Protocolo abrangente de amostra e da medula óssea do processo de medição de doença Residual mensurável e células leucêmicas em leucemia mieloide aguda

Summary

Detecção de doença residual mínima ou mensurável (MRD) é um biomarcador prognóstico importante para avaliação do risco de refinação e predizer a recaída em leucemia mieloide aguda (LMA). Estas orientações abrangentes e recomendações com as melhores práticas para consistente e exata identificação e detecção de MRD, pode ajudar na tomada de decisões de tratamento eficazes AML.

Abstract

Critérios de resposta na leucemia mieloide aguda (LMA) foi recentemente re-estabelecido, com exame morfológico utilizado para determinar se os pacientes atingiram remissão completa (CR). Aproximadamente metade dos pacientes adultos que entraram CR será uma recaída dentro de 12 meses devido a consequência de células residuais de LMA na medula óssea. A quantificação destes restantes células de leucemia, conhecidas como doença residual mínima ou mensurável (MRD), pode ser um biomarcador robusto para a previsão dessas recaídas. Além disso, uma análise retrospectiva de vários estudos demonstrou que a presença de MRD na medula óssea de pacientes LMA correlaciona-se com a sobrevivência do pobre. Não só é o total da população leucêmicas, refletida pelas células abrigar uma leucemia associada imune-fenótipo (LAIP), associado com resultados clínicos, mas assim é a subpopulação de imaturos de baixa frequência de leucemia células-tronco (LSC), ambos dos quais podem ser monitorado através de citometria de fluxo MRD ou MRD-como abordagens. A disponibilidade dos ensaios sensíveis que permitem a detecção de células de leucemia residual (haste) com base nas características de doenças específicas ou doença associada (marcadores moleculares anormais ou aberrante immunophenotypes) tem avaliação de MRD drasticamente melhorada na LMA. No entanto, dada a heterogeneidade inerente e a complexidade da LMA como uma doença, métodos para a recolha de medula óssea e realizando análise MRD e LSC devem harmonizar quando possível. Neste manuscrito, descrevemos uma metodologia detalhada de aspirado de medula de óssea adequada amostragem, transporte, processamento para avaliação de citometria de fluxo de multi cor ideal e retenção de estratégias para avaliar MRD e LSC para auxiliar na tomada de decisão terapêutica da amostra para pacientes com LMA.

Introduction

Leucemia mieloide aguda (LMA) é que um tumor maligno da medula óssea caracterizadas por defeitos no programa de maturação, com proliferação anormal e acúmulo de células progenitoras mieloides, inibição da hematopoiese normal e, finalmente, falha da medula óssea . A doença é altamente heterogênea no que diz respeito a morfologia, imunofenótipo, citogenética, moleculares aberrações e assinaturas de expressão do gene, bem como a resposta do tratamento e tratamento resultado^1,2. Gestão atual inclui quimioterapia de indução com o objectivo de atingir a remissão completa (CR), seguida por pós-remissão tratamento, que é guiado em grande parte pelos resultados de molecular, citogenética e imunofenotípica estudos e consiste tanto vários cursos de quimioterapia adicional ou transplante de células-tronco (autólogo ou alogênico)³. Apesar das taxas de remissão alta após quimioterapia intensiva de até 90%, sobrevida de 5 anos em adultos é somente aproximadamente 30% a 40%, principalmente devido ao desenvolvimento de recaídas que são geralmente resistente à quimioterapia e, assim, muito difícil de tratar. Resultado nas crianças é melhor, embora aproximadamente um terço também uma recaída. Portanto, a deteção adiantada de recaída iminente irá preencher uma necessidade médica não atendida e guie remissão após terapia⁴.

Doença residual após terapia pode refletir a soma de todos os diagnóstico e fatores/mecanismos de resistência pós-diagnóstico; Portanto, sua medição pode ser instrumental para orientar o tratamento e prognóstico. A possibilidade de defining doença residual (anteriormente chamada de doença residual mínima e agora referida como mensurável de doença residual ou MRD) muito abaixo do critério morfológico de 5% de blastos está mudando a paisagem de risco classification. Atualmente, os dois métodos utilizados principalmente para detectar MRD estão fluxo cytometry-molecular baseada e, este último sendo avaliada pela transcriptase reversa PCR (RT-qPCR)⁵ ou, embora numa fase prematura, pela próxima geração (NGS) de sequenciamento. Muitos estudos em adultos, bem como em crianças já demonstraram que várias abordagens MRD fornecem informação prognóstica forte na LMA, tanto após a indução e consolidação terapia^6,7e uma nova definição de doença fardo ( superior ao CR morfológica) está a emergir⁸. Isto sugere que MRD avaliados pelo fluxo e/ou técnicas moleculares devem tornar-se e na verdade são já se tornando, padrão em cada ensaio clínico na LMA.

Este manuscrito descreve o procedimento de citometria de fluxo detalhado para obter uma caracterização imunofenotípica precisos e reprodutíveis de MRD em amostras de medula óssea, incluindo a recolha de amostras de medula óssea e procedimentos anteriores de citometria de fluxo de processamento. A disponibilidade das amostras de medula óssea de boa qualidade no diagnóstico e acompanhamento é crucial para o sucesso desta medida em locais clínicos e ensaios clínicos. Na verdade, estas considerações pré-analíticas são também de abordagens MRD de vital importância para molecular (PCR e NGS). Para caracterização imunofenotípica de MRD, aberrantly expressas marcadores são combinados com normal mieloide e marcadores do progenitor, para identificar um imunofenótipo associada a leucemia (LAIP)⁹. MRD mede a resultante de muitos fatores que influenciam a resposta à terapia, tais como resistência a drogas leucemia intrínseca ou adquirida, farmacodinâmica e cinética da terapia, vigilância imunológica e conformidade. Portanto, MRD é um parâmetro prognóstico muito forte de pós-diagnóstico associado com resultados clínicos quando dicotomizado em um nível de limite determinado pela análise característica operacional receptor (ROC). Para nosso adulto coorte de LMA da 42a HOVON estudo, o nível de limiar é fixado em 0,1% de LAIP células positivas/total de leucócitos. Usando este critério para determinar o status de MRD positivos vs negativos, um grupo de pacientes pode ser identificado que têm uma incidência de recaída significativamente pior, sobrevivência livre de recaída e total⁶. Além disso, descrevemos a medição das células de leucemia imaturos, resistentes aos medicamentos com características de células estaminais (células-tronco CD34 + CD38-leucemia, ou LSC), que oferece um forte preditor de resultado paciente¹⁰. Juntos LAIP e LSC aproxima-se forma a abordagem MRD fluxo cytometric. A abordagem LAIP é apropriada para cerca de 90% dos pacientes, enquanto que a abordagem do LSC pode ser aplicada em cerca de 80% dos pacientes. Junto sobre 95% dos pacientes podem ser avaliados para um parâmetro, ou ambos.

