Detta protokoll är att återhämta sig och förbereda sällsynta målceller från en blandning med icke-målorganismer bakgrund celler för molekylär genetisk karakterisering på enskild cell nivå. DNA kvalitet är lika med icke-behandlade enstaka celler och möjliggör encelliga ansökan (båda screening baserat och riktad analys).
Sällsynt målceller kan isoleras från en hög bakgrund av icke-målarter celler med antikroppar som är specifika för ytbehandlaproteinerna av målceller. En nyligen utvecklad metod använder en medicinsk tråd functionalized med anti epitelial cell adhesion molekyl (EpCAM) antikroppar i vivo isolering av cirkulerande tumör celler (CTCs)1. En patient-matchat kohort i icke-metastaserande prostatacancer visade att isolering i vivo tekniken resulterade i en högre procentandel av patienter som är positiva för CTCs samt högre CTC räknas jämfört med nuvarande guldmyntfoten i CTC uppräkning. Som cellerna inte kan återställas från nuvarande medicinska enheter, tillverkades en ny functionalized tråd (kallas enhet) så att fånga och efterföljande avlossning cellintervall genom enzymatisk behandling. Celler tillåts att ansluta till enheten, visualiseras på ett mikroskop och fristående med enzymatisk behandling. Återvunna celler cytocentrifuged på membran-belagd diabilder och skördas individuellt med hjälp av laser lokalt eller mikromanipulation. Enskild cell prover utsätts sedan för encelliga hela genomet förstärkning så att flera efterföljande analys inklusive screening och target-specifika strategier. Förfarandet för isolering och återhämtning ger hög kvalitet DNA från enstaka celler och försämra inte efterföljande hela genomet amplifiering (WGA). En enda cell amplifierade DNA kan vidarebefordras till screening och/eller riktad analys såsom array jämförande genomet hybridisering (array-CGH) eller sekvensering. Enheten tillåter ex vivo isolering från konstgjorda ovanlig cellprover (dvs. 500 målceller spetsade in 5 mL av perifert blod). Medan avlossning av celler är acceptabel (50-90%), återvinningsgraden av fristående celler på diabilder spänner över ett brett sortiment som är beroende av den cellinje som används ( 50%) och behöver några ytterligare uppmärksamhet. Denna enhet rensas inte för användning till patienter.
Nyligen lades CellCollector DC01, en medicinsk tråd functionalized med anti-EpCAM antikroppar för att isolera CTCs från perifert blod av cancerpatienter, till metodiskt spectrumen av CTC uppräkning1,2,3 . I en pågående studie med icke-metastaserande prostatacancer, denna functionalized tråd rapporterar nästan dubbelt så många patienter att vara CTC-positiv och högre CTC räknar i CTC-positiva patienter jämfört med CellSearch, guldmyntfoten i CTC uppräkning3 . På grund av detta uppmuntrande resultat, isolering av celler från en functionalized medicinsk tråd för encelliga analys vore önskvärt, men varken enzymatisk behandling med cell avlossning lösningar (t.ex. trypsin) eller laser lokalt tillåter återvinning av intakta celler (inga data anges).
För att möjliggöra avskildheten av fångade celler, var en ny generation av functionalized ledningar utrustad med en specifik polymer. Denna polymer, som länkar de fånga antikropparna till tråd, är mottagliga för en release buffert behandling möjliggör avlossning av intakta celler (CellCollector DC03 kallas enhet). Den nya functionalized enheten, kan isolering av målceller från olika koncentrationer av cancerceller cell linje spetsade in bovint serumalbumin (BSA) / fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och perifert blod, respektive.
