Bedömning av blod - hjärnbarriären permeabilitet av intravenös Infusion av FITC-märkt Albumin i en musmodell av neurodegenerativa sjukdomar
Summary
I denna studie presenterar vi ett enkelt och effektivt förfarande för att utvärdera störningar av den blood – brain barriären under neurodegenerativa sjukdomar. För att uppnå vårt mål, vi infunderas hög molekylvikt fluorescein isotiocyanat märkt (FITC)-albumin in mus jugular ven och utvärderas dess läckage in i hjärnparenkymet av fluorescensmikroskopi.
Abstract
Störningar i blod – hjärnbarriären (BBB) integritet är en gemensam funktion för olika neurologiska och neurodegenerativa sjukdomar. Även om samspelet mellan perturbed BBB homeostas och patogenesen av hjärnsjukdomar behöver ytterligare utredning, kan utveckling och validering av ett tillförlitligt förfarande för att upptäcka BBB förändringar vara avgörande och representerar ett användbart verktyg för att kunna förutsäga sjukdom riktade progression och utveckla behandlingsstrategier.
Här presenterar vi ett enkelt och effektivt förfarande för att utvärdera BBB läckage i neurodegenerativa tillstånd som inträffar i en preklinisk musmodell av Huntingtons sjukdom, där brister i permeabiliteten i BBB är klart påvisbara precociously i sjukdomen. Specifikt, den höga molekylvikt fluorescein isotiocyanat märkt (FITC)-albumin, som kunna passera BBB endast när den senare är nedsatt, är akut infunderas in i en mus halsvenen och dess fördelning i stadsdelarna vaskulär eller parenkymal bestäms sedan av fluorescensmikroskopi.
Ansamling av grön fluorescerande-albumin i hjärnparenkymet fungerar som ett index av avvikande BBB permeabilitet och, när quantitated med hjälp av bild J bearbetning programvara, redovisas som Green fluorescensintensiteten.
Introduction
Homeostas inom det centrala nervsystemet (CNS) är en förutsättning för korrekt kommunikation och funktion av neuronala celler. CNS parenkymet är tätt tillsluten från periferin av den endothelial blodhjärnbarriären (BBB), som utgör gränssnittet mellan perifera blodomloppet och hjärnan och spelar en nyckelroll i överhörning mellan dessa två distrikt1 ,2. BBB är en komplex och dynamisk tredimensionell struktur huvudsakligen består av specialiserade mikro-fartyget endotelceller (ECs) kopplade till varandra genom intercellulära Junktional komplex – åtsittande föreningspunkter (TJs) – och omgiven av pericyter, neuron ändelser och Astrocyten foten processer1,2.
Under fysiologiska betingelser, extremt låg permeabilitet av intakt BBB säkerställer strikt reglering av transport av näringsämnen och andra molekyler in och ut ur hjärnan, och ger ett unikt skydd mot förändringar i CNS den sammansättningen av blod som kan påverka neural aktivitet och mot potentiella perifera förolämpningar1,2,3.
Störningar av BBB integritet och dess förbättrade permeabilitet har länge varit känt att utgöra en viktig funktion för många neurologiska och neurodegenerativa sjukdomar4 inklusive Huntingtons sjukdom (HD)5,6, men , om sådan en dysfunktion är ett orsakande fenomen eller en propagative händelse i sjukdomsförloppet är fortfarande oklart. Tidpunkten för BHB-nedbrytning förblir också svårfångade, men nya bevis av vår grupp och andra indikerar att störd BBB integritet inte utgör ett slutet evenemang i sjukdomsförloppet, men snarare ett tidigt steg6,7 , 8, som kan få långsiktiga konsekvenser.
Med detta i åtanke är det viktigt att avslöja precociously BHB-nedbrytning i neurodegeneration för att utveckla strategier som är användbart för att förutsäga sjukdomsprogress och hjärnskador och att utveckla alternativa och mer målinriktade insatser kan framgångsrikt lindra kliniska konsekvenserna av sådana avbrott. Pålitlig avbildning av BBB njurfunktion är därför av stor betydelse i både experimentell forskning och klinisk behandling av sjukdomar i hjärnan.
I den här artikeln beskriver vi en framgångsrik och enkel procedur för utvärdering av BBB permeabilitet i en musmodell för HD med hjälp av den höga molekylvikten fluorescein isotiocyanat märkt-albumin (FITC-albumin). Extravasering av FITC-albumin, som normalt inte kan passera barriären, in i hjärnparenkymet mättes som ett index av BBB läckage. Denna teknik är lätt anpassningsbar till råttor och andra sjukdomstillstånd som kännetecknas av cerebrovasculature nedskrivningar9,10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den teknik som vi beskriver här är främst användbart för att upptäcka BBB läckage under hjärnan sjukdomstillstånd. BBB dysfunktion är att få uppmärksamhet som gemensamt för olika neurologiska problem4. Vi har tidigare använt denna metod för att beskriva den tidiga störning av BBB integritet i en musmodell av en sällsynt neurodegenerativ sjukdom som HD6.