Por último, esta publicação fornece uma descrição detalhada e operacional para avaliar MRD por citometria de fluxo. Isto inclui: 1) harmonização e/ou padronização de procedimentos de recolha de amostras de medula óssea, orientação de transporte 2) amostra 3) descrição detalhada da detecção de células leucêmicas com FACS usando vários painéis de anticorpos, incluindo abordagens de tubo de célula única para caracterizar a LSC, 4) set-up dos FACS máquinas para medições padronizadas, 5) programas analíticos para medições de MRD e 6) programas analíticos para a deteção da LSC.

Nosso objetivo é mostrar todas as facetas do processo, incluindo a preparação da amostra, uma vez que raramente é discutido enquanto é uma questão importante para a qualidade do resultado final. Biópsia e aspiração de medula óssea são procedimentos clínicos usados para avaliar as células hematopoiéticas dentro da medula óssea. Estas são realizadas em conjunto com um hemograma completo (CBC) e o esfregaço de sangue. O método ideal para aspiração de medula óssea é crucial para o diagnóstico preciso e o acompanhamento para medição de MRD. Além disso, um aspirado de medula de óssea bem sucedida deve conter células suficientes para executar a análise de fluxo LAIP e LSC (pelo menos 10 milhões células viáveis). Aqui, descrevemos o método para a realização de uma aspiração de medula óssea e fornecer orientações, que devem resultar em adequado célula amostragem (e limite o potencial de hemodiluição) necessários para diagnósticos precisos e pesquisa adicional. Estas considerações pré-analíticas são também de abordagens MRD de vital importância para molecular (PCR e NGS). Todos os espécimes para immunophenotyping devem ser processados, preferencialmente dentro de 24 h de coleção. Embora não recomendável, amostras de sangue periférico e medula óssea ainda podem ser processadas e analisadas quando mantidos até 72 h à temperatura ambiente. Além disso, todos os manejos com o material devem ser realizados sob condições estéreis, a fim de permitir a criopreservação de células estéreis para posterior avaliação de pesquisa/qualidade etc.

Protocol

O protocolo segue as diretrizes do código de pesquisa e o Comitê de ética de pesquisa da VU University Medical Center.

1. medula óssea aspiração e amostra preparação

1. Preparação do paciente e material
   1. Preencha uma ou duas seringas de 10 mL com lidocaína a 1% usando uma agulha de calibre 16. Substitua a agulha por uma agulha de calibre 21.
   2. Coloque duas gotas de EDTA 5% em um vidro de relógio.
   3. Instituído em lâminas de vidro (n = 15 com numeração paciente consistente e data) para a preparação do esfregaço.
   4. Colocar o paciente em posição de decúbito lateral. Localize a espinha ilíaca posterior superior e marque com caneta.
      Nota: em geral, a espinha ilíaca superior posterior está localizada uma mão largura distal para a crista ilíaca e a lateral de largura de uma mão à sua mediana. Nas fêmeas, a coluna vertebral real pode ser um pouco mais lateral, em alguns homens um pouco mais medial.
   5. Desinfectar a pele com clorexidina 0,5-1% em etanol a partir da área de biopsia pretendido para o exterior em círculos.
   6. Abra o pacote de luvas esterilizadas, colocar as luvas estéreis e deitar o pacote sobre a mesa para criar um campo estéril. Abra o pacote com a agulha de aspiração e coloque-a sobre o campo estéril.
   7. Infiltre a pele e tecido subcutâneo e, finalmente, periósteo. No periósteo, administre a lidocaína de tal forma que uma área de 1 cm de diâmetro tem sido anestesiada.
      Nota: A administração adequada de lidocaína para o periósteo é um dos fatores mais importantes para o conforto do paciente. Testar se o periósteo tem sido devidamente anestesiado tocando o local de biopsia pretendido com a agulha introduzida e perguntar se o paciente sente dor. Nota: as crianças são totalmente anestesiadas durante todo o processo.
   8. Segure a agulha de aspiração (15 Ga x 2,8") com a extremidade proximal na palma e dedo indicador contra o lado do eixo do metal a agulha perto da ponta; Esta posição permite melhor controle.
   9. Introduzir a agulha com um movimento rotativo (alternando rapidamente movimento pronating/supinação) através da pele em direção a espinha ilíaca e trazer a agulha em contacto com a espinha ilíaca posterior.
   10. Certifique-se que é de agulha é introduzida à área anestesiada do periósteo; o paciente deve sentir apenas pressão e sem dor. Se o paciente sente dor, reposicionar a agulha ou administrar lidocaína mais.
   11. Usando uma pressão suave mas firme, fazer avança a agulha enquanto girando-a alternadamente contador no sentido horário no sentido horário. Entrada na cavidade de medula geralmente é detectada por diminuição da resistência.
   12. Retire o estilete da agulha. Anexe uma seringa de 10 mL vazia para a agulha.
   13. Aplique pressão negativa ao retirar o êmbolo da seringa com uma tração suave. Avise o paciente que pode sentir uma sensação de cólicas e dor quando a medula está sendo aspirada. Se não é suficiente espículas de medula óssea são liberadas, outra aspiração deve ser realizada com um empate rápido. A maioria das espículas será no primeiro 1-2 mL obtido a atração inicial. Aspire somente 1-2 mL para evitar a diluição da amostra.
       Nota: Diluição resultará na hemodiluição e podem confundir MRD resultados).
   14. Remova a seringa e substituir o estilete para a agulha de aspiração. Ejete a parte da medula em um vidro de relógio e o resto em um tubo de 8 mL revestido com heparina.
       Nota: Inverta cada tubo imediatamente após a colocação do aspirado de medula para o tubo de amostra para garantir a anticoagulação adequada. Coagulação de medula óssea é frequentemente a causa de material impróprio. Adicionais da medula óssea pode ser aspirada do mesmo lugar, mas de preferência, a agulha é avançada 5-10 milímetros antes da tomada de um aspirado de novo. De preferência não mais de 2 sorteios por nível de inserção devem ser tomados. Certifique-se de marcar os tubos com aumento do número que representa o primeiro, segundo e/ou consecutivos empates. É a regra comum de usar o primeiro sorteio para a análise de diagnóstica mais relevante.
   15. Alternativamente, retirar a agulha do local de inserção e reintroduzi-lo na cavidade de medula alguns milímetros longe do lugar de inserção original e repita o procedimento.
       Nota: Não aspire a mais de 1-2 mL por tração, para evitar a contaminação de sangue significativo.
   16. Repita sempre que material é necessário. Quando o material suficiente para o protocolo do estudo clínico específico é aspirado, retire a agulha de medula óssea.
       Nota: No caso de aspirações da medula óssea lenta ou caso contrário difícil a utilização de seringas que foram previamente corada com anticoagulante pode ser útil. No caso de um toque seco, realize uma biópsia trefina que está fora do escopo deste manuscrito.
2. Preparação de esfregaços para análise morfológica
   1. Para melhor avaliação morfológica, escolher espículas (por exemplo, usando uma espátula de plástico) do aspirado no vidro de relógio e coloque-os em uma lâmina de vidro.
   2. Delicadamente, coloque outra lâmina de vidro sobre o slide com a medula e deslize suavemente; Evite qualquer pressão.
      Nota: Somente em caso de grande medula óssea espículas ligeira pode exercer pressão, para diminuir a espessura da difusão celular. Os benefícios do procedimento de ajuda de um assistente que pode lidar com os tubos de amostra. Rotulagem exacta dos tubos com o paciente número e número do sorteio sequencial da medula óssea é crucial.
   3. Seque o slide e então executar Grünwald de Giemsa pode manchar (ver tabela de materiais). Examinar ao microscópio de luz para morfologia (ver Figura 1).
      Nota: A figura 1A mostra as manchas de saudáveis da medula óssea, consistindo de tipos diferentes de célula funcional enquanto figura 1B um paciente de LMA com explosões predominantemente leucêmicas. Para melhor definir a carga residual leucêmicas, immunophenotyping precisa ser executada.