För att lindra visuell upptäckt av celler på enheten och efter återhämtning, mål cancercellerna är märkta med carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) och en DNA fläcken innan den återhämtar sig behandlingen (dvs. laddning och ta loss). Behandlingens effekter på DNA kvaliteten på enstaka celler har tidigare utvärderats efter WGA med hjälp av en kvalitetskontroll PCR-4,5, array-CGH6,7 och riktade sekvensering7 visar ingen skillnad jämfört med icke-behandlade celler micromanipulated från cell suspensioner7. Fördelen med denna metod ligger i kombinationen av sällsynta målcellen före berikning och återvinning av celler för encelliga nedströms analys (figur 1). Den aktuella CE-märkt i vivo samling enheten används i allmänhet för uppräkning av CTCs istället för encelliga molekylär karakterisering2,8. Dock mer omfattande analys för att undersöka heterogenitet bland CTCs länge för analys på enskild cellnivå (dvs. riktade sekvensering på enskild cell nivå). Andra cellbaserade metoder baseras på immunmagnetisk isolering av EpCAM-positiva CTCs och encelliga hantering utifrån dielectrophoresis för efterföljande molekylära genetiska analyser9,10. Molekylär karakterisering av CTCs är en viktig förutsättning för deras användbara genomförande i en klinisk miljö och är lika viktigt i grundforskning i metastaserande kaskad. Parallellt till CTCs har cirkulerande tumör DNA (ctDNA) blivit av stor betydelse eftersom det tillåter DNA-analys av tumören bördan med minimal teknisk isolering förfaranden11,12. De cellbaserade metoderna kan fungera som ett kompletterande bidrag eftersom det ger RNA13,14 och protein15 uttryck analys och även för CTC härleds cell kulturer eller xenograft16, 17. även om hinder såsom lågt återhämtning och clearance för användning hos patienter fortfarande behöver övervinnas, fånga och släpp metoden tar ett viktigt nästa steg mot karakterisering av sällsynta målceller.
Protokollet beskrivs syftar till att hämta celler från en functionalized tråd (kallas enhet) för ex vivo encelliga genomisk analys. Vi testade tre EpCAM-positiva cellinjer (HT-29 LNCaP och VCaP), men i princip denna metod kan tillämpas på någon cellinje som uttrycker EpCAM. EpCAM-positiva målceller kan presenteras för enheten som ren cellsuspension (se 2.1.) eller blandad till ett överskott av bakgrunden celler (t.ex. perifera blod, se 2.2.). Särskilt den senare kan användas för att testa isolering kapacitet ovanlig cell villkor, fininställning av antalet celler som bifogas tråd kan göras med den beskrivna låg volymen närma (se 2.3.). Som skillnader mellan cellinjer kan förväntas, hastighet passande cell densiteter för laddning tråd, rotation samt inkubationstiden behöver testas empiriskt genom att utvärdera antalet bifogade celler använder ett immunofluorescens Mikroskop.
För genomisk nedströms tillämpningar på enskild cell nivå WGA, krävs. Metoden WGA val kan variera mellan labs, och vår metod är i princip öppet för alla metoder än kan hantera produktproverna mikromanipulation eller laser lokalt. I detta protokoll använder vi en metod baserad på enzymatiskt fragmenterade DNA på grund av en bättre prestanda jämfört med en värme-fragmentering baserat WGA7. Tillval, enstaka celler kan vidarebefordras till isotermiska WGA så att efterföljande DNA profilering20,21.
Protokollet beskrivs syftar till att återvinna intakta celler efter att vara ansluten till en ny generation av functionalized ledningar för genomanalys encelliga. Den första generationen av functionalized trådar, som också företräder endast CE-godkända i vivo anrikning enheterna på marknaden hittills, användes för att räkna upp CTCs hos patienter med spridd cancer. Tidigare publikationer och våra egna uppgifter tyder på i vivo isolering tekniken för att vara känsligare jämfört med den nuvarande guldmyntfot teknik2. Således, utrusta denna i vivo isolering teknik med en recovery-funktionen som realiserat i enheten tillåter att kombinera hög CTC återhämtning med karakterisering på enskild cell nivå.
Men enheten rensas inte för användning hos patienter, således kliniska data är inte tillgängliga. Ex vivo applikationer (dvs. isolera CTCs från perifert blod efter provtagningen) rekommenderas inte eftersom tekniken är anpassad till inställningarna som är närvarande i kubiska förgäves, e.g. låg diametern av den fåfänga (ökar sannolikheten för direkt kontakt mellan CTCs och fästande antikroppar) och lång retentionstid (30 min, så att 2-3 L blod att passera tråd). Emellertid, som beskrivs i avsnitt 2.2. målceller kan också isoleras från blandade prover7.
Nuvarande begränsning för metoden är ineffektiva återvinning av ofixerade celler efter avskildhet från ledningarna. Detta kan dock förbättras genom en cell fixering steg före avlossning behandlingen.