Denna metod tar fördel av den relativa enkelheten och effektiviteten i förf…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av ”Fondazione Neuromed” och finansieras av det italienska hälsoministeriet ”Ricerca Corrente” till V.M.
Materials
| Albumin-fluorescin isothiocyanate conjiugate | SIGMA | A9771-100MG | |
| pAb anti-Laminin | Novus Biologicals | NB300-144 | |
| CY3 anti-rabbit made in goat | MILLIPORE | AP132 | |
| SUPERFROST PLUS | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Cover Slips 24 X 50 mm | Thermo Scientific (DIAPATH) | 61050 | |
| Kilik Optimal Cutting Temperature (OCT) compound | Bio Optica | 05-9801 | |
| VECTASHIELD Mounting Media | VECTOR | H-1500 | Mounting media with DAPI |
| iNSu/Light Insulin Disposible Syringe | RAYS Health &Safety | INS1ML26G13 | |
| 30G 1/2" | BD Microlance | 304000 | Needle for Insulin disposible Syringe |
| Scalpel Handle | F.S.T. | 91003-12 | |
| #22 Disposable Scalpel blads | F.S.T. | 10022-00 | |
| Fine Iris scissors 10.5 cm | F.S.T. | 14094-11 | |
| Dumont Forceps #5745 45° 0.10 x 0.06 mm | F.S.T. | 11251-35 | |
| Graefe Forceps 10 cm | F.S.T. | 11051-10 | |
| Dumont Forceps #5 0.1 X 0.06 mm | F.S.T. | 11251-20 | |
| Medical patch | Medicalis | 34788 | |
| Sterile disposable towel drape | Dispotech | TVO50VE | |
| Stereoscopic Microscope | NIKON | SMZ 745 T | |
| Optic Illuminator LED light (C-FLED2) | NIKON | 1003167 | Optic Illuminator for Stereoscopic Micrscope |
| Eclipse Ni-U Microscope | Nikon | 932162 | Epifluorescence Microscope |
| Microscope digital Camera | Nikon | DS-Ri2 | Microscope camera |
| Intenslight | Nikon | C-HGFI | Microscope lamp |
| NIS-Elements 64 bit | Nikon | AR 4.40.00 | Analysis Software |
| Electric Razor | Gemei | GM-3007 |
Referências
- Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier. Handb Clin Neurol. 133, 39-59 (2016).
- Serlin, Y., Shelef, I., Knyazer, B., Friedman, A. Anatomy and physiology of the blood-brain barrier. Semin Cell Dev Biol. 38, 2-6 (2015).
- Moretti, R., et al. Blood-brain barrier dysfunction in disorders of the developing brain. Front Neurosci. 9, 40 (2015).
- Zhao, Z., Nelson, A. R., Betsholtz, C., Zlokovic, B. V. Establishment and Dysfunction of the Blood-Brain Barrier. Cell. 163 (5), 1064-1078 (2015).
- Drouin-Ouellet, J., et al. Cerebrovascular and blood-brain barrier impairments in Huntington’s disease: Potential implications for its pathophysiology. Ann Neurol. 78 (2), 160-177 (2015).
- Di Pardo, A., et al. Impairment of blood-brain barrier is an early event in R6/2 mouse model of Huntington Disease. Sci Rep. 7, 41316 (2017).
- Lecler, A., Fournier, L., Diard-Detoeuf, C., Balvay, D. Blood-Brain Barrier Leakage in Early Alzheimer Disease. Radiology. 282 (3), 923-925 (2017).
- van de Haar, H. J., et al. Blood-Brain Barrier Leakage in Patients with Early Alzheimer Disease. Radiology. 282 (2), 615 (2017).
- Fernandez-Lopez, D., et al. Blood-brain barrier permeability is increased after acute adult stroke but not neonatal stroke in the rat. J Neurosci. 32 (28), 9588-9600 (2012).
- Yang, Y., Rosenberg, G. A. Blood-brain barrier breakdown in acute and chronic cerebrovascular disease. Stroke. 42 (11), 3323-3328 (2011).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J Vis Exp. (6), e239 (2007).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Transplantation of pancreatic islets into the kidney capsule of diabetic mice. J Vis Exp. (9), e404 (2007).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- McCloy, R. A., et al. Partial inhibition of Cdk1 in G 2 phase overrides the SAC and decouples mitotic events. Cell Cycle. 13 (9), 1400-1412 (2014).
- Burgess, A., et al. Loss of human Greatwall results in G2 arrest and multiple mitotic defects due to deregulation of the cyclin B-Cdc2/PP2A balance. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (28), 12564-12569 (2010).
- Krueger, M., Hartig, W., Reichenbach, A., Bechmann, I., Michalski, D. Blood-brain barrier breakdown after embolic stroke in rats occurs without ultrastructural evidence for disrupting tight junctions. PLoS One. 8 (2), e56419 (2013).
- Hirano, A., Kawanami, T., Llena, J. F. Electron microscopy of the blood-brain barrier in disease. Microsc Res Tech. 27 (6), 543-556 (1994).