2. o transporte de materiais para posterior processamento

1. Preparação das amostras para transporte
   1. A fim de certificar-se que o material não irá vazar, e os tubos não quebrará, certifique-se de embalagem correta (ver Figura 2).
      Nota: De nossa e outras experiências a viabilidade das células é melhor preservada quando a medula óssea é mantida à temperatura ambiente. Para o transporte a longo prazo isso melhor é conseguido usando uma temperatura 'bloco do gel' para ajudar na estabilidade de temperatura durante o transporte.
   2. Rótulo de pacotes e adicionar as formas corretas para evitar a perda do pacote, transporte prolongado ou comutação dos pacientes.
      Nota: Isto deve conter, no mínimo: dados do paciente (formulário 1). Isto deve incluir o número do estudo e comumente a 'data de nascimento'. Essencial para o processamento de certo do material após a chegada no laboratório receptora, é uma afirmação clara das especificamente análises laboratoriais solicitados (diagnóstico molecular, immunophenotyping, MRD etc) neste formulário. (Formulário 2) Endereço e número de telefone da pessoa a contactar, e quando necessário, os documentos para a alfândega. Para evitar a perda de pacotes pelo correio, o envio de laboratório sempre notifica o laboratório de recebimento foi enviada uma amostra. Recomenda-se o uso de "rastrear- e".
2. Receber amostras de outros institutos
   1. Certifique-se que a logística apropriada está em vigor no Instituto para receber a amostra ao laboratório assim que é entregue no Instituto.
      Nota: Para organização logística ideal de preferência um laboratório central é necessária, que recebe e coleta todo o material da clínica local e externo hospitais. Em particular, atribuir os protocolos para a distribuição e a comunicação clara com os laboratórios executivos é essencial.
   2. Depois de receber as amostras, com precisão, observe a numeração apropriada em formas de cópia e um banco de dados protegido, contendo campos importantes tais como o número de ID de MRD, número de identificação específico de julgamento, número de registro do Hospital, Instituto de envio, data de nascimento, material tipo (medula óssea ou sangue periférico), contagem de glóbulos brancos (WBC), data de aspiração de medula óssea, data da medição da amostra e quaisquer observações relevantes para a qualidade da medição.
      Nota: De preferência, esse banco de dados também é equipado para conter dados adicionais (ou estar ligado a outros bancos de dados) dos resultados de análise e mais dados do paciente como follow-up de dados.