Sammanfattningsvis är detta protokoll ett första steg mot den kombinerade användningen av en in-vivo isolering teknik med cell återhämtning för genetiskt kännetecknar enstaka celler. Ytterligare ansträngningar måste ta itu med optimering av cell återhämtning och clearance för dess tillämpning i patienter1,2. Personlig medicin för behandlingsbeslut övervakning och behandling är dock utöver uppräkning av CTCs. Denna metod är således ett första steg mot genomisk CTC karakterisering på enstaka cellnivå.
Program mot encelliga transkriptom analys verkar genomförbart intakta celler skördas. Det återstår emellertid prövas huruvida förfarandet återhämta inverkar på RNA integritet (t.ex. vidarebefordra återvunna enstaka celler till direkt Lys följt av RT-qPCR22). Om det lyckas, kan karakterisering av enstaka celler (t.ex. CTCs) skiftas till transkriptom nivå, så att mer detaljerade analyser. I detta avseende, RNA-seq använder Smart-seq2 ger ett värdefullt verktyg för RNA nedströms analys av enstaka celler som den förförstärkt cDNA (erhålls under RNA-seq bibliotek beredning) kan bli föremål för kvantitativa PCR. Detta gör att en kombinerad mål och screening-baserad analys av återvunna enkelceller22,23.
De nuvarande functionalized kablarna bygger på anti-EpCAM antikroppar som är en allmänt använd epitelial markör för positiva urval av CTCs24. Som flera CTCs kanske downregulate epiteliala markörer såsom typen eller EpCAM25, skulle lägga till antikroppar såsom HER2/nya öka chansen att CTC isolering. Flera antikropp baserat anrikning strategier har utvecklats och granskats av Ferreira et al. i 201626. En blandning av antikroppar orörlig på en tråd kan vara en framtida förbättring av den teknik som leder till isolering av ett högre nummer och ytterligare subtyper av CTCs.
Det är obligatoriskt för alla åtgärder som rör tråd hantering för att hålla den funktionella delen av tråden nedsänkt i lösningen för att bibehålla dess funktionalitet. Vi rekommenderar för att placera tråden i 1 x PBS under utvärderingen (Mikroskop; t.ex. steg 3.1. -3.3.) och lagring. För att undvika olämpliga färgning, rekommenderar vi att använda färska förberedda färglösningen i steg 1.2.1. och 1.2.2. Svagt färgade celler hämmar cellen räknar på tråd och kan leda till en underskattning av de bifoga cellerna.
Det är nödvändigt att undvika att ansluta den Pasteur-pipetten med gummi locket när du sätter i kabeln i den Pasteur-pipetten för efterföljande lastning av cellsuspensionen (steg 2.3.4.). Gummi locket används för att hålla vajern på plats så att den funktionella delen ligger innanför spetsen av den Pasteur-pipetten. Om den gemensamma jordbrukspolitiken är alltför ordentligt kopplad till baksidan av Pasteur pipetten, är lastning av cellsuspensionen inte möjligt. I detta fall lindra den gemensamma jordbrukspolitiken så att luften som är fördrivna av inlästa cellsuspensionen kan lämna pipetten.
Böja tråd är avgörande för dess orientering under cellen räknar steg 3,2. och 3.3. Montera kablarna med tejpen så att den icke-funktionella änden kommer att ligga på ena sidan. Efter skanning av hela längden av den funktionella delen, rullas kabeln 180° så den andra halvan av funktionella tråd kan skannas. Detta steg är viktigt för inledande experiment att bedöma antalet celler på linan. När antalet celler för en viss cell fodrar och procedur utvärderas, proceduren kan upprepas utan att cellen räkna (t.ex. endast kontroll förekomst av celler eller utelämna detta steg). Försiktig pipettering är avgörande att undvika cellförlust när minska volymen av supernatanten i steg 4,8. Kontrollera att pipettering görs smidigt utan att orsaka turbulensen på pelleten.
The authors have nothing to disclose.
Denna studie har finansierats av österrikiska Science fond (FWF), projekt-nr. Jag 1220-B19 (att P.S.) som en del av projektet ERANET i translationell Cancer Research (TRANSCAN) ”cirkulerande tumörceller som biomarkör för Minimal Residual sjukdom i prostatacancer (CTC-SCAN)”. Doktorand S.C. var utbildad inom ramen för den PhD Program molekylärmedicin vid medicinska universitetet i Graz. Författarna erkänner tacksamt Nina Schlögl, Daniel Kummer, Gabi Wendt, Claudia Chudak, Julia Schulz och Johanna Schiller för deras teknisk experthjälp. Författarna tackar Georg Peinhaupt för grafisk design stöd.
