitrogenA106672 mg / mL. Anticorpo
secundário anti-coelho IgG (H+L) de cabra conjugado com Alexa Fluor 568InvitrogenA110362 mg/mL. Diluído 1:1000
Hoechst 33342Thermo FisherH3570 10ML10 mg/mL. Diluído 1:1000
Vidro de cobertura 24x24 mmDeltalabD102424
FluoromountSigma-AldrichF4680-25ML
Microscópio de epifluorescênciaNikonEclipse E1000 microscópio verticalcom uma câmera CCD
Microscópio confocalLeica MicrosystemsLeica SPE Microscópio confocal vertical
ImageJ 1.50g freeware
software MATLABA MATHWORKS, Inc.
Software OriginPro 8.5Coordenação
Multitécnicade 10% diluído 1:1000 http://imgej.nih.gov/ij OriginLab

Referências

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