3. instalação de citômetro de fluxo

Nota: Esta seção baseia-se na Euroflow instruções. ¹¹

1. Inicia-se a tensões fotomultiplicador (PMT) para parâmetros de FCS SSC e canais de fluorescência de alvo
   1. Parâmetros para o FCS SSC iniciar o citômetro de fluxo e executar o "citômetro de configuração e monitoramento (CST)" executar no citômetro de fluxo com grânulos de CST (ver tabela de materiais). Lise células vermelhas do sangue de um doador saudável (descrito na seção 4.1).
      1. Criar uma nova experiência (no menu: experiência, experiência nova, selecione o ensaio em branco) utilizando o software do fabricante (ver tabela de materiais) com uma dispersão para a frente (FSC) contra lateralmente (SSC) ponto de dispersão para configurar os parâmetros FSC e SSC. O nome desta experiência FSC/SCC PMT, com a data. Primeiro, use as configurações atuais de citômetro (clique direito: "aplicar CST atual"). Essas configurações foram geradas com a verificação de desempenho de CST usando grânulos CST-calibração (ver tabela de materiais). Ajuste o FSC e SSC para visualizar os linfócitos em "configurações do experimento global". Nota: em nosso citômetro de fluxo são 285 V e 400 V respectivamente. Riscar a compensação de"habilitar": configurações do Inspector/instrumento/compensação.
      2. Para avaliar o tamanho das células (FSC) e granularidade (SSC) iniciar a medição sem rótulo lysed células de sangue periféricas pela função "adquirir as células". Portão a linfócitos e ajustar/fine-sintonias FSC e SSC tensões para atingir os seguintes valores-alvo significa para a população de linfócitos fechado: FSC: 100.000 (gama 95.000-105.000); SSC: 15.000 (escala de 13.000-17.000).
      3. Adquirir e registrar dados medindo pelo menos 10.000 eventos. Verifique se a média FSC e SSC valores para linfócitos gated-alvo e reajuste se necessário.
   2. Para configurar a fluorescência alvo canais voltagens PGTO usam partículas de calibração de grânulos 8-pico do arco-íris (ver tabela de materiais).
      1. Crie uma nova experiência sobre o FACS para 7-picos. Criar uma planilha "Destino cruel fluorescente intensidade (IFM)" com todos os lotes do ponto necessário (n = 2; FSC contra SSC, FITC contra PE), histogramas (n = 8; um histograma para cada detector de fluorescência) e dados estatísticos que demonstram a referência a valores de pico (IFM e coeficiente de variação (CV)) para cada canal de fluorescência.
      2. Prepare-se recentemente uma solução contendo 1 gota (± 60 µ l) de grânulos de arco-íris em 1 mL de dH₂O. suavemente vórtice para misturar as gotas em solução.
      3. Use as configurações de PGTO a tensões FSC/SSC de cima e começar a medir a fluorescência dos grânulos do arco-íris usando a função de "adquirir" (sem gravação) em "Baixa" taxa de fluxo com um limite de 5.000. Use o botão"portão retangular" para portão a população de grânulos de singlete P1 no FSC contra trama do ponto do SSC. Portão 7^th pico - população P2 no FITC contra trama do ponto do PE.
      4. Continue a aquisição das 7-picos do arco-íris do grânulo suspensão e ajustar/fine-sintonias PGTO tensões em todos os canais de fluorescência para alcançar os valores de acordo com os canais de destino anotados IFM IFM destino em conformidade com os grânulos.
      5. Usar o "Record" para coletar dados de cerca de 10.000 eventos e verifique o IFM para as 7^th grânulos de pico. Se necessário, corrigi as tensões de pgto. Uma vez valores alvo IFM para o pico de^th 7 são alcançados, registro/sobrescrever o arquivo para os valores finais de pgto.
      6. Salvar os valores finais de PGTO e nomeie o arquivo de instalação de PGTO com a data, que será salvar no catálogo de software do fabricante. Use esta configuração de PGTO para corrigir o vazamento sobre cada tintura de fluorescência.
2. Configurações de compensação de fluorescência
   1. Rotular um tubo para o controle imaculado e cada anticorpo conjugado fluorocromo (ver tabela S1 para os fluorochromes usados). Pipete 100 µ l de buffer para cada tubo.
   2. Vórtice do frasco de grânulos de compensação multicolor (ver tabela de materiais) completamente e em seguida, adicione 1 gota cheia (± 60 µ l) destes grânulos para cada tubo.
      Nota: Evite pingar os grânulos ao lado do tubo ao adicioná-los a cada tubo. Isto pode levar a uma concentração baixa do grânulo e poderia impactar os resultados da matriz de compensação.
   3. Pipetar o volume apropriado calculado para um teste de anticorpos conjugados a fluorocromo suficiente (o que seria suficiente para manchar 10⁶ células) no tubo correspondente e vórtice completamente. Não adicione anticorpo ao tubo controle imaculado. Incube durante 15 a 30 min no escuro à temperatura ambiente (RT).
   4. Adicionar 4 mL de tampão de lavagem (tampão fosfato salino (PBS)/0.05% azide-0.1% albumina de soro humano (HSA) (ver tabela de materiais)) para cada tubo. Centrifuga os tubos a 300g por 10 min. Retire o sobrenadante e ressuspender o grânulo pela adição de 0,2 mL de tampão de lavagem a cada tubo. Vórtice os tubos completamente.
   5. Abra o software de análise do fabricante (ver tabela de materiais) e criar uma nova experiência (no menu: experiência, experiência nova, selecione o ensaio em branco) e renomeie como arquivo de compensação com a data atual.
   6. Vá para "configurações de citômetro" e usar a configuração de PGTO da seção 3.1. Certifique-se de que o limiar de FSC é 5.000 e os valores de compensação de todos os fluorochromes usados são zero.
   7. Crie controles de compensação, incluindo tubos de rótulo específico, conforme necessário. Não se esqueça de incluir um controle imaculado. Selecione no menu: experimento, configuração de compensação, criar controles de compensação.
   8. Carregar o tubo controle imaculado e ajustar o portal P1 em torno da população de grânulo de singlete e certifique-se de que o portal P1 contém apenas contas de singlet.
   9. O portão de P1 com o botão direito e selecione "Aplicar para todos os controles da compensação". Dados do registro para todos os tubos de fluorescência rotulado único. Verifique se que o P2 portão engloba a população positiva em cada histograma de fluorescência. Se for necessário ajustar o portão.
   10. Calcule a compensação. Selecione experimento, configuração de compensação, calcular a compensação.
   11. Se o cálculo da compensação não for bem-sucedida, exibe uma mensagem de erro. Faça os ajustes necessários e recalcular. Quando o cálculo da compensação é bem-sucedida, uma caixa de diálogo aparece arquivos de prompt para o nome para a configuração de compensação.
   12. Digite um nome (por exemplo instalação de cor de 8 aa-MM-DD) e clique, link e salvar. A configuração de compensação também será salvo ao catálogo da instalação de compensação.
       Nota: As mesmas configurações podem ser usadas para todos os experimentos usando a mesma fluorophores.