Gilupi Release Buffer | Gilupi | GIL083 | Used to detach cells from the wire |
McCoy's 5A Medium (1x) suppl. with L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 16600-082 | Culture medium used for HT-29 cells, adapt culture medium to cell line used for the experiments |
HEPES Buffer Solution (1 M) | PAA | S11-001 | Supplement for McCoy's 5A Medium |
Foetal Bovine Serum Gold | PAA | A15-151 | Supplement for McCoy's 5a Modified Medium |
Penicillin-Streptomycin (100x) | Biowest | L0018-100 | Supplement for McCoy's 5a Modified Medium |
Phosphate Buffered Saline (1x PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-015 | |
Accutase | Biowest | L0950-100 | Cell detachment solution (cell culture) |
Water bath | GFL | Type 1003 | Used for prewarming solutions |
Incubator | Thermo Fisher Scientific | Used to incubate cells (cell culture) | |
50 mL reaction tubes | VWR | 525-0403 | |
Roller mixer | Stuart Scientific | SRT6D | Used to attach cells to the wire while keeping the cells from sedimenting |
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Thermo Fisher Scientific | C34554 | Used to label living cells (cytoplasmic label) |
Hoechst 33342 | H3570 | Thermo Fisher Scientific | Used to stain DNA (nucleic counterstain) |
Centrifuge (equipped for holding 15 mL and 50 mL reaction tubes) | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Megafuge 40R | Used for pelleting cells |
Observer Z1 (Fluorescence/laser microdissection microscope) | Carl Zeiss Microimaging | Inverted (immunofluorescence) microscope capable of laser microdissection; Fluorescence microscopes must be able to detect Hoechst 33342 (DAPI filter) and CFSE (FITC filter) | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503-50G | Used for coating glass/plastic surfaces |
MS1 Minishaker | Sigma-Aldrich | Z404039 | Used for vortexing |
Vacutainer EDTA (or Na-heparin) tubes | BD | 366450 (or 366480) | Used as reaction tube for ex vivo capture of target cells |
Detektor CANCER03 DC03 | Gilupi | GIL003 | Functionalized wire capable of isolating and detaching EpCAM-positive cells (also referred to as catch&release, C&R) |
Syringe needles (G20) | VWR | 613-0554 | Used to puncture rubber caps in order to allow the non-functional part of the C&R to lead through it |
Neubauer chamber | Roth | T729.1 | Used to count cells |
Pasteur pipettes 150 mm | Volac | D810 | Used for the low-volume application of cells to the C&R |
Grease pen | Dako | S2002 | Used on glass slides to hold cell suspension in place |
Steril syringe filter (0.2 µm) | Corning | 431219 | For filtering freshly prepared Gilupi Release Buffer |
Delfia PlateShaker | Perkin Elmer | 1296-003 | Used for agitation during cell detachment |
1.5 mL tubes | Eppendorf | 30,125,150 | |
Ampli1 WGA Kit | Silicon Biosystems | To be ordered via Silicon Biosystems | |
Axiovert M200 equipped with Mikromanipulator MMJ and CellTram vario | Zeiss/Eppendorf | Use micromanipulation at hand | |
Microcapillaries (25 µm in diameter), CustomTip Type I | Eppendorf | 930001201 | Used for micromanipulating cells |
0.2 mL PCR tubes | Biozym | 710920 | |
Cytocentrifuge and equippment | Hettich | Universal 32 | Use cytocentrifuge at hand |
Thermo cycler | Bio-Rad | DNA Engine Dyad | Every thermo cycler with heated lid can be used |
Microcentrifuge | Roth | CX73.1 | Use desk-top centrifuge at hand |
MembraneSlide 1.0 PET | Zeiss | 415101-4401-050 | Membrane-coated glass slides used for laser microdissection |
UV Stratalinker 1800 | Stratagene | 400072 | Use DNA cross linker at hand |
Standard PCR reagents | |||
6x DNA Loading | Thermo Fisher Scientific | R0611 | Use gel loading dye at hand |
DNA ladder | BioLabs | N0551G | Use 100 bp ladder at hand |
Agarose | Biozym | 840004 | |
Gel electorphoresis station | Bio-Rad | Use electrophoresis system at hand | |
Gel Red Nucleic Acid Stain | Biotium | 41003 | Intercalating dye for DNA visualization In agarose gels |