4. fluxo Cytometry avaliação (LAIP e LSC)

Nota: Aqui descrevemos o processo de Lise em massa antes de coloração, que permite uma concentração preferencial de WBC de manchar. A maioria dos protocolos MRD usam essa abordagem, embora alguns usaram com sucesso outras opções como coloração antes de Lise. Toda medula óssea coloração antes lise minimiza a perda de célula preferencial¹², mas tem a desvantagem de concentrações de célula imprevisível, muito baixo.

1. Lise em massa de células
   Nota: Manter as amostras unmanipulated horizontal no RT, quando a aquisição de cytrometric de fluxo não pode ser executada no mesmo dia, a fim de iniciar todo o procedimento no dia seguinte.
   1. Resuspenda da amostra de medula óssea anticoagulados a homogeneidade da amostra várias vezes por inversão. Determinar a concentração de células da medula óssea (contagem de glóbulos brancos (WBC)) usando uma célula de contagem câmara com célula coloração Tuerk solução (veja a tabela de materiais).
   2. Pipetar o volume necessário de medula óssea em um tubo de 15ml separado. A quantidade de células é dependente do número de tubos de coloração distintos; para uma coloração (um tubo) use aproximadamente 2 x 10⁶ células brancas do sangue para as medições LAIP e 8 x 10⁶ células brancas do sangue para a medição do tubo da LSC.
   3. Lyse pilhas de sangue vermelhas, adicionando solução de lise (ver tabela de materiais). Volume necessário de solução de Lise deve ser 10 vezes o volume da suspensão celular.
   4. Misture delicadamente, por inversão e incubar durante 10 minutos a RT Centrifugar durante 7 min 800g em RT. descartar o sobrenadante (por exemplo, com uma bomba de vácuo ou pipeta Pasteur). Ressuspender as células em tampão fosfato salino (PBS)/0.05% azide-0.1% albumina de soro humano (HSA) (ver tabela de materiais) para uso de RT. o volume máximo do tubo.
   5. Centrífuga para 7 min 800g em RT. descartar o sobrenadante (por exemplo, com uma bomba de vácuo ou pipeta Pasteur). Ressuspender o sedimento celular em PBS/0.05% azide-0.1% HSA para uma concentração de célula de 100 x 10⁶ WBC/mL e divida sobre o número de tubos pretendidos.
2. Coloração de células por citometria de fluxo
   1. Pipeta anticorpo monoclonal (MoAb) solução cocktail mistura para os tubos de classificador (FACS) célula apropriada de fluorescência-ativado e incubar com as células de medula lisados por 15 min no escuro.
      Nota: Isto é muito importante quando são utilizados em tandem-corantes. Por exemplo, ver as misturas dos painéis canonicamente utilizados em nosso laboratório (tabela S1).
   2. Lavar as células com 3ml PBS/0.05% azide-0.1% tem. Centrifugar as células durante 5 min à 400g. Descarte o sobrenadante (por exemplo, com uma bomba de vácuo ou pipeta Pasteur) e o Ressuspender o pellet de células em 300 µ l PBS/0.05% azide-0.1%HSA.
   3. Para medição de LSC: Ressuspender as células em 400 µ l PBS/0.05% azide-0.1% HSA e adicione 4 µ l de grânulos em branco (por exemplo, Spherotech, consulte a tabela de materiais) para usar como população controlo negativo na análise.
   4. Abra MRD ou LSC experimento lay-out sobre o FACS (ver tabela de materiais) e medida para MRD pelo menos 100.000 WBC gated eventos para medição de amostras de pacientes LMA no diagnóstico e 1 X 10⁶ WBC para amostras de LMA no seguimento. Para a LSC experimentos medem pelo menos 4 x 10⁶ WBC tanto no diagnóstico e acompanhamento para um resultado confiável do LSC.
   5. Salve os dados usando um nome de arquivo apropriado padronizada para a análise dos resultados. Fazer um inventário dos diferentes marcadores medidos sobre as células da LMA e sobre as células-tronco AML (positivo, negativo, sobre/sob a expressão) e armazenar esses dados no jornal laboratório.
   6. Caso não haja nenhum diagnóstico LAIP disponível, medir todos os 4 tubos em acompanhamento para garantir que qualquer possível LAIP mensurável pode ser identificado através de uma abordagem diferente da normal.
   7. Escolha o mais confiável LAIP(s)¹³ estabelecida no momento do diagnóstico e adquirir tantos eventos quanto possível, mas > números mínimos definidos.

5. identificação de imuno-fenótipos associados leucemia (LAIP): análises de populações de células diferentes

Nota: Arquivos FCS podem ser analisados com vários programa de software para visualização ideal das populações de célula diferente (ver tabela de materiais).

1. População de células brancas do sangue
   1. Portão as CD45 de células positivas e as células viáveis aparecendo, deixando de fora o baixo FSC (células não-viáveis, eritroide células) dentro da parcela FSC/CCD; Estes contêm o WBC (Figura 3Aeu). Mostrar o WBC e usar um dos marcadores primitivos (por exemplo CD34; Figura 3Aii) para ajudar a determinar a posição final de explosões na área de CD45dim (Figura 3Aiii).
   2. As células CD45dim da porta e portão volta as células na trama do FSC/SSC (Figura 3Beu). Remova o portão CD34 (Figura 3Bii) ao relatar as células % este portão como % de blastos na sua árvore de população no programa. Mostre as explosões em um SSC/CD34 plotagem e portão de células CD34 positivas (Figure3Biii).
2. Linfócitos
   1. Use os linfócitos como um controle interno: mieloides populações como populações linfoides como um controle positivo e um controle negativo.
   2. Iniciar a partir da população de células brancas do sangue (Figura 4A). Linfócitos de portão como CD45^alta/SSC^baixa população (Figura 4B).
   3. Certifique-se que existem sem pilhas myeloid na porta usando o CD34, CD117, CD13 ou CD33 e portão para as células negativas de negativo/CD33 CD13 (Figura 4C-E). Chame essa população 'linfócitos' na árvore de população (Figura 4F).
3. LAIP no momento do diagnóstico
   1. Portão a explosões e posteriormente as células CD34 positivas um SSC/CD34 plotagem e chamam esses marcador' primitivo' na árvore de população.
   2. Plotar as células primitivas, neste caso CD34 positivo e os linfócitos em um novo enredo com um marcador linfoide (CD7) contra um marcador mieloide (CD33). Portão a população aberrante (ver orientações complementares 1 arquivo) e chamá-los 'LAIP positivo' na árvore de população.
      Nota: O final escolhido LAIP é relatado como % LAIP sobre a população de explosão. A sensibilidade, especificidade e estabilidade dos LAIPs podem ser estabelecidas apenas por pessoal com ampla experiência em medições de MRD. O total desses parâmetros determina a qualidade do Roberto. Exemplos de quatro diferentes avaliações de LAIP no diagnóstico são dadas na Figura 5 A-D.
   3. Determinar a expressão de LAIPs (% de blastos) e preservar esses dados em um banco de dados ou arquivo excel.
   4. Fazer relatórios das análises FACS e as notas de LAIPs que devem ser utilizados em medições de MRD.
      Nota: A definição de LAIPs é autorizada em uma equipe de especialistas desde que é uma característica essencial para medições precisas de MRD no siga.
4. MRD no acompanhamento
   1. Portão a explosões, conforme descrito em 5.1, mas dependendo do ponto de tempo após a terapia; correta avaliação deste portão pode ser um desafio. Focar o fenótipo LAIP foi estabelecida no momento do diagnóstico e portão a população imatura.
   2. Conforme descrito em 5.1. encontrar a porta correta explosão baseia o aberrancy definido e estar ciente de regenerar a medula óssea e expressões normais para eles para fora da porta
   3. Repita a mesma estratégia de retenção de acompanhamento em todos os pontos e determinar MRD como a percentagem de células LAIP na população de células brancas do sangue inteiro. Consulte exemplos figura 6A e 6B.
   4. Relatório de positividade MRD quando a % de MRD é ≥ 0,1% de células brancas do sangue. Imprima dados analisados em um formato padrão para discutir semanalmente com a equipe MRD. Registre os resultados depois de consenso. Deixe os resultados a ser autorizado pelo supervisor antes de comunicar os resultados para os clínicos.

6. análise de tronco célula MRD (LSC tubo único)¹⁴

1. Análises da LSC no diagnóstico e acompanhamento
   1. Portão os blastos, conforme descrito na seção 5.1.
   2. Como controle negativo potencial do CD38-, portão eritrócitos-fração (ou seja, restantes células vermelhas do sangue após a Lise, caracterizado como SSC^baixa/FSC^baixa e CD45^negativo). Se necessário, as células mortas e fragmentos de células podem ser excluídos por um portão extra nesta trama.
   3. Determine dentro do portão de explosão leucêmicas a subpopulação com expressão de CD34. Selecione dentro desta população o CD34⁺ CD38 células^– (usar como Cut-off: borda superior dos grânulos calibração em branco para determinação do limiar (ver tabela de materiais), o vermelho-fração ou uso 10³ como ponto de corte). Chamar essa população 'CD38 progenitores^baixo' (Figura 7).
      Nota: Ver arquivo complementar 1 para mais detalhes sobre a configuração dos níveis de CD38-corte-off.
   4. Determinar dentro desta população^baixa CD38 populacional células-tronco^{muito baixa} o verdadeiro CD34 + CD38, usando a mediana da fração vermelha, a borda inferior dos grânulos calibração em branco ou escolher 10² como ponto de corte (Figura 7 ). Ver arquivo complementar 1 para mais detalhes sobre como definir os níveis de CD38-corte-off.
   5. Dentro de ambas as populações, portão as células leucêmicas vs as células-tronco hematopoiéticas normais (LSC versus HSC) analisando cada marcador leucêmicas fornecido no painel (ou seja, CD45RA, combi-6 (CLEC12A, TIM-3, CD7, CD11b, CD22 e CD56 tudo em PE), CD123, CD33 e CD44).
   6. Marcador de células-tronco de interesse contra outro marcador de células-tronco para comparar com a negatividade/positividade de outros marcadores da positividade/negatividade e ajustar LSC versus frequência HSC de plotagem.
   7. Apresente-se a porcentagem de blastos imaturos, linfócitos, células CD34 +. Para marcadores todos separados, liste os números totais de CD38^baixa e CD38^verylow e os números de^baixo CD38 e CD38^verylow que são marcador positivo (e, portanto, neoplásica).
   8. Selecione para o marcador que melhor distingue as células-tronco hematopoiéticas normais vs células leucêmicas para uma análise mais aprofundada. Calcule a percentagem de LSC e HSC como porcentagem do total WBC.
      Nota: Uma percentagem do LSC de ≥ 0,004% é relatada como LSC positiva no momento do diagnóstico, enquanto o limite é de 0,0001% no seguimento. Células-tronco aberrantes gating em amostras de acompanhamento é semelhante a análise como no momento do diagnóstico, no entanto, números de telemóvel nas populações de células-tronco podem ser muito pequenos. Daí a necessidade de adquirir suficiente eventos.

Results

Em 90% dos pacientes LMA LAIP pelo menos um pode ser identificado. A fim de gerar as percentagens precisas de células LAIP + das células primitivas explosão no momento do diagnóstico, a configuração apropriada do portão de explosão é crucial e precisa de verificação como visualizado na Figura 3. Um exemplo de cada paciente, abrigando um tipo específico de aberrancy sobre as células CD34 + primitivas é visualizado na Figura 5. Para medição de MRD no follow-up, as anteriormente definido LAIP + células são bloqueadas e definidas como a percentagem de células LAIP + do WBC. Portanto, a configuração deste portão é crucial para alcançar os resultados MRD a razão. A Figura 6 mostra um paciente que recaídas depois de ter resultados positivos MRD (≥ 0,1%) e um paciente que permanece em remissão completa após o segundo ciclo da terapia de indução.

O protocolo atual só é adequado para definir as células-tronco em células CD34 +, desde a caracterização completa deste compartimento tem mostrado que o CD38-população abriga as células-tronco mais potentes como fração. A fim de separar o CSS dentro dessa fração da LSC, marcadores adicionais são usados. Marcadores mais frequentemente selecionadas para distinguir LSC são CD45RA e o canal de combi abrigando 6 marcadores específicos do LSC rotulados com PE. Com base em novas avaliações clínicas, um nível de corte de ≥ 0,004% foi definido como LSC-positivo e foi associado com pior sobrevivência no momento do diagnóstico, enquanto um nível de corte de 0,0001% foi usado no seguindo-acima de¹⁰.

Figura 1 : Esfregaço de medula óssea. A) saudável doador e paciente B) AML (subtipo FAB 5). Mancha de Giemsa mostrada na ampliação de 100x. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 : Corrigir o material de embalagem de fluidos biológicos. Mais detalhes sobre as regras e regulamentos do transporte de fluidos biológicos podem ser encontradas no site¹⁵ de centros de controle e prevenção de doenças. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 : Estratégia para a definição de blastos de gating. A) Gating CD45dim, B) Gating CD34 + explosões.

Figura 4 : Gating linfócitos. A) células azul WBC mostrado na trama do FSC/SSC, células B) verde são linfócitos caracterizados por CD45^alta/SSC^baixa, C) são exemplos de negatividade para CD34, D) negatividade para CD117 e negatividade E) para CD13, F) os diferentes tipos de células são mostrados em uma árvore de população de visão geral. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5 : LAIPs no momento do diagnóstico da LMA. A) LAIP baseado em cruz linhagem aberrancy (CD7 expressando células CD33), B) LAIP baseado na diferenciação assíncrona (CD11b na células expressando CD13), C) LAIP baseado em superexpressão em comparação com células normais (CD34^{muito alta} na CD13 expressando células), D). LAIP baseado no underexpression em comparação com células normais (HLA-DR^baixa CD33 expressando células). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6 : LAIP seguido durante a terapia. Definição de LAIP A) no momento do diagnóstico (CD34 + / CD13 + / CD33-) e perda de LAIP durante o seguimento em um paciente que permaneceram em remissão completa contínua, definição de LAIP B) no momento do diagnóstico (CD117 + / CD7 + / CD33 +) e persistência de LAIP durante o seguimento em um paciente que teve uma recaída. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7 : Retenção de células-tronco. Um) Gating das diferentes CD34 + CD38 populações com base em grânulos (CD38^baixa está abaixo da margem superior dos grânulos, enquanto CD38^{muito baixo} são definidos como as verdadeiras células negativas representando a LSC e situam-se abaixo da mediana dos grânulos), B) dois exemplos de pacientes com distinção entre HSC e LSC no acompanhamento baseada CD45RA^neg e CD45RA^pos expressão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Amplos dados estão disponíveis, que apresentam evidências de positividade MRD, sendo associada com a sobrevivência do pobre, e, portanto, avaliação MRD pode melhorar o resultado do paciente, fornecendo informações adicionais de prognósticos sobre as quais decisões clínicas podem ser feitas. Portanto, um método consistente e harmonizado para avaliação imuno-fenotípica de MRD é essencial para, finalmente, melhorar o tratamento do paciente. Isto também é importante ao comparar estudos clínicos através de centros clínicos diferentes, e pode, finalmente, ajuda na clínica a decisão fazendo e servindo como um ponto de extremidade clínico substituto para sobrevivência global. A noção de que orientações sólidas são garantidas para medições de MRD precisas e consistentes tem levado a uma acção concertada de rede europeia de leucemia (ELN), de diretrizes de design do estado da arte. Este documento abrangente será publicado atrasado-2017 e será fundamental para muitos grupos de estudo e laboratórios a avançar.

Passos críticos dentro do protocolo

Um aspecto importante e muitas vezes esquecido da análise MRD é o impacto da qualidade da amostra na determinação precisa da MRD. Isto é mais evidente quando o material tem que ser transportado para outros institutos em testes clínicos globais, tendo em conta as considerações operacionais adicionais que precisam ser tomadas em consideração neste cenário. Para reduzir o risco de mistura-se paciente informações e entrega oportuna da administração adequada de amostras é crucial. Novamente, nesta fase do transporte as formas corretas e/ou importação em sistemas eletrônicos de hospital com atribuições claras das análises solicitadas é necessária. Observar o estágio em terapia da amostragem MRD é também crucial, uma vez que pode ser relevante para a decisão clínica (por exemplo após o segundo curso de terapia) e, portanto, deve ser definido claramente. O uso de dados fictícios (como por exemplo 1 de janeiro por ano de nascimento) aumenta o risco de mistura-se análises ou pacientes. Se exigido por lei, uma forma alternativa de anónimos de identificação deve ser usada.

Todos os espécimes para immunophenotyping devem ser processados, preferencialmente dentro de 24 h de coleção. Embora não recomendável, amostras de sangue periférico e medula óssea ainda podem ser processadas e analisadas quando mantidos até 72 h à temperatura ambiente. Além disso, a todos os manejos com o material melhor podem ser realizados em condições estéreis, portanto mais criopreservação de células em biobancos (locais) continua a ser relevante: muitos estudos clínicos têm análises adicionais para investigar mais células de leucemia com respeito às características moleculares, imuno-fenotípica e funcionais para ser executada em um estágio posterior. No entanto, detalhes de biobanking não são no âmbito deste manuscrito.

Usando MRD como uma ferramenta de diagnóstico implica que ele precisa de um laboratório acreditado, não só por citometria de fluxo, mas também em matéria de controlo de qualidade da avaliação de MRD. Isso pode exigir a distribuição de amostras aos laboratórios de referência específica ou (re) analisando arquivos de fluxo com as medições de MRD por equipes de referência.

Este artigo descreve as ações mais importantes da coleção de aspirado de medula óssea para determinação de MRD em amostras clínicas - exigindo uma equipe inteira de especialistas com tarefas específicas, responsabilidades e com a comunicação frequente para efetiva caracterização e análise. Uma vez que cada tarefa é crucial para o procedimento, é recomendável ter som logística incluindo protocolos em cada laboratório e pessoal suficiente de backup que foram treinado especificamente para a tarefa. Além disso, uma vez que existem algumas etapas relativamente subjetivas em parte dos procedimentos (especialmente LAIP e LSC identificação de marcador aberrante), é essencial ter discussões sobre o resultado final pela equipe, e ter o relatório final autorizado por uma equipe de supervisores. Os esforços atuais buscam o desenvolvimento de software de computador que vai ajudar a uniformizar a análise MRD (LAIP e LSC).

Modificação e resolução de problemas

Cada laboratório pode ter seu próprio conjunto de anticorpos que podem ser usados para definir as diferentes subpopulações, apesar de ter uma espinha dorsal padronizada dos marcadores é essencial para resultados comparáveis, conforme descrito nas diretrizes de estado da arte da ELN para documento de medições de MRD acima referido. Independentemente dos marcadores de escolhido, há algumas questões que podem dificultar a análise dos resultados e precisa ser levado em consideração.

Limitações da técnica

A identificação da expressão de marcador aberrante LAIP e LSC primeiro é avaliada no momento do diagnóstico e monitorizada ao longo do tempo (durante e após a terapia) para a caracterização exata do fenótipo MRD. Enquanto mais 95% dos pacientes podem ser avaliadas através de LAIP LSC (ou ambos), ainda alguns pacientes tem não LAIPs definidos ou nenhum CD34 + CD38-LSCs apresentam com explosões de CD34 negativos ou tem uma amostra de diagnóstico a falta. Nesses casos, é ainda vale a pena tentar e medir MRD com um painel de anticorpos tão amplas como o número de células disponíveis permite e, em seguida, selecione o mais confiável (dando a mais forte distinção das células leucêmicas) LAIP. Considerando que uma proporção de pacientes que, finalmente, ter uma recaída não completamente se assemelham o imunofenótipo de diagnóstico, devido à heterogeneidade da doença AML, medir um amplo painel de anticorpos no MRD recomenda-se de qualquer maneira. Estes turnos imunofenotípica incluem blastos e LSCs e foram mostrados para ocorrer durante a terapia¹⁶ e a doença mensurável pode basear-se nestas populações próximas so-called. Neste momento, no entanto, não foi determinado se todos imunofenotípica sub-populações conduzirá a recaída da doença, e, portanto, prática não comum para relatar MRD adaptados-terapia baseia-se nessas células em ensaios clínicos. É importante observar que o risco de perder a LSC devido a deslocamentos de população é reduzido com a aproximação de um tubo em que os marcadores mais importantes de definição aberrancy estão em um fluxo cytometry (PE) canal¹⁴.

Importância no que diz respeito a métodos existentes

O método descrito neste protocolo baseia-se na definição de um ou mais LAIPs, que as células são seguidas durante a terapia. Uma desvantagem deste método é que recentemente mostrou que Roberto pode mudar durante a terapia. Desta forma, que algumas populações próximas com diferentes marcadores aberrantes podem ser perdidas. Para contornar isso, seria melhor medir todos os marcadores aberrantes em vez de apenas aquelas encontradas no momento do diagnóstico. Isto então seria semelhante à abordagem "diferente do normal" é usado por vários laboratórios¹⁷.

Aplicações futuras

Recentemente, MRD tem recebido atenção extra para projeto novo de julgamento clínico. Na era das opções de tratamento especializado e terapia com drogas específicas, o uso de MRD como uma medida de resultado irá reduzir o tempo necessário para estabelecer a eficácia clínica de novos tratamentos, em última análise, permitindo a introdução mais rápida de urgentemente necessária terapêutica opções para a clínica. O significado de logística adequada e execução prática de uma avaliação de MRD harmonizada são cruciais para o sucesso futuro do tratamento LMA como o FDA está atualmente investigando a viabilidade do uso de MRD como um ponto de extremidade do substituto em vez de sobrevivência global mede¹⁸.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
	BD Biosciences	120995496,060996589 e 013729	FACS Canto II
	BD Biosciences	555360	CD7 FITC
	DAKO	F076701	CD2 FITC
	Sanquin	M1613	CD36 FITC
	BD Biosciences	332778	CD15 FITC
	BD Biosciences	335039	CD45RA FITC
	BD Biosciences	345810	CD56 PE
	BD Biosciences	337899	CD22 PE
	BD Biosciences	345785	CD14 PE
	Miltenyi Biotec	130-080-801	CD133 PE
	BD Biosciences	562566	Clec12a PE
	BD Biosciences	565568	Tim-3 PE
	BD Biosciences	332774	CD7 PE
	BD Biosciences	333142	CD11b PE
	BD Biosciences	337899	CD22 PE
	BD Biosciences	345810	CD56 PE
	BD Biosciences	347222	CD34 PERCP-CY5.5
	BD Biosciences	558714	CD123 PERCP-CY5.5
	Beckman Coulter	B49221	CD117 PE-CY7
	BD Biosciences	562854	CD33 BV421
	BD Biosciences	345791	CD19 APC
	BD Biosciences	333143	CD11b APC
	BD Biosciences	345800	CD33 APC
	BD Biosciences	345807	CD38 APC
	BD Biosciences	641411	HLA-DR APC-H7
	BD Biosciences	560532	CD44 APC-H7
	BD Biosciences	562596	CD13 BV421
	BD Biosciences	348811	CD34 PE-CY7
	Beckman Coulter	A96416	CD45 Krome Orange
	BD Biosciences	655873	CD45 HV500c
	BD Biosciences	655051	contas CST
	BD Biosciences	555899	solução
	BD Biosciences	644204	Multicolor CompBeads
	BD Biosciences	655051	contas
	BD Biosciences		FACSDiva software
	Cytognos		Infinicyt
	Spherotech	Euroflow RCP-30-5a
	Sigma-Aldrich		Tuerk solução
	Spherotech	BCP-100-5	Partículas de Calibração em Branco Beads
			HSA
			Azida
			ddH